通过调控发酵过程中的温度进行汽爆秸秆发酵产氢的方法

摘要

本发明的通过调控发酵过程中的温度进行汽爆秸秆发酵产氢的方法：向汽爆秸秆中添加尿素、KH

说明书

技术领域

本发明属于发酵工艺技术领域，主要涉及利用发酵过程中变化温度对汽爆秸秆发酵产氢进行调控的方法。

背景技术

随着人类社会的发展，对能源的需求量越来越大，然而地球上的化石燃料储量有限，因此，必须开发新型的可再生能源以满足人类生产和生活的需要。氢气是一种清洁、高效的能源，是化石燃料良好的替代品。常规的制氢方法，如电解水法和化石原料热裂解法[Adnan M.Int J Hydrogen Energy，2001：26：29-27；AyhanD.Energy Sources，2002：24：59-68.]，存在着能耗高，产物成分复杂，分离成本高等缺点，不能从根本上解决能源和环境问题。以可再生的生物质资源为原料，依靠微生物发酵制氢日益成为研究的方向和热点。

秸秆是一类来源非常丰富，价格极为低廉的可再生性资源，经汽爆处理后，秸秆中的部分半纤维素发生降解，纤维素的致密结构被破坏，易于降解而被微生物所利用。丁酸梭菌(Clostridium butyricum)能够利用包括葡萄糖、木糖、纤维二糖等大部分的木质纤维素水解物，是以汽爆秸秆为原料进行发酵产氢的理想菌种(Hawkes FR.Int J Hydrogen Energy 2002，27：1339-1347.)。在以汽爆秸秆为底物的微生物发酵过程中，添加纤维素酶使底物中的纤维素和半纤维素降解以产生微生物能够利用的小分子可溶性糖，是提高汽爆秸秆原料利用率的关键。

常用的利用汽爆秸秆发酵制氢的方式是同步糖化发酵，即将汽爆秸秆原料，纤维素酶和菌种同时置于发酵罐中，边酶解边发酵(陈洪章，李佐虎。使用汽爆植物秸秆发酵制备氢气的方法。国家发明专利，CN1500879A)。但是，在同步糖化发酵过程中，环境温度通常以满足微生物的生长为主要目标。在以C.butyricum为产氢菌时，发酵罐的温度保持在其最适生长温度35℃，而纤维素酶的最适作用温度为50℃，两者之间的最适温差有15℃，导致原料的利用率难以提高。因此，有必要探索新的发酵方式以解决这一矛盾。

发明内容

本发明的目的是针对汽爆秸秆同步糖化发酵制氢过程中酶解和发酵温度不一致的问题，提供一种在发酵过程中进行变温刺激，以同时满足纤维素降解和微生物发酵的需要，提高纤维素酶解率和氢气产率的新方法。

本发明利用汽爆秸秆配制培养基进行丁酸梭菌(C.butyricum AS1.209)产氢发酵，发酵初期温度维持在微生物生长的最适温度，35℃。在发酵进行到一定的时间后，经过一段时间后，迅速将发酵罐的温度升高，达到有利于纤维素酶发挥作用而又不影响微生物的活性的温度，维持一段时间后，迅速降温至35℃。发酵继续进行一段时间后，再次重复上述操作。经过这样的多次变温，达到促进底物中纤维素的降解，提高底物转化率和产氢效率的目的。

本发明的技术方案如下：

本发明提供的通过调控发酵过程中的温度进行汽爆秸秆发酵产氢的方法，其步骤如下：

(1)制备汽爆秸秆培养基

向汽爆秸秆原料中添加尿素0.05～0.3g/g-底物、KH₂PO₄ 0.03g/g-底物、MgSO₄0.015g/g-底物和水，灭菌后得到汽爆秸秆培养基；所述底物是指汽爆秸秆原料；

汽爆秸秆培养基中的汽爆秸秆原料与所加液体的固液质量份配比为1∶3；

(2)制备丁酸梭菌种子液

将丁酸梭菌接种于丁酸梭菌种子培养基中，35℃厌氧培养至对数生长期，制得丁酸梭菌种子液；所述丁酸梭菌购自中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCC AS1.209.

所述每升丁酸梭菌种子培养基含有葡萄糖20g，酵母抽提物3g，KH₂PO₄0.2g，K₂HPO₄ 1.6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl₂ 0.01g，Na₂S·9H₂O0.25g，NaMoO₄·2H₂O 0.01g，NaHCO₃ 0.2g和(NH₄)₂SO₄ 3.0g；

(3)变温发酵制备氢气

向步骤(1)所得汽爆秸秆培养基中接入丁酸梭菌种子液，接种量为4～10亿个细胞/g-底物，再加入适量的无菌蒸馏水，使最终的固液质量份比为1∶5～1∶8，均匀混合后，迅速通入氮气除氧，置于35℃开始发酵；

发酵开始6～12小时后，迅速升高温度至40～46℃，保持1～3小时后，迅速降温至35℃恒温继续发酵；

当发酵进行至22～36小时，再次迅速升高至40～46℃，保持1～3小时，之后迅速降温至35℃恒温发酵至不再有气体产生；

用排水集气法收集所产生气体，所产生气体为氢气和二氧化碳混合物，经分离后，得到纯氢气。

所述汽爆秸秆料的制备如下：

将植物秸秆粉碎到3～4cm的长度，放入汽爆罐中，密闭后通入水蒸汽，使罐压迅速升至1.5MPa，维压10min后，迅速放压，制得汽爆秸秆料；

所述汽爆植物秸秆料为汽爆小麦秸秆料麦秸秆，汽爆玉米秸秆料，汽爆水稻秸秆料或汽爆高梁秸秆料。

本发明的通过调控发酵过程中的温度进行汽爆秸秆发酵产氢的方法，在发酵过程中短时间升高温度，将显著促进纤维素酶解，对微生物的活性却不会有太大影响，从而提高原料的利用率和产物产量。

图1显示了以汽爆玉米秸秆为底物进行丁酸梭菌发酵的过程中，对发酵过程进行变温控制和恒温发酵的产氢量变化曲线；变温控制为发酵进行10h后将温度升高至45℃保持2h，之后降低回到35℃，继续恒温发酵；当发酵进行到30h后再次升温至45℃保持2h，然后再次降低至35℃恒温发酵；可知，在发酵初期短时间升高温度，微生物的活性受到一定影响，延迟期变长，但在温度降低回到35℃后，产氢量迅速增加；第二次升温后，发酵受到一定影响，但随后产氢量出现了第二次迅速增高，说明升高温度促进了纤维素降解，微生物发酵所需的营养成分得到补充，总产氢量显著提高。

总之，本发明的通过调控发酵过程中的温度进行汽爆秸秆发酵产氢的方法具备如下优点：

本发明针对汽爆秸秆同步糖化发酵制氢过程中酶解和发酵温度不一致的问题，提供一种在发酵过程中进行变温刺激，以同时满足纤维素降解和微生物发酵的需要，可提高植物秸秆中纤维素酶解率和氢气产率。

附图说明

附图1为以汽爆玉米秸秆为底物进行变温发酵与恒温发酵制备氢气的试验结果对比示意图。

具体实施方式

实施例1.用本发明提供的方法以汽爆玉米秸秆为原料进行变温发酵制备氢气，具体步骤如下：

1、制备汽爆秸秆料

把秸秆粉碎到3～4cm的长度，放入汽爆罐中，密闭后通入水蒸汽，使罐压迅速升至1.5MPa，在此压力下维持10min后，迅速放压，制得汽爆秸秆料；

2、制备丁酸梭菌种子液

将丁酸梭菌(购自中国微生物保藏管理委员会普通微生物保藏中心，其保藏号为CGMCC AS1.209)接种于丁酸梭菌培养基，35℃厌氧培养至对数生长期，即制得丁酸梭菌种子液；

所述每升丁酸梭菌培养基含葡萄糖20g，酵母抽提物0.5g，KH₂PO₄ 0.2g，K₂HPO₄ 1.6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 0.1g，CaCl₂ 0.01g，Na₂S·9H₂O 0.25g，NaMoO₄.2H₂O 0.01g，NaHCO₃ 0.2g and(NH₄)₂SO₄ 3.0g；

3、制备汽爆秸秆培养基

向汽爆秸秆原料中添加尿素0.2g/g-底物、KH₂PO₄0.03g/g-底物、MgSO₄0.015g/g-底物和水，其固液质量份配比为1∶3，灭菌后得到汽爆秸秆培养基；所述底物是指汽爆秸秆原料；

4、变温发酵制备氢气

将处于对数生长期的种子液接种于汽爆秸秆培养基(混合均匀)，接种量4亿个细胞/g-底物，并向汽爆秸秆培养基中适当添加无菌蒸馏水，使最终的固液质量份比为1∶6，迅速通入氮气除氧后，置于35℃开始发酵；

发酵开始8小时后，将反应器温度迅速升高至40℃，维持1小时后，迅速降温到35℃，继续恒温发酵；当发酵进行至30小时后，再次迅速升温至40℃，维持1小时后，迅速降温至35℃，继续恒温发酵至不再有气体产生；

用排水集气法收集所产生的氢气和二氧化碳，经分离后，得到氢气。

连续发酵78小时，发酵产物中只有氢气和二氧化碳，其中，氢气含量为44.5％，比产氢率为78ml/g-底物，分离后可得纯氢气。

实施例2.用本发明提供的方法以汽爆高粱秸秆为原料进行发酵，具体步骤如下：

步骤1、2同实施例1。

3、向汽爆秸秆原料中添加尿素0.15g/g-底物、KH₂PO₄ 0.03g/g-底物、MgSO₄0.015g/g-底物和水，其固液质量份配比为1∶3，灭菌后得到汽爆秸秆培养基；所述底物是指汽爆秸秆原料；

4、将处于对数生长期的C.butyricum AS1.209种子液与培养基混合均匀，接种量6亿个细胞/g-底物，并向培养基中适当添加无菌蒸馏水，使最终的固液质量份比为1∶5，迅速通入氮气除氧后，置于35℃开始发酵。发酵开始10小时后，将反应器温度迅速升高至45℃，维持1小时后，迅速降温回到35℃，继续在此温度下恒温发酵。当发酵进行至24小时后，再次迅速升温至45℃，维持1小时后，迅速降温至35℃至不再有气体产生。用排水集气法收集所产生的氢气和二氧化碳，经分离后，得到氢气。

连续发酵78小时，发酵产物中只有氢气和二氧化碳，其中，氢气含量为42.6％，比产氢率为75ml/g-底物，分离后可得纯氢气。

实施例3.用本发明提供的方法以汽爆麦秸为原料进行发酵，具体步骤如下：

步骤1、2同实施例1。

3、向汽爆秸秆原料中添加尿素0.18g/g-底物、KH₂PO₄ 0.03g/g-底物、MgSO₄0.015g/g-底物和水，其固液质量份配比为1∶3，灭菌后得到汽爆秸秆培养基；所述底物是指汽爆秸秆原料；

4、将处于对数生长期的C.butyricum AS1.209种子液与培养基混合均匀，接种量8亿个细胞/g-底物，并向培养基中适当添加无菌蒸馏水，使最终的固液质量份配比为1∶7，迅速通入氮气除氧后，置于35℃开始发酵。发酵开始8小时后，将反应器温度迅速升高至43℃，维持2小时后，迅速降温回到35℃，继续恒温发酵。当发酵进行至30小时后，再次迅速升温至43℃，维持2小时后，迅速降温至35℃，继续恒温发酵至不再有气体产生。用排水集气法收集所产生的氢气和二氧化碳，经分离后，得到氢气。

连续发酵78小时，发酵产物中只有氢气和二氧化碳，其中，氢气含量为43.8％，比产氢率为74ml/g-底物，分离后可得纯氢气。

实施例4.用本发明提供的方法以汽爆玉米秸秆为原料进行发酵，具体步骤如下：

步骤1、2同实施例1。

3、向汽爆秸秆原料中添加尿素0.2g/g-底物、KH₂PO₄ 0.03g/g-底物、MgSO₄0.015g/g-底物和水，其固液质量份配比为1∶3，灭菌后得到汽爆秸秆培养基；所述底物是指汽爆秸秆原料；

4、将处于对数生长期的C.butyricum AS1.209种子液与培养基混合均匀，接种量10亿个细胞/g-底物，并向培养基中适当添加无菌蒸馏水，使最终的固液质量份配比为1∶6，迅速通入氮气除氧后，置于35℃开始发酵。发酵开始10小时后，将反应器温度迅速升高至45℃，维持2小时后，迅速降温回到35℃，继续恒温发酵。当发酵进行至35小时后，再次迅速升温至45℃，维持2小时后，迅速降温至35℃，继续恒温发酵至不再有气体产生。用排水集气法收集所产生的气体。

连续发酵78小时，发酵产物中只有氢气和二氧化碳，其中，氢气含量为45.2％，比产氢率为76ml/g-底物，分离后可得纯氢气。