一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法

摘要

一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法，包括：抽提外周血单个核细胞总RNA并逆转录成cDNA。设计T细胞受体β链可变区(TCRBV)24个家族的上游引物和共同下游引物，染料法(SYBRGreenI)实时荧光定量PCR扩增cDNA。熔解曲线分析PCR产物，PCR产物荧光强度变化的负一次导数(－dF/dT)与温度(Tm)间作图，得到BV24个家族峰形图，根据BV24个家族峰形图上单峰出现情况，从而判断克隆特异性T淋巴细胞在外周血中分布情况。本发明方法可用于检测感染性疾病、自身免疫病、肿瘤或移植排斥中克隆特异性T细胞出现情况，用于评价机体对疫苗的应答情况等。

说明书

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及分子免疫学和分子生物学，特别是一种检测方法，具体为一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法。

背景技术

T细胞受体(T cell receptor，TCR)是T淋巴细胞表面识别和结合抗原、参与特异性细胞免疫的重要分子。正常人外周血95％的T淋巴细胞的TCR由α、β两条多肽链通过二硫键构成的异源性二聚体。α链由胚系基因中AV、AJ、AC重排形成，AV末端和AJ前端及中间插入的核苷酸序列组成了TCRα链可变区互补决定区3(CDR3)，β链由胚系基因中的BV、BD、BJ、BC基因片段经重排而形成，其中由BV(β链可变区)基因片段末端、BD基因片段、BJ基因片段前端及V-D与D-J之间插入的核苷酸序列组成了TCR β链CDR3。不同T细胞克隆具有不同长度或不同序列的TCR BV CDR3基因组成，形成CDR3基因谱型的多样性，CDR3区的长度和序列决定其结构，从而决定TCR的特异性。一种CDR3序列代表一个T细胞克隆，和同一MHC肽复合物结合的大部分克隆T细胞，有着相同的BV片段和CDR3长度，测定特定BV CDR3序列出现的频率可以反映特定T细胞克隆扩增的程度，能很好地反映不同疾病状态下T淋巴细胞的功能状态。分析病毒(如HBV)感染后相关的TCR CDR3基因家族特异性克隆扩增情况和TCR BV CDR3基因组成，可考虑采用特异性TCR CDR3单克隆抗体活化感染患者自体T细胞，获得临床治疗数量的特异性CTL细胞从而用于感染性疾病(如HBV引起的肝炎)的潜在治疗；也可以分离特异性TCR基因转染到自体或同种异体外周血淋巴细胞来治疗病毒感染后的相应疾病。

分析TCR CDR3的方法有Southern blot、单链构象多态性(SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)，单克隆抗体检测等。随后发展了流式细胞仪检测细胞内细胞因子表达或ELISpot结合特异性抗原刺激后检测细胞因子的分泌，可间接反映T细胞的亚型和功能。随着四聚体技术(tetramer)的出现，用tetramer来检测抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)技术得到了很大的发展。但这些方法不能提供特异性T细胞的TCR分子特征和整个样本中T细胞的组成信息。

近年来，免疫扫描谱型分析技术(immunoscope spectratyping)在分析CDR3的表达频率和长度分布上得到较为广泛的应用。根据一定浓度变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)很高的分辨力来区分大小只相差Ibp核苷酸片段，然后经基因扫描(GeneScan)分析电泳结果。根据TCR CDR3基因表达情况，从而推测机体T细胞克隆性扩增状况。在国外，毛细管电泳技术已逐步在分析TCRBV上得以应用，如国外有人利用毛细管测序仪(ABI310)检测再生障碍性贫血(AA)特异性TCR BV CDR3基因谱型特点。近年来，实时荧光定量PCR与熔解曲线分析技术在检测TCR BV家族与鉴定T细胞克隆性增生上也逐步得以应用。

目前实时荧光定量(real time)PCR技术是公认的最敏感、最准确、重复性好的核酸分子定量检测方法，已广泛应用于基础研究及病原体的临床检测。实时荧光定量PCR技术的原理为在PCR反应体系中加入荧光基团(分子)，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。相对常规PCR，荧光定量PCR的主要优点是在动态范围内准确地确定初始模板的拷贝数量和高的灵敏度。另外，荧光定量PCR的结果无需通过琼脂糖凝胶电泳来评估，可节省实验时间，提高实验效率，减少实验样品污染的几率。

实时荧光定量PCR检测方法主要有2种：一种是使用杂交探针，即在PCR扩增加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’～3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团与淬灭荧光基团分离，荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。另一种是使用SYBR Green I染料，与杂交探针比较，SYBRGreen I不需要设计特定的序列，其检测原理是：SYBR Green I是一种结合于双链DNA小沟的染料，最大吸收波长约为497nm，最大发射波长约为520nm。SYBR Green I与双链DNA结合后，其荧光强度大大增强。在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子荧光信号极弱，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

因SYBR Green I与双链DNA结合没有特异性，容易产生非特异性荧光信号，我们把PCR产物进行熔解曲线分析来区分特异性与非特异性产物，以及引物二聚体。即在PCR反应结束后，把PCR产物从一定的开始温度按一定的温度变化速率(Ramp)升至95℃，扩增产物双链DNA随温度升高渐变性解链成单链，嵌到双链中的荧光染料SYBR green I释放出来，反应体系中荧光信号随之衰减，仪器自动检测反应管内荧光信号的变化，最后绘制出扩增产物荧光信号随温度变化的熔解曲线(melting cuve)。从而来区分特异性和非特异性扩增，因此SYBR GreenI用于实时定量检测更加方便，经济，而且在同一体系可以检测多个基因。另外，通过荧光信号强度变化的负一次导数(-dF/dT)与熔解温度(Tm)间作图，得到PCR产物的熔解曲线峰形图，我们称之为基因熔解谱型图(Gene melting sepctratyping，GMST)(因该图类似于以基因片段大小为基础经基因扫描得到的免疫扫描谱型图)。因为PCR产物的熔解温度与产物片段组成、大小，碱基成份等有关，因此根据基因熔解谱型图我们可以区分混合PCR产物中片段组成情况，若为单峰，则表示PCR产物中片段组成单一，若为多峰，则表示PCR产物由多个片段组成，从而得知特定基因的克隆性扩增情况，来反映机体T细胞功能状态。

另外，病毒性感染(如HBV)和TCR CDR3克隆性增生之间关系研究的应用，我们可以考虑以下几方面：(1)找到与某一病毒感染较为密切相关的特异性TCR CDR3亚家族，从机制方面探讨T淋巴细胞在疾病发生和发展中的变化；(2)分析病毒感染相关的TCR CDR3家族和机体感染后特异性免疫应答的强弱，考虑采用特异性的TCR CDR3单克隆抗体活化感染患者自体T细胞，获得临床治疗数量的特异性CTL细胞从而用于相应病毒感染所致疾病的潜在治疗；(3)若已知特异性TCR CDR3的基因组成，可用来转染(TCR基因)自体或异体外周血淋巴细胞来治疗相应疾病；(4)已知克隆特异性TCR分子组成，可有助用于CTL表位的鉴定和HBV治疗性多肽疫苗的设计。进行这方面的研究即可从理论上带动人们从更深层次认识T细胞及其特异性TCR在感染性疾病(病毒、细胞、寄生虫)中的作用，也有助于设计出用于相应疾病治疗的多肽疫苗。克隆特异性T细胞的检测方法也有助于明确T淋巴细胞在肿瘤、自身免疫病、移植排斥等发病及恶化中的作用，有利于这些疾病的诊断与治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法，为研究与TCR相关的感染性免疫、自身免疫性疾病、移植排斥、肿瘤(血液病)等提供一个很好的技术平台。

本发明的一种检测外周血克隆特异性T淋巴细胞的方法，包括如下步骤：

(1)制备抗凝的外周血待检样本；

(2)密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(PBMC)，试剂盒抽提PBMC中总RNA，并采用MBI公司逆转录试剂盒逆转录成cDNA；

(3)以T细胞受体(TCR)beta链可变区(BV)24个家族的26条引物之一分别为上游引物，其中BV5，BV13各2条引物；BC1、BC2区域设计共同下游引物BC，染料法(SYBR GreenI)实时荧光定量PCR扩增外周血上面步骤(2)制备的cDNA；

(4)熔解曲线分析cDNA的PCR产物，通过对PCR产物荧光强度变化负一次导数(-dF/dT)与温度(Tm)间作图，得到TCR BV 24家族各家族相应峰形图，统称为基因熔解谱型图(GMST)，对只出现单峰BV家族的PCR产物纯化后进行序列分析，或以相同的引物对PCR产物再次扩增，所得PCR产物纯化后再行序列分析；

(5)根据基因熔解谱型图上各BV家族峰形分布，若BV某一家族在GMST上只出现单峰，则表明该BV家族中的T淋巴细胞为特异性单克隆扩增，若BV各家族峰形图(GMST)上均无单峰出现，则说明外周血中不存在T淋巴细胞特异性扩增。

(6)根据外周血中T淋巴细胞TCR BV各家族在GMST上峰形图形状与分布，可以进一步区分T淋巴细胞单克隆、寡克隆或多克隆扩增情况。

步骤(2)所述总RNA提取试剂盒选用OMEGA公司产品；步骤(3)所述的实时荧光定量PCR扩增试剂选用大连宝生物公司(TAKARA)试剂盒。

步骤(4)所述熔解曲线分析的反应室温度从75℃以0.2℃/s温度变化速率开始缓慢升至95℃，即PCR产物的温度每升高0.2℃，同时521nm波长检测荧光值，保持时间为2s。

步骤(3)所述下游共同引物BC的基因序列如下：5’-TTC TGA TGG CTC AAA CAC-3’。

附图说明

图1：10例慢乙肝(CHB)患者外周血TCR BV 24家族cDNA PCR产物在基因熔解谱型上出现为单峰的BV家族。

图2：图1中1例CHB患者TCR CDR3转录物PCR产物在基因熔解谱型图上表现为单峰的BV13.1家族测序结果的部分片段及其氨基酸序列。注：TCR CDR3的氨基酸序列(带下划线)QTSVYFCASSYSGQGIDGYTFGSGTRLTVVE

具体实施方式

本发明的详细实施步骤如下：

(1)PBMC的准备：抽取健康献血者外周血5ml，以1.9％柠檬酸钠抗凝(1∶10)，轻摇1分钟后，室温静置1小时；将抗凝血用磷酸盐缓冲液(PBS)或RPMI-1640培养基原液以1∶1体积比混匀；将稀释血悬于5ml的淋巴细胞分层液(上海恒信试剂有限公司)的界面上，400g离心20分钟；用吸管将分离出的中间层(灰白色)细胞取出放入另一离心管，另入5倍体积的PBS，充分混匀后，1500rpm离心10分钟；弃上清，用PBS再洗一次。得到外周血单个核细胞(PBMC)用于提取total RNA，若不能马上提取，可于-75℃冰箱短期冻存。

(2)Total RNA的抽提：外周血单个核细胞(PBMC)total RNA的提取采用E.Z.N.A Total RNAKit系统(OMEGA公司)，提取过程严格按试剂说明书进行。最后吸附(bind)柱上的totalRNA用无Rnase水洗脱，提取的total RNA或立即逆转录成cDNA，或存于-78℃冰箱备用。RNA的质量与含量在Spectrophotometer(bio-rad)上测定OD260/OD280比值，取比值为1.7～2.0的RNA样品用于后续实验。

(3)cDNA合成：分别取约1μg总RNA为模板，用Olig(dT)为引物，cDNA反应体系为20μl，每标本做3个反应，按cDNA合成试剂盒(MBI公司产品)条件合成cDNA，步骤如下：每一0.2ml薄壁PCR反应管加入总RNA约1μg，加入oligo(dT)18 Primer(0.5μg/ml)1μl，加入DEPC水至12μl，轻轻混匀，70℃，5min，放置冰盒中；加入5×buffer 4μl，加入Inhibitor(20u/μl)1μl，加入10mM dNTP 2μl，轻轻混匀，37℃，5min；加入RvertAid^TM HMinus M-MuL V(200u/μl)1μl，总体积20μl，42℃，60min，70℃，10min，放置冰盒中。

(4)引物合成：根据文献报道和人TCR基因库，合成TCR BV基因24个家族上游引物26条(其中BV5、BV13各有二条引物)；共用下游引物BC一条，后者核苷酸序列如下：5’-TTCTGATGG CTC AAA CAC-3’。

(5)荧光定量PCR扩增BV各家族CDR3的cDNA：每20μl PCR反应体系中包含1μl cDNA样本(含相当于total RNA量10～50ng)和各0.3μmol/L的26条上游引物(BV1～24)之一、下游引物(BC)，加入2×SYBR Real time PCR Master Mix预混合液10μl，三蒸水补足20μl反应体系，PCR反应条件如下：94℃预变性3分钟，94℃20秒，退火温度设为56℃30秒，延伸温度72℃30秒，共45个循环。每个循环结束后，在80℃温度保持2秒钟后521nm波长读板(测定每孔荧光强度)，最后72℃延伸8分钟。

(6)实时荧光定量PCR产物的熔解曲线分析：在PCR反应程序结束后，反应室温度从75℃以0.2℃/s温度变化速率开始缓慢升至95℃，即PCR产物的温度每升高0.2℃，同时521nm波长检测荧光值，保持时间为2s。

(7)熔解曲线分析PCR产物：对PCR产物荧光强度变化负一次导数(-dF/dT)与温度(Tm)间作图，得到BV各家族的峰形图，统称为基因熔解谱型图(GMST)。根据BV各家族的基因熔解谱型图可以判断T淋巴细胞克隆性扩增情况，若某一家族只出现单峰，说明该BV家族的T淋巴细胞为单克隆扩增，若峰形图上有多个峰，且不多于4个峰，则表明为寡克隆扩增，若一个BV家族的峰形图为多峰(多于4个峰)，则表明该BV家族中多克隆T细胞存在。对只出现单峰(克隆性扩增)的BV家族的PCR产物纯化后进行序列测定，测序结果与DDBJ、GeneBank及IMGT库中标准TCR BV、BD、BJ、BC序列进行比对(BLAST)，确定特异性克隆扩增的T细胞TCR CDR3基因组成。

本发明的优点和应用前景

T细胞受体(TCR)beta链可变区(BV)CDR3基因谱型检测，以往的方法大都是通过半定量检测TCR CDR3某些谱系的PCR产物的明显增加而间接推断T细胞的克隆性增殖。

近年来，根据Vβ24个基因家族和Vα的32个家族的cDNA序列分别设计各家族的上游引物，从Cβ1和Cβ2区域设计一个Cβ共同下游引物，每个标本分别进行Vβ26个(BV5，BV13各有二个亚家族)、Vα32个PCR扩增，通过对扩增产物的基因扫描而判断T细胞克隆增殖，如出现单克隆或寡克隆产物，则进一步分离纯化，进行DNA序列分析，了解其CDR3的核苷酸序列组成情况等，从而可以知道TCR的基因组成，称为免疫扫描谱型分析技术。但此技术分析T淋巴细胞的TCR基因谱型特征(TCRα链和TCRβ链CDR3基因)时操作较为复杂，且容易交叉污染。应用染料法(SYBR Green I)实时荧光定量PCR技术和熔解曲线分析对外周血TCR BV CDR3基因mRNA的转录物cDNA进行扩增和熔解曲线分析来检测T细胞克隆性扩增。从而可以避免聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析DNA片段大小时的繁琐过程，也体现了染料法(SYBR Green I)荧光定量PCR技术操作简便、重复性高、交叉污染少且费用低等优点。此技术为研究与TCR相关的感染性免疫、自身免疫性疾病、移植排斥、肿瘤(血液病)等提供了一个很好的技术平台。熔解曲线分析技术能很方便地在这些T细胞相关疾病中找特异性克隆T细胞，从而有利于疾病的诊断，也大大缩短了操作时间。

研究机体外周血T细胞克隆性扩增情况，可以进一步了解T淋巴细胞在相应疾病发病机制中的作用，检测了TCR CDR3序列，有可能通过转基因(特异性TCR基因)来治疗相应疾病，也有助于发展基于TCR表位多肽的治疗性疫苗。

应用实例：慢乙肝患者外周血淋巴细胞T细胞受体BV CDR3的检测

本实施例以检测慢乙肝患者外周血特异性T细胞克隆性扩增情况

世界卫生组织(WHO)把乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)列为全球十大死亡原因之首，全世界HBV感染者估计超过4.0亿。其中至少有20％～30％的HBV表面抗原(HBsAg)携带者最终将死于慢性乙型病毒性肝炎(Chronic B Hepatitis，CHB)相关疾病(肝硬化、肝癌)。我国是HBV感染的高流行地区。根据2002年的全国HBV感染者血清流行病学调查，我国HBsAg流行率为9.09％，约1.2亿人，其中慢乙肝患者约为2000万～3000万。在慢性乙型肝炎5年的自然史中，约10％～20％慢乙肝可发展为肝硬化，20％～23％肝硬化可发展为失代偿性肝硬化，6％～15％慢乙肝可发展为肝细胞性肝癌(HCC)。在慢乙肝患者中，约25％～40％最终将死于肝硬化或肝癌，高于世界平均水平。全国每年用于乙型病毒性肝炎及其相关疾病治疗的费用数以亿计，消耗了大量的医疗资源，但很多病人还是死于肝衰竭，肝癌。虽然肝移植是治疗终末期肝病的很好手段，但由于肝源的极其缺乏，很多患者在等待中死去。因此在临床上发展新的方法来监测病情进展甚至治疗慢性乙型肝炎(CHB)很有现实意义。

HBV感染后，决定病程转归的一个主要因素是机体免疫应答能力，尤其是特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)的反应水平。HBV感染机体后，体内活化的特异性CTL通过杀伤靶细胞和分泌细胞因子的非溶细胞机制抑制病毒复制。如研究发现在急性HBV感染最终清除病毒个体中，其体内出现针对HBV的CTL反应是多克隆、多特异性的，但是在慢性感染的个体，特异性的CTL反应很弱、很难被检测到，机体对HBV发展为一种免疫耐受状态，使HBV感染持续存在而使病情慢性化。Ahmed R等指出抗病毒作用的T细胞免疫反应的强弱，很可能是决定HBV感染者的发病情况。其中，针对HBV各种抗原表位的特异性CTL作为主要的效应细胞，参与清除病毒和损伤细胞直接有关。有人对HBV慢性感染者与正常人外周血淋巴细胞功能状况间关系研究后表明，慢性HBV感染者外周血T细胞功能没有显著改变，只是T细胞表面受体(T cell receptor，TCR)发生变化，说明TCR在HBV慢性感染者病程中起着重要作用，因此检测克隆特异性T细胞和TCR BV CDR3的基因组成在研究慢乙肝患者的发病、恶化及其诊治上具有重要的意义。

1.慢乙肝患者的诊断与来源

慢乙肝(CHB)组10例，男性6例，女性4例，年龄21-50(41.3±7.6y)，均为我院2006年12月住院CHB患者，诊断符合2005年12月中华医学会肝病学分会和感染病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南》标准。所有患者除HBV感染外，其它已知病原体抗体检测均阴性，无肿瘤和免疫性疾病，且在近6个月内未使用免疫调节剂或抗病毒治疗。

2.外周血克隆性扩增T的检测

慢乙肝患者外周血PBMC分离、总RNA的抽提、cDNA合成、荧光定量PCR操作、基因熔解曲线分析同上面步骤。把在基因熔解谱型图(GMST)上只出现单峰的PCR产物纯化后进行序列测定。把测序结果与Genebank上的TCR基因进行比较，从而确定慢乙肝患者外周血T细胞克隆性扩增情况和T细胞TCR CDR3的基因组成。

慢乙肝患者的24个BV家族的基因熔解谱型图中出现单峰图的BV家族，见图1～2。单峰图表明BV家族的CDR3转录体PCR产物组成单一，说明此CDR3可能来自单一T细胞克隆，我们对此PCR产物进行测序，表明为单一克隆(只列出一个标本的测序结果)，进一步说明了结果的准确性。在本实施例中的10例慢乙肝患者外周血TCR BV 24家族的克隆性扩增情况中，我们发现有的患者几个家族表现为单克隆扩增，有几例患者出现相同BV家族的克隆性扩增，至于其中的原因还需进一步的研究。

序列表

下游共同引物BC的基因序列：5’-TTCTGATGGC TCAAACAC-3’

1例CHB患者克隆特异性BV 13.1家族TCR CDR3的氨基酸序列(带下划线)：QTSVYFCASS YSGQGIDGY TFGSGTRLTVV E