气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率

摘要

本发明涉及土壤氮素循环，具体地说是气相色谱－质谱联用测定土壤水解氨基酸手性异构体同位素富集速率的方法，1)选取同位素丰度为50％－100％的碳、氮化合物进行稳定同位素添加样品培养实验；2)将土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸，将提取液蒸干后，干燥的样品利用五氟丙酸酐-异丙醇酯法衍生；3)衍生物利用气相色谱分离、质谱测定获取每一种氨基酸手性异构体的质谱峰面积及其同位素峰面积；4)无论是无机

说明书

技术领域

本发明涉及土壤氮素循环研究，具体地说是气相色谱-质谱联用测定土壤水解氨基酸手性异构体同位素富集速率的方法。

背景技术

土壤氨基酸数量最早利用土壤有机氮形态分析中酸水解-蒸馏法方法测定(鲁如坤，土壤农业化学分析方法，pp152-156，中国农业科技出版社，1999)，但仅能计算氨基酸总量；采用气相色谱法可使15种氨基酸手性异构体有效分离并逐一定量，但其数量特征是静态的，体现的是多种因素综合后的氨基酸的积累，无法反映氨基酸手性异构体的动态变化(W.Amelung，X.Zhang.2001.Determination of amino acid enantiomers in soils.Soil Biology&Biochemistry 33：553-562)。气相色谱-燃烧-同位素比例质谱可区分氨基酸手性异构体的天然同位素丰度变化，但同位素区分程度较小且无法调控，不适用于土壤养分的循环转化研究，而且测定成本很高，容易对仪器产生同位素污染，同时在样品处理过程引起的同位素歧视比例偏差无法克服定量校正(Amelung，W.Brodowski，S.2002.In vitro quantification ofhydrolysis-induced racemization of amino acid enantiomers in environmentalsamples using deuterium labeling and electron-impact ionization massspectrometry.Analytical Chemistry 74，3239-3246)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素比例的方法，其可有效区分土壤中原有氨基酸和利用活性底物新合成的部分，同时可计算氨基酸的合成速率。由于底物为高丰度碳或氮同位素，新合成的氨基酸同位素丰度相对较高，可利用通常的气相色谱-质谱法进行定量分析，土壤中氨基酸手性异构体质谱峰及同位素峰的相对比例变化，计算各种氨基酸手性异构体的同位素碳、氮的富集速率。和目前应用的同位素比例质谱仪测定相比，使用方便，测定成本低，重现性好。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

气质联机测定土壤氨基酸手性异构体同位素富集速率，

1)选取丰度为50％-100％的碳、氮同位素进行稳定同位素添加样品培养实验，将¹⁵-氮素+葡萄糖混合物和氮素+U-¹³C-葡萄糖混合物加入土壤样品中进行实验，氮素形态可为NH₄⁺或NO₃^-，加入量为0.05-2mg N/g土；葡萄糖加入量为0.5-5mg C/g土；以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；

2)将土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸，将提取液蒸干后，所得干燥利用五氟丙酸酐-异丙醇酯法衍生；

3)衍生物利用气相色谱分离、质谱测定获取每一种氨基酸手性异构体的质谱峰面积及其同位素峰面积；

4)无论是无机¹⁵N还是葡萄糖¹³C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用原子百分超(APE)来表示：

APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100(1)

对于¹⁵N来说，Re＝A_(F+b)/A_F，其中A_(F+b)为同位素峰面积，A_F为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；b为待测氨基酸所含有的氨基数目，b＝1-3；采用APE和培养时间的比值即可表示NH₄⁺或NO₃^-合成氨基酸氮的速率；

对于¹³C来说，Re＝A_(F+n)/AF，其中A_(F+b)为同位素峰面积，A_F为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，n＝2-9；采用APE和培养时间的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；

Rc则为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；

若待测氨基酸有多个碎片峰，将各碎片同位素比例进行加权平均计算后即未末氨基酸同位素比例。

土壤样品的培养，称取8-12克粒径为1-2mm风干土于塑料瓶中，加入P含量为8-20mg的KH₂PO₄和适量蒸馏水，使土壤湿度为风干土重的20-25％；覆盖保水透气膜，于室温下预培养7-14天，预培养结束后设置以下三个处理：部分样品每周加入¹⁵-氮素(N)+葡萄糖混合物，另一部分样品每周加入氮素+U-¹³C-葡萄糖混合物，以加入氮素+葡萄糖混合物的土壤样品做对比；培养2-14周，每周加入底物的同时，利用称重法补水，保持土壤水分恒定，将所取样品风干，磨细过0.25mm筛待测。

所述土壤样品分别利用过量的HCl水解，水解液采用阳离子交换树脂分离获取土壤中的水解氨基酸过程为，

1)准确称取0.5g土壤样品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋紧瓶盖，于105℃下水解12小时；水解结束并冷却至室温后，向水解物中加入200μl的80μg/ml正缬氨酸为内标；

2)将水解物利用定量滤纸过滤，滤渣弃去，滤液在旋转蒸发仪上蒸发至干，操作温度35-45℃；将蒸发瓶中残渣溶于4ml 0.05mol/l HCl中，将溶液转移至阳离子交换树脂纯化柱中进行纯化；

纯化过程如下：将溶液转移至样品纯化柱后，加入4ml 0.01mol/l HCl润洗旋转蒸发瓶，润洗液一并转移至纯化柱中；树脂用0.1mol/l草酸淋洗以除去土壤中金属离子；然后，向树脂柱中先后加入5ml 0.01mol/l HCl和5ml去离子水，并将淋洗液弃去；利用25ml 2.5mol/l NH₃·H₂O洗脱氨基酸，将各次洗脱液用干净的旋转蒸发瓶接收，然后利用旋转蒸发仪于30-45℃下蒸发至干，干燥后样品进行下一步处理。

所述气相色谱条件为，手性毛细管柱载气为高纯氮气，柱流速+补偿气流速＝25ml/min，进样口温度为200℃，分流比为40∶1；升温程序如下：初温80℃，保持4分钟，然后以40℃/min升至110℃，保持1分钟；以1℃/min升至118℃，保持3分钟；以7℃/min升至160℃，保持2.5分钟；以10℃/min升至200℃，保持20分钟，一次测定时间为40分钟；

所述质谱条件为，气相色谱质谱接口温度为250℃，高纯氦气为载气，化学电离源温度为180℃，电子能量为70ev；甲烷为反应气，流速为1.5ml/min；信号采集设为全扫描模式，质荷比范围50-500。

本发明具有如下优点：

本发明培养过程易于调控，可随时取样并测定土壤氨基酸手性异构体的动态转变化情况；培养过程中同位素丰度的变化易于测定，没有同位素歧视效应，计算方法简便；能够跟踪了解同位素碳、氮在氨基酸手性异异构体的分子中的分布，从而有效地研究土壤氨基酸手性异构体的动态变化，是土壤氮素循环研究中一种非常重要的方法。

附图说明

图1为利用N+葡萄糖的对照培养土壤样品中的丙氨酸质谱图；

图2利用¹⁵N+葡萄糖培养土壤样品中的丙氨酸质谱图；

图3利用N+¹³C葡萄糖培养土壤样品中的丙氨酸质谱图。

具体实施方式

实施例1

1.稳定同位素添加土壤样品培养

称取8克风干土(＜2mm)于塑料瓶中，加入KH₂PO₄(P含量为8mg)和适量蒸馏水，使土壤湿度为风干土重的20％。覆盖保水透气膜，于室温下(25℃)预培养一周。预培养结束后设置以下两个处理：部分样品每周加入¹⁵N标记氮素+葡萄糖混合物，另一部分样品每周加入氮素+U-¹³C-葡萄糖混合物。氮素形态可为NH₄⁺或NO₃^-，加入量为0.1mg N/g土；葡萄糖加入量为1mg C/g土。每周加入底物的同时，利用称重法补水，保持土壤水分基本恒定。培养过程中保持温度恒定。定期取样。将所取样品风干，均匀取出部分样品(四分法)磨细过0.25mm筛待测。

2.土壤样品前处理

2.1土壤样品水解和纯化

准确称取0.5g土壤样品至水解瓶中，加入10ml 6mol/lHCl后旋紧瓶盖，于105℃下水解12小时。水解结束并冷却至室温后，向水解物中加入200μl浓度为80μg/ml的正缬氨酸为内标。

将水解物利用定量滤纸过滤，滤渣弃去，滤液在旋转蒸发仪上蒸发至干，操作温度35-45℃。将蒸发瓶中残渣溶于4ml 0.05mol/l HCl中，将溶液转移至聚丙烯样品纯化柱中进行纯化。该柱容积为25ml(长30cm，内径1.2cm)，柱内填装3克Dowex 50W X8(100-200目)阳离子交换树脂，每次使用前先用25ml 2mol/l NaOH预淋洗，然后加入25ml 2mol/lHCl，最后用去离子水淋洗，直到淋洗液pH接近中性为止。

纯化过程如下：将溶液转移至样品纯化柱后，加入4ml 0.01mol/l HCl润洗旋转蒸发瓶，润洗液一并转移至纯化柱中。树脂用0.1mol/l草酸(用浓NH₃·H₂O调节pH至1.6-1.8)淋洗五次以除去土壤中铁、铝等金属离子，每次用量5ml。然后，向树脂柱中先后加入5ml 0.01mol/l HCl和5ml去离子水，并将淋洗液弃去。

利用25ml 2.5mol/l NH₃·H₂O洗脱氨基酸，每次用5ml，将各次洗脱液用干净的旋转蒸发瓶接收，然后利用旋转蒸发仪蒸发至干(30-45℃)，将干燥后样品进行下一步处理。

2.2样品衍生

将干燥后样品用2ml 0.1mol/l HCl溶解(溶液pH须小于2，否则用1mol/了HCl调节至所需范围)，并等体积润洗一次，内容物均转移至2ml聚丙烯离心管中。在4200x g条件下离心15分钟，将上清液倒入5ml反应瓶中，上口覆封口膜，于乙醇浴(-18℃)中冷冻3小时以上，然后进行8小时真空干燥。

向干燥后样品中加入400μl 4mol/l HCl-异丙醇溶液(将乙酰氯和异丙醇等以体积比1∶2.5在0℃甲醇浴中混合，实验前现用现配)，旋紧反应瓶瓶塞。瓶塞应带有聚四氟乙烯隔层，同时上面用金属板加固。样品溶液在110℃下加热30分钟，冷却至室温后，将上清液转移至1ml反应瓶中，用N₂将多余试剂吹干，即得到相应氨基酸异丙醇酯。然后向瓶中加入130μl二氯甲烷和130μl五氟丙酸酐，在110℃下加热10分钟。冷却至室温后，用N₂将多余试剂吹干，将干燥后的五氟丙酸氨基酸异丙醇酯溶于150μl二氯甲烷，震荡并平衡半小时后将上清液移至色谱内插管瓶中即可利用气相色谱测定。

以上土壤样品前处理条件引自参考文献：W.Amelung，X.Zhang.2001.Determination of amino acid enantiomers in soils.Soil Biology&Biochemistry33：553-562

3.土壤氨基酸手性异构体气相色谱-质谱测定

3.1气相色谱条件

手性毛细管柱：30m*0.25mm*0.12μm，载气为高纯氮气，柱流速+补偿气流速＝25ml/min，进样口温度为200℃，分流比为40∶1。升温程序如下：初温80℃，保持4分钟，然后以40℃/min升至110℃，保持1分钟；以1℃/min升至118℃，保持3分钟；以7℃/min升至160℃，保持2.5分钟；以10℃/min升至200℃，保持20分钟，一次测定时间为40分钟。

3.2质谱条件

气相色谱质谱接口温度为250℃，高纯氦气(He)为载气。化学电离源(CI)温度为180℃，电子能量为70ev；甲烷(CH₄)为反应气，流速为1.5ml/min；信号采集设为全扫描模式，质荷比范围50-500。

4.同位素富集比例评价与计算

4.1氨基酸手性异构体同位素富集评价方法

如图1-3所示，对于利用N+葡萄糖培养的对照样品来说，其质谱碎片主要表明¹²C、¹⁴N等所形成的离子结构特征，在主要碎片峰区域的小峰的相对丰度(小峰面积占母峰面积的比例)主要由¹³C、¹⁵N等的天然丰度和仪器自身背景值所决定，因而具有很好的稳定性，数值相对较小。

当土壤样品中加入的无机¹⁵N被同化利用合成氨基酸手性异构体后，新合成的氨基酸的氨基位含有¹⁵N，而土壤中原有的氨基酸氨基位则为¹⁴N(比例占99％以上)。由于中性和酸性氨基酸只含有一个氨基，对于碎片峰F来说，在相邻的位置上(F+1)的丰度就会有所增加；碱性氨基酸含有两个或两个以上的氨基，对于碎片峰F来说，(F+b)的丰度有所增加，b代表氨基酸所含有的氨基数目。因而同位素氮合成氨基酸氮的速率可以用(F+b)/F的相对丰度比例的变化来评价，b＝1-3。

当土壤样品中加入U-¹³C-葡萄糖+氮素时，新合成的氨基酸的碳骨架全部由¹³C组成。对于碎片峰F来说，(F+n)的丰度就会有所增加，n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，(F+n)与F丰度的比值变化用以评价利用葡萄糖合成氨基酸碳的速率，n＝2-9。

4.2氨基酸手性异构体同位素富集计算方法

无论是无机¹⁵N还是葡萄糖¹³C加入所引起的氨基酸手性异构体同位素相对丰度的变化均可用原子百分超(APE)来表示：

APE＝(Re-Rc)/[1+(Re-Rc)]*100(1)

对于¹⁵N富集比例的计算来说，Re＝A_(F+b)/AF，其中A_(F+b)为同位素峰面积，A_F为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；b为待测氨基酸所含有的氨基数目，b＝1-3；Rc为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；采用APE和培养时间的比值即可表示NH₄⁺或NO₃^-合成氨基酸氮的速率；

对于¹³C来说，Re＝A_(F+n)/AF，其中A_(F+n)为同位素峰面积，A_F为氨基酸手性异构体的质谱峰面积；n代表该氨基酸碎片峰所具有的骨架碳原子数，n＝2-9；Rc为在同一次测定中，对比土壤样品中相应的同位素比例值；采用APE和培养时间的比值即可表示葡萄糖合成氨基酸碳的速率；

若待测氨基酸有多个碎片峰，将各碎片同位素比例进行加权平均计算后即为氨基酸同位素比例。

采用上述方法将取自公主岭的黑土培养4周后，称取0.5克样品经水解、纯化、衍生后利用气相色谱-质谱测定。在针对L-丙氨酸(含有1个N原子和3个碳原子)的同位素富集速率进行计算时，步骤如下：

在对比土壤样品中，质荷比(m/z)为190(F)的碎片所对应的峰面积为9987，质谱峰191所对应的峰面积为1020，其他小峰因面积极小可当作零处理。则Rc(F+1)₁₉₀＝1020/9987＝0.10，其他则为零。同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积为19906，质谱峰237所对应的峰面积为2005，则Rc(F+1)₂₃₆＝2005/19906＝0.10。

对于已富集了¹⁵N的丙氨酸来说，质荷比为190(F)的碎片所对应的峰面积仍约为9987，但质谱峰191所对应的峰面积增加为3050，则Re(F+1)＝3050/9987＝0.31，根据公式(1)，则APE(¹⁵N)₁₉₀＝(0.31-0.10)/[1+(0.31-0.10)]*100＝17.36；同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积仍为19906，但同位素峰237面积增加至6105，根据公式(1)，可计算APE(¹⁵N)₂₃₆＝16.38；由于m/z 236丰度与m/z 190丰度比为19906/9987＝2，则可得APE(¹⁵N)＝17.36*1/3+16.38*2/3＝16.71。利用¹⁵N合成氨基酸氮的速率为＝16.71/4＝4.18原子百分超/周

对于已富集了¹³C的丙氨酸来说，质荷比为190(F)的碎片所对应的峰面积仍约为9987，由于该碎片含有2个骨架碳原子，m/z192所对应的峰面积增加到2680，则Re(F+2)＝2680/9987＝0.27，根据公式(1)，利用葡萄糖合成氨基酸碳的比例是：APE(¹³C)₁₉₀＝(0.27-0)/[1+(0.27-0)]*100＝21.16；同理，同理，m/z为236的碎片所对应的峰面积为19906，由于该碎片含有3个骨架碳原子，质谱峰239对应的峰面积为5275，则Re(F+3)＝5275/19906＝0.26，APE(¹³C)₂₃₆＝(0.26-0)/[1+(0.26-0)]*100＝20.94，加权平均后，APE(¹³C)＝21.16*1/3+20.94*2/3＝21.05。利用¹³C合成氨基酸碳的速率＝21.05/4＝5.26原子百分超/周。