一种表面修饰C8烷基链的磁性硅球及其制备方法和应用

摘要

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种表面修饰C8烷基链的Fe3O4@SiO2磁性硅球及其制备方法和应用。该磁性纳米硅球是先合成四氧化三铁的磁性纳米材料，然后合成具有核壳结构的Fe3O4@SiO2磁性微球材料，进而采用C8对其进行表面化学修饰而获得。该固定C8的磁性纳米粒子作为微吸附剂，比表面积大，可对生物体中具有的肽段进行富集，方法简单有效。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于无机材料和分析技术领域，具体涉及一种表面修饰C8烷基链的磁性硅球及其制备方法和应用。

本发明提出的磁性硅球，可作为一种吸附剂进行痕量多肽的分离富集以及MALDI-TOF/MS直接分析，对生物体中具有的肽段进行富集。该材料在蛋白组学等领域有良好的实用价值和应用前景。

背景技术

众所周知，蛋白质组成具有多样性和可变性，即在同一物种的不同细胞中或同一细胞在不同时期，其蛋白质组成都是在不断变化的，造成蛋白质组成异常复杂。同时由于蛋白质存在翻译后修饰，所以一个mRNA往往对应多个蛋白质，也就是说，蛋白质的数量远远多于基因的数量，蛋白质在大小、相对丰度、酸碱度和疏水性方面差异很大，仅在相对丰度上，高丰度蛋白质与低丰度蛋白质相差六个数量级甚至更高；而且，由于蛋白质无法像DNA一样被“扩增”，这些都造成许多含量低的蛋白质在大规模的检测中很难被检测到。低丰度蛋白的分析与鉴定是蛋白质组学研究的重点和难点内容之一。在生物体中承担重要生命活动的蛋白往往都是低丰度蛋白，然而其极低的含量给后续的分析和检测带来困难，限制了人们对它们的研究和认识。因此要从分子水平上，深入研究生命过程的规律，探索生命现象的奥秘，必须对一些具有重要生理功能的低丰度蛋白质进行分析监测，这对目前的分析技术和手段不能不说是一个严峻的挑战[1-2]。

低丰度蛋白的有效浓缩是实现其准确分析和鉴定的重要条件之一。实际上在蛋白质组学研究过程中许多方面都涉及到样品的有效富集，以胶内酶解样品的分析为例：酶解肽段提取液的体积太大，在质谱分析前必须浓缩[3]。目前最常用的样品浓缩方法有溶剂蒸发法和色谱浓缩法。溶剂蒸发法费时费力，在干燥过程中容器表面的吸附会造成大量的肽段损失，同时无机盐等杂质也会被浓缩，影响质谱鉴定的灵敏度[4]。色谱浓缩法是利用样品与吸附剂之间的色谱相互作用对样品进行浓缩，吸附剂一般是采用烷基链修饰的硅胶。该方法能实现在对样品进行有效浓缩的同时，去除样品中的盐分和其他杂质。尤其是在液相色谱与质谱联用时，为了防止样品中的盐分等杂质进入质谱影响信号检测，都是采用了在分离柱前连接一根短小的反相预柱，以实现对样品浓缩和除盐的效果。被人们广泛采用的进行样品除盐浓缩的商品化产品Zip-tip和Zip-plate，也都是基于色谱浓缩法的原理。分别是在枪头管尖或是九十六孔板孔的底部填充少许反相填料，操作相对繁琐；且由于填料很少，因此能富集浓缩的样品量很有限。近年来，纳米材料以其发展快速和应用潜力而被越来越多地应用于在蛋白质组学分析中。杨芃原教授小组等成功地将沸石纳米粒子应用于痕量肽段的富集[5-7]，但是该方法需要高速离心分离样品和沸石混合物，操作相对繁琐。因此发展一种简单便捷而又有效的分离富集蛋白和肽段的方法成为蛋白质组学研究的一个重要方面。

磁性聚合物微球[8-13]以其易于表面修饰、溶液分散性好以及灵敏的磁场感应性为其应用于蛋白质组学分析中痕量肽段的分离富集方面提供了可能。本发明合成了四氧化三铁磁性聚合物微球，进而合成了新型的表面修饰C8烷基链的磁性聚合物材料。利用该磁性聚合物材料作为吸附剂，进行痕量多肽的分离富集以及MALDI-TOF/MS直接分析并初步应用于实际血样中多肽的富集。从而简化了低浓度多肽的分析测定程序，解决了痕量样品的分析困难；也为磁性聚合物微球的应用开辟了新的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高、效果好，能对多肽进行富集的表面修饰烷基链的磁性硅球及其制备方法和应用。

本发明提供的表面修饰烷基链的磁性硅球，由下述方法制备获得：先采用水热法合成四氧化三铁磁性纳米粒子，然后与钛酸丁酯反应，再与二甲基辛基硅烷反应对其表面进行化学修饰，生成表面修饰C8烷基链的磁性硅球，其中,四氧化三铁磁性纳米粒子核的粒径为30～500nm；中间层硅层的厚度为10～100nm；外层为C8烷基链，磁性硅球的粒径为40～600nm。

上述表面修饰C8烷基链的磁性硅球的制备方法的具体步骤如下：

(1)用水热法合成Fe₃O₄超顺磁性纳米粒子：采用1.0-5.0克FeCl₃·6H₂O为原料，以20-80mL乙二醇为分散体系，添加2-6克无水乙酸钠，反应温度为190-210℃，反应时间为6-18小时，生成表面带有氨基的磁性纳米粒子，其粒径是30-500nm；

(2)对Fe₃O₄超顺磁性纳米粒子进行表面处理：将由步骤(1)制得的Fe₃O₄纳米粒子反复用去离子水洗涤，以除去水溶性杂质，然后将其分散在去离子水中，得分散液A。取一个离心管，加2.0g-4.0g上述分散液A，加入3-8mL 2M HCl溶液，超声5-10min，再用磁铁分离除去绿色清液(四氧化三铁粒子表面部分被溶解所致)后，用去离子水分散后再用磁铁收集粒子，去除浅绿色清液，用3-8mL 10wt％的柠檬酸三钠溶液超声分散，静置1-2h，重新用5mL去离子水分散后得分散液B；

(3)合成Fe₃O₄@SiO₂复合微球：取上述经过表面处理的分散液B1.0-2.0g用5-10mL去离子水和30-60mL乙醇稀释，再加0.5-1mL氨水，超声分散5-10min，用机械搅拌，在搅拌同时加入0.5-1.25mL正硅酸乙酯(TEOS)，室温搅拌12-24h，用磁铁收集，得到所需复合微球。

(4)表面修饰：将0.01-0.02g步骤(3)制得的干燥好的复合微球加入1.0-2.0g无水吡啶中，超声分散，然后加入0.2-1.4g二甲基辛基硅烷，室温机械搅拌12-24h。用乙醇和水反复洗涤，再真空干燥即得经表面修饰的C8烷基链的磁性硅球。

本发明合成的表面修饰C8烷基链的磁性硅球，合成方法简单有效并具有很好的磁场感应性。该磁性硅球，可作为一种吸附剂进行痕量多肽蛋白的分离富集，以及进行MALDI-TOF/MS直接分析，例如，可对生物体中具有的多肽段进行富集，使用时可直接将该磁性硅球放入肽段中，无需特殊处理，肽段络合到磁性纳米材料上后，无需离心分离，采用简单磁场作用即可实现肽段的富集。

本发明提出的表面修饰C8烷基链的磁性硅球为生物体中低丰度蛋白、肽段的富集提供了新的方法，并扩展了磁性纳米材料的实际应用，在生物分析研究等领域有良好的实用价值和应用前景。

附图说明

图1为水热法合成的Fe₃O₄磁性纳米粒子的透射电镜图(a)和Fe₃O₄@Si₂磁性硅球透射电镜图(b)。

图2为是合成的硅球透射电镜图(a)以及在其表面键合上C8烷基链的硅球透射电镜图(b)。

图3为表面修饰C8烷基链的磁性硅球的扫描电子显微镜图。

由图1、2和3可见：磁性纳米粒子、硅球磁性纳米粒子和表面修饰C8烷基链的磁性硅球皆具有很好的均一性和分散性。

图4磁性纳米粒子和磁性硅球的磁滞回线图。可见包覆SiO₂前后磁性纳米粒子都具有很好的超顺磁性。

图5为磁性硅球进行硅烷偶联剂修饰前后的傅立叶变换红外表征图。将两者的红外图谱比较可见，经过表面修饰后我们成功制备了表面修饰C8烷基链的磁性硅球。

图6为磁性硅球和硅烷基化磁性硅球的失重曲线。表征结果可见，硅烷化磁性硅球中烷基基团的含量约为6.5wt.％。，我们成功制备了表面修饰烷基链的磁性硅球，其具有与反相色谱填料的C8烷基链修饰的硅球相似的性质，为其应用于有效快速富集肽段提供了可能。

图7为肽段分离富集的质谱鉴定结果。

图8为盐酸溶液中肽段富集的质谱鉴定结果。

图9为MALDI-TOF-MS检测的质谱鉴定结果。

图10为人血清中肽段富集的质谱鉴定结果。

具体实施方式

实施例是对本发明所提供的超顺磁性的表面修饰C8烷基链的磁性硅球材料进行低丰度肽段的分离富集分析过程的进一步说明。

实施例1 表面修饰C8烷基链的磁性硅球的合成

表面修饰C8烷基链的磁性硅球材料的合成共分为三步。

首先，采用水热法合成氨基四氧化三铁磁性纳米粒子：1.0g FeCl₃·6H₂O溶于30mL乙二醇中，磁力搅拌0.5h得到黄色透明溶液。然后加入4.0g无水NaAc，磁力搅拌0.5h后，得到褐黄色透明溶液。将所得溶液转入200mL的Teflon-lined不锈钢反应釜中。放于烘箱，200℃，放置12小时。待冷却至室温，将产物反复用去离子水洗涤5次，以除去醋酸钠和乙二醇等水溶性杂质，最后将产物50℃真空干燥备用。

其次，将如上水热法先合成Fe₃O₄磁性微球分散在100mL的去离子水中，得分散液A备用。对Fe₃O₄磁性微球进行表面处理：取一个离心管，加3.0g上述分散液A，加入5mL2M HCl溶液，超声5-10min后，用磁铁分离除去绿色清液后(四氧化三铁粒子表面部分被溶解所致)，用10mL水分散后再用磁铁收集粒子。去除浅绿色清液，用5mL 10wt％的柠檬酸三钠溶液超声分散，静置1-2h后，重新用5mL去离子水分散后得分散液B备用。取经过表面处理后的分散液B 1.0g用5mL去离子水和30mL乙醇稀释后，再加0.5mL氨水，超声分散5-10min后，用机械搅拌进行搅拌，在搅拌同时加入1.0mL正硅酸乙酯(TEOS)，室温搅拌12h后，即可停止搅拌用磁铁收集复合微球，将复合微球反复用乙醇洗涤5次，50℃真空干燥。

最后，取0.01g干燥好的磁性硅球超声分散在1.0g无水吡啶中，超声分散后加入0.2g二甲基辛基硅烷，室温机械搅拌12h。用乙醇和水反复洗涤，60℃真空干燥24h得最终产物。

实施例2 表面修饰C8烷基链的磁性硅球用于肽段富集

(1)蛋白溶液酶解：

取1.0mg蛋白样品，包括牛血清白蛋白(BSA)、细胞色素C(Cytochrome C)、马心肌蛋白(Myoglobin)、鸡蛋白蛋白(Ovalbumin)、牛β-酪蛋白(β-casein)以及牛奶中提取的酪蛋白(Casein)，分别溶于1.0mL水中，加热变性后，往溶液中加入碳酸氢铵溶液调节体系PH约为8，以1∶50(酶和蛋白之间的质量比)加入25μg胰蛋白酶。在37℃的温度下，酶解12小时后终止酶解，酶解液置于-80℃冰箱冷冻待用。

(2)肽段的分离富集：

将20μL浓度为2mg mL^-1的磁性材料分散液分别加入到1mL浓度为5fmol μL^-1标准肽段或是标准蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37℃，振荡90min。在外加磁场作用下去除上清后，用纯水反复清洗三次；然后加入5μL 50％(v/v)乙腈水溶液将富集在材料上的肽段洗脱下来，磁分离得洗脱液；将1μL含有被富集肽段的洗脱液点到靶板上，待干后进行MALDI-TOF MS分析。质谱鉴定结果见图7。

(3)盐溶液中肽段的富集：

将20μL浓度为2mg mL^-1的磁性材料分散液分别加入到1mL浓度为5fmolμL^-1Myoglobin蛋白的胰蛋白酶酶解肽段混合物中，37℃，振荡90min。在外加磁场作用下去除上清后，用纯水反复清洗三次；然后加入5μL 50％(v/v)乙腈水溶液将富集在材料上的肽段洗脱下来，磁分离得洗脱液；将1μL含有被富集肽段的洗脱液点到靶板上，待干后进行MALDI-TOF MS分析。质谱鉴定结果见图8。

(4)MALDI-TOF-MS的检测

取1μL富集有肽段的磁性微球分散液或是肽段洗脱液点于MALDI靶板上，然后再点上0.5μL CHCA(5mg/mL；溶于50％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)TFA中)。待靶板上的点样液干燥、结晶后，将靶板放进质谱仪，进行MALDI-TOF质谱测定。MALDI-TOF MS质谱实验在4700 Proteomics Analyzer(Applied Biosystems)上完成；激光器为Nd-YAG激光，波长355nm，激光脉冲频率200Hz；加速电压20kV，正离子模式，反射式TOF条件下检测。质谱鉴定结果见图9。

实施例3 表面修饰C8烷基链的Fe₃O₄@SiO₂磁性材料用于人血清中肽段的富集

取10μL成人血清，加入20μL PBS缓冲溶液稀释后，再加入2μL浓度为10mg/mL的表面修饰C8烷基链的磁性材料；用移液枪吹打5次，30s后，磁分离去除上清。将富集了肽段的材料用PH为7.0的PBS缓冲溶液清洗三次，上清去除；加入5μL 50％(v/v)乙腈水溶液将富集在材料上的肽段洗脱下来，磁分离得洗脱液；将0.5μL含有被富集肽段的洗脱液点到靶板上，干后再点0.5μL CHCA(5mg/mL；溶于50％(v/v)乙腈和0.1％(v/v)TFA中)。待干后进行MALDI-TOF MS分析。质谱鉴定的结果见图10。