一种液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的方法

摘要

本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的方法。本发明以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺中，先进行摇瓶培养：以竹黄菌菌株为出发菌株，将试管斜面菌种接入装有液体培养基的摇瓶中，摇瓶装液系数为0.1～0.25，回旋培养，回旋培养的转速为150～250转/分钟，培养温度22～27℃；然后进行摇瓶扩大培养，将摇瓶培养所得培养物移入摇瓶扩大培养的培养基中培养，接种量2～10％，摇床转速为150～250转/分钟，培养温度22～27℃，培养时间72～120小时；最后进行发酵培养，将摇瓶扩大培养所得培养物转入装有发酵培养基的发酵罐内培养，接种量5～10％，培养温度22～27℃。发酵结束后得到竹黄发酵液，从所得发酵液中经分离纯化后分别获得竹红菌素和竹黄多糖。

说明书

技术领域

本发明涉及生物发酵领域，特别是涉及一种液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的方法。

背景技术

竹黄菌(Shiraia bambusicola Henn.)别名赤团子、竹赤团子、竹茧、竹赤斑菌、淡菊花、天竹花、淡竹花、竹花等，为肉座菌科(Hypocreaceae)真菌竹黄寄生于特定竹类上形成的子实体(也叫子座)。其性温味淡，具有止咳祛痛、舒筋活络、祛风利湿、补中益气、活血补血、散瘀通经之功效，主治中风，小儿惊风，胃气痛等。竹黄在民间用于治疗虚寒胃痛、风湿性关节炎、气管炎，百日咳、坐骨神经痛、跌打损伤、贫血头痛等症，是我国一种重要的中药资源。

研究表明竹黄菌中的主要活性成分为竹红菌素、竹黄多糖、甘露醇、麦角甾醇等。竹红菌素是目前已知的在可见光区内优良的光敏剂，具有显著的光疗作用，临床上已用来治疗皮肤病，如外阴白色病变和软化疤痕疙瘩。更具应用前景的是竹红菌素具有优良的光敏杀伤肿瘤细胞和抑制艾滋病病毒HIV-1的作用，并且可作为新型的光活化农药和潜在的光电转换材料，

竹黄多糖主要由L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖等单糖组成，可提高免疫，并对肝炎具有一定的疗效。

近几年，以竹黄菌为出发菌，发酵法生产竹红菌素已有研究报导，如：

文献：蔡宇杰，丁彦蕊，张大兵等.竹黄菌固态发酵竹红菌素条件的研究.生物技术，2004，14(4)：46-47报道了以固态发酵法利用竹黄菌生产竹红菌素的条件；

文献：石贵阳，张大兵，楼志华等。竹黄菌液体培养条件下生成竹红菌素的研究.药物生物技术，2004，11(5)：299～301报道了以液体发酵法利用竹黄菌生产竹红菌素的条件；

文献：陈佳佳，李兆兰，焦庆才。竹黄无性株的液态发酵工艺.中药材，2005，28(12)：1049-1051报道了利用竹黄菌液体发酵生产竹红菌素的培养基组成与发酵条件。

现有的研究都只涉及发酵法生产竹红菌素，由于竹红菌素和竹黄多糖分别为次级代谢产物和初级代谢产物，两者的发酵生产条件不一，需要加以综合考察同时优化竹红菌素和竹黄多糖的生产。竹红菌素和竹黄多糖都是具有良好应用前景的生物活性物质，以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖可同时获得这两种物质，但目前尚无有关以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的研究报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺，以获得竹红菌素和竹黄多糖这两种具有良好应用前景的活性物质。

本发明的液体发酵工艺包括以竹黄菌为出发菌株，经斜面菌种活化，进行液体摇瓶培养、液体摇瓶扩大培养基及发酵培养获得竹黄菌发酵液，从所得发酵液中经分离纯化后分别获得竹红菌素和竹黄多糖。

具体地，本发明以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺中，所采用的菌种竹黄菌(Shiraia bambusicola Henn.)为一种已知的菌种，采自浙江省永嘉县，其分离鉴定文献如魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，1979年出版，p238；刘天惠，《食用菌概论》，中国展望出版社，1987年出版，p26；张灏等，“竹红菌素产生菌的筛选与鉴定”，生物技术，2002，12(4)，p19-20，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心出具的保藏编号为：CGMCCNo.2201。

本发明以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺中，所述斜面菌种活化培养基为土豆培养基，该培养基在多种教科书和论文中均有表述，例如参见诸葛健、王正祥，《工业微生物实验技术手册》，北京，中国轻工业出版社，p367，本申请引用该文献作为参考。斜面菌种培养温度22～27℃，培养时间96～240小时。

本发明以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺中，先进行摇瓶培养：以保藏编号为CGMCC No.2201的竹黄菌(Shiraia bambusicola Henn.)菌株为出发菌株，将10～100mg干重/L的试管斜面菌种接入装有液体培养基的摇瓶中，摇瓶装液系数为0.1～0.25，回旋培养，回旋培养的转速为150～250转/分钟，培养温度22～27℃，培养时间72～120小时；然后进行摇瓶扩大培养，将摇瓶培养所得培养物移入摇瓶扩大培养的培养基中培养，接种量2～10％(体积百分数)，摇床转速为150～250转/分钟，培养温度22～27℃，培养时间72～120小时；最后进行发酵培养，将摇瓶扩大培养所得培养物转入装有发酵培养基的发酵罐内培养，接种量5～10％(体积百分数)，培养温度22～27℃，发酵罐压力0.05MPa，搅拌转速100～180转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间96～150小时。发酵结束后得到竹黄发酵液，从所得发酵液中经分离纯化后分别获得竹红菌素和竹黄多糖。

本发明以液体发酵法同时生产竹红菌素和竹黄多糖的工艺中，摇瓶培养基、摇瓶扩大培养基、种子罐种子培养及发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：碳源20～40，氮源2～4，K₂HPO₄ 0.75～2，KCl 0.5～1.0，MgSO₄ 0.5～1.0，FeSO₄ 0.1～0.5，pH 5.5～6.5。其中碳源包括葡萄糖、麦芽糖、蔗糖或土豆汁等；氮源包括酵母膏、蛋白胨、尿素或(NH₄)₂SO₄等。

更具体地，本发明的制备工艺通过以下步骤来实现：

(1)取出上述保藏的竹黄菌菌种接入新配制的斜面培养基中，培养温度22～27℃，培养时间96～240小时。其中所述的斜面培养基的组成成分为，每一升水中含下列成分(单位：克)：土豆200(煮汁)，葡萄糖20，琼脂20，pH5.5～6.5。

(2)将步骤1中的斜面菌种接入装有摇瓶培养基的摇瓶中，摇瓶培养基的组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：碳源20～40，氮源2～4，K₂HPO₄0.75～2，KCl 0.5～1.0，MgSO₄ 0.5～1.0，FeSO₄ 0.1～0.5，pH 5.5～6.5；摇瓶培养条件为：培养温度22～27℃，摇床转速150～250转/分钟，培养时间72～120小时。

(3)将步骤2中摇瓶回旋培养所得发酵培养物转入装有摇瓶扩大培养基的摇瓶中，摇瓶扩大培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：碳源20～40，氮源2～4，K₂HPO₄ 0.75～2，KCl 0.5～1.0，MgSO₄ 0.5～1.0，FeSO₄0.1～0.5，pH5.5～6.5；摇瓶扩大培养的培养条件为：接种量2～10％(体积百分数)，培养温度22～27℃，摇床转速150～250转/分钟，培养时间72～120小时。

(4)将步骤3中摇瓶扩大培养所得培养物转入装有发酵培养基的发酵罐内培养，发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：碳源20～40，氮源2～4，K₂HPO₄ 0.75～2，KCl 0.5～1.0，MgSO₄ 0.5～1.0，FeSO₄ 0.1～0.5，pH5.5～6.5；发酵培养的培养条件为：接种量5～10％(体积百分数)，发酵罐压0.05MPa，培养温度22～27℃，搅拌转速100～180转/分钟，通风量1：0.3～1v/v/m，培养时间96～150小时。

(5)将步骤4所得发酵培养物10000转/分钟离心30分钟，分离竹黄菌菌丝体和发酵清液。

(6)将步骤5中所得发酵清液减压浓缩至原体积的五分之一至十分之一，加入四倍量乙醇，4℃静置24小时，5000转/分钟离心20分钟收集沉淀，将沉淀物用水溶解，再经乙醇沉淀、冷冻干燥，即得竹黄多糖。将步骤5所得竹黄菌菌丝体经细胞破碎、有机溶剂(丙酮、氯仿或乙酸乙酯等)萃取、真空浓缩、再将浓缩液冷冻干燥获得竹红菌素。

通过本方法可以在竹黄菌液体发酵过程中以较高的产率同时获得竹红菌素和竹黄多糖。相对于目前采用液体发酵仅生产竹红菌素而言，本方法不增加额外的设备，实现竹红菌素和竹黄多糖这两种活性成分的同时生产，可大幅度提高生产过程的经济效益。竹红菌素和竹黄多糖都具有较高的药用价值，可广泛用于医药和保健等行业，因此，本发明是一种具有良好应用前景的竹红菌素和竹黄多糖生产方法。

具体实施方式

为了进一步阐述本发明所涉及的材料及实施工艺，给出了下述实施例，但是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

菌种采用竹黄菌(Shiraia bambusicola Henn.)，保藏编号为CGMCCNo.2201，采自浙江省永嘉县，其分离鉴定文献如魏景超，《真菌鉴定手册》，上海科学技术出版社，1979年出版，p238；刘天惠，《食用菌概论》，中国展望出版社，1987年出版，p26；张灏等，“竹红菌素产生菌的筛选与鉴定”，生物技术，2002，12(4)，p19～20。

1、摇瓶培养  将保藏的竹黄菌菌种接入新配制的斜面培养基中，培养温度25℃，斜面培养基配方为(单位为克/升)：葡萄糖25，土豆200，和琼脂20。待菌丝体长满斜面后，将5毫克竹黄菌菌丝体接入装有50mL摇瓶培养基的250mL三角瓶中(共5瓶)，置于25℃、180转/分钟恒温摇床培养96小时。其中所述摇瓶培养基配方为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，(NH₄)₂SO₄ 3，K₂HPO₄ 0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

2、摇瓶扩大培养  将上述摇瓶培养的菌种接入装有100mL扩大培养基的500mL三角瓶中(共20瓶)进行培养，接种量为每500mL三角瓶中接入10mL摇瓶种子，置于25℃、180转/分钟恒温摇床培养96小时。其中所述摇瓶扩大培养的培养基配方为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，(NH₄)₂SO₄3，K₂HPO₄ 0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

3、发酵培养  将上述摇瓶扩大培养的菌种2000mL接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中培养。维持发酵罐培养温度25℃，罐压0.05MPa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，培养时间120小时。其中所述的发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，酵母膏3，K₂HPO₄ 0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

发酵结束后，收获菌丝体和发酵液，按以下方法进行竹红菌素和竹黄多糖的含量分析：

以10000转/分钟进行离心分离获得菌丝体(干重)8.81克/升以及发酵液；

发酵液减压浓缩至原体积的四分之一，加入四倍体积的95％乙醇，4℃静置24小时，5000转/分钟离心20分钟收集沉淀，再经75％乙醇洗涤二次即得竹黄多糖。以蒸馏水溶解，采用硫酸-苯酚法测定多糖含量为354.52毫克/升；

菌丝体45℃干燥，取100毫克，加入6毫升95％乙醇提取两次，每次浸提时间12小时，合并浸提液，于465nm比色测定竹红菌素含量(参考文献：林海萍等《竹黄竹红菌甲素含量测定方法》[J]浙江林学院学报，2002.19(2)：157～160)，计算得含量为166.8毫克/升。

实施例2

本实施例的菌种及其摇瓶培养、摇瓶扩大培养的培养条件和培养基组成与实施例1相同。

发酵培养  将摇瓶扩大培养的菌种2000mL接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中培养。维持发酵罐培养温度25℃，罐压0.05MPa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，培养时间120小时。其中所述的发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，蛋白胨3，K₂HPO₄0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

发酵结束后，收获菌丝体和发酵液，进行竹红菌素和竹黄多糖的含量测定，测定方法同实施例1。结果，菌丝体干重为9.26克/升，竹黄多糖为283.17毫克/升，竹红菌素为192.5毫克/升。

实施例3

本实施例的菌种及其摇瓶培养、摇瓶扩大培养的培养条件和培养基组成与实施例1相同。

发酵培养  将摇瓶扩大培养的菌种2000mL接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中培养。维持发酵罐培养温度25℃，罐压0.05MPa，搅拌转速150转/分钟，通风量1：0.5v/v/m，培养时间120小时。其中所述的发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，(NH₄)₂SO₄ 3，K₂HPO₄0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

发酵结束后，收获菌丝体和发酵液，进行竹红菌素和竹黄多糖的含量测定，测定方法同实施例1。结果，菌丝体干重为7.94克/升，竹黄多糖为207.62毫克/升，竹红菌素为158.4毫克/升。

实施例4

本实施例的菌种及其摇瓶培养、摇瓶扩大培养的培养条件和培养基组成与实施例1相同。

发酵培养 摇瓶扩大培养的菌种2000mL接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中培养。维持发酵罐培养温度25℃，罐压0.05MPa，搅拌转速180转/分钟，通风量1：0.6v/v/m，培养时间120小时。其中所述的发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：蔗糖30，(NH₄)₂SO₄3，K₂HPO₄0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

发酵结束后，收获菌丝体和发酵液，进行竹红菌素和竹黄多糖的含量测定，测定方法同实施例1。结果，菌丝体干重为8.22克/升，竹黄多糖为217.35毫克/升，竹红菌素为178.9毫克/升。

实施例5

本实施例的菌种及其摇瓶培养、摇瓶扩大培养的培养条件和培养基组成与实施例1相同。

发酵培养  将摇瓶扩大培养的菌种2000mL接入装有21L发酵培养基的30L发酵罐中培养。维持发酵罐培养温度25℃，罐压0.05MPa，搅拌转速180转/分钟，通风量1：0.6v/v/m，培养时间120小时。其中所述的发酵培养的培养基组成为，每一升水中含下列成分(单位：克)：葡萄糖30，尿素3，K₂HPO₄ 0.15，KCl 0.5，MgSO₄ 0.5，FeSO₄ 0.1，pH6.0。

发酵结束后，收获菌丝体和发酵液，进行竹红菌素和竹黄多糖的含量测定，测定方法同实施例1。结果，菌丝体干重为8.25克/升，竹黄多糖为207.94毫克/升，竹红菌素为161.6毫克/升。