一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法

摘要

一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法，其特征在于：在鸡胚的气室侧方打一针孔作为减压孔；在鸡胚的胚体接近尿囊腔处打一针孔作为进针孔，直接进针尿囊腔内，接种样品0.5－1.0ml/胚。本发明通过加大接种量而达到增加病毒量的目的，因此提高了病毒的分离率。

说明书

技术领域：

本发明涉及病毒的分离接种技术，特别提供了一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法。

背景技术：

禽流感病毒是禽类及一些哺乳类动物的呼吸系统疾病的重要病源，是由正粘病毒科A型病毒特定亚型引起的一种急性、烈性传染病，严重危害养禽业和人类健康。禽流感病毒的变异频繁，血清亚型众多，包括H1-H15，N1-9，几乎感染所有的禽类。从样品中分离获得致病病原体(病毒)，是诊断病毒性传染性病(禽流感)的重要依据。目前分离禽流感病毒株一般是采集禽类(鸡、鸭等)泄殖腔棉拭子，然后，通常采用鸡胚接种分离病毒。

通过鸡胚尿囊腔培养分离禽流感病毒是一种传统经典方法。一般采用孵化9-11日龄的鸡胚，暗室内画出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0.1-0.2ml/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化，尿囊液进行HA效价测定。在长期的应用过程中，该接种法存在接种量不能超过0.2ml缺陷，接种量大于或等于(≥)0.3ml/胚时，即出现液体外溢(内压增高)并在24小时内死胚增加。

发明内容：

本发明的目的是提供一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法。

本发明具体提供了一种提高禽流感病毒分离率的鸡胚尿囊腔接种方法，其特征在于：在鸡胚的气室侧方打一针孔作为减压孔；在鸡胚的胚体接近尿囊腔处打一针孔作为进针孔，直接进针尿囊腔内，接种样品0.5～1.0ml/胚。

通常情况下，接种样品内所含的病毒量与分离率成正比。待检样品内病毒的含量是有限的，本发明采用“二孔法”是通过加大接种量而达到增加病毒量的目的，因此提高了病毒的分离率。

附图说明：

图1为传统鸡胚尿囊腔接种法示意；

图2为本发明鸡胚尿囊腔接种法示意。

具体实施方式：

实施例1

采用传统鸡胚尿囊接种法和本发明鸡胚尿囊接种法，进行禽流感病毒分离率比较(操作方法分别如图1，2所示)。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。

样品为2005年湖北某县疑似禽流感鸭样品82份。具体操作方法如图2所示：采用孵化9-11日龄的鸡胚82枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔(减压孔)；胚胎位置朝上横置卵架上，避开胚体0.3-0.5cm处打一针孔(进针孔)，直接进针尿囊腔内接种样品0.5-1.0ml/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表1。

比较例1

样品为2005年湖北某县疑似禽流感鸭样品82份。每一份样品同时采用两种方法分别各接种一枚鸡胚。具体操作方法如图1所示：采用孵化9-11日龄的鸡胚82枚，暗室内画出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0.1-0.2ml/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表1。

表1：2005年湖北某县疑似禽流感鸭样品病毒分离方法比较实验结果

注：

1.传统接种方法简称“单孔法”，新接种方法简称“二孔法”。

2.n为待检样品的数量。

3.结果判断：HA效价≥1：32判为分离获得流感病毒。

实施例2

采用传统鸡胚尿囊接种法和本发明鸡胚尿囊接种法，进行禽流感病毒分离率比较(操作方法分别如图1，2所示)。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。

样品为2005年浙江某县疑似禽流感鸡样品69份。每一份样品同时采用两种方法分别各接种一枚鸡胚。具体操作方法如图2所示：采用孵化9-11日龄的鸡胚69枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔(减压孔)；胚胎位置朝上横置卵架上，避开胚体0.3-0.5cm处打一针孔(进针孔)，直接进针尿囊腔内接种样品0.5-1.0ml/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表2。

比较例2

样品为2005年浙江某县疑似禽流感鸡样品69份。每一份样品同时采用两种方法分别各接种一枚鸡胚。具体操作方法如图1所示：采用孵化9-11日龄的鸡胚69枚，，暗室内画出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0.1-0.2ml/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表2。

表2：2005年浙江省某县疑似禽流感鸡样品病毒分离方法比较实验结果

实施例3

采用传统鸡胚尿囊接种法和本发明鸡胚尿囊接种法，进行禽流感病毒分离率比较(操作方法分别如图1，2所示)。同一份样品同时采用两种方法，分别各接种一枚鸡胚。

样品为2004年湖南省某县疑似禽流感鸡样品55份。具体操作如图2所示，采用孵化9-11日龄的鸡胚55枚，经照视后划出气室及胚胎位置，于气室侧方打一针孔(减压孔)；胚胎位置朝上横置卵架上，避开胚体0.3-0.5cm处打一针孔(进针孔)，直接进针尿囊腔内接种样品0.5-1.0ml/胚，以融化的石蜡封孔闭两个针孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24小时内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，观察鸡胚肉眼变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表3。

比较例3

样品为2004年湖南省某县疑似禽流感鸡样品55份。具体操作如图1所示，采用孵化9-11日龄的鸡胚55枚，暗室内画出气室边缘和胚头位置，气室朝上立于卵架上，消毒操作部位，在胚头一侧气室边缘上方0.5cm处打一针孔；进针至尿囊腔内接种样品0.1-0.2ml/胚，以融化的石蜡封孔，气室朝上立于卵架上继续孵化，弃去24h内死亡鸡胚，至96小时全部取出于4℃冰箱过夜。收毒：无菌操作打开气室部位蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，吸出尿囊液，肉眼观察鸡胚病理变化，尿囊液进行HA效价测定。结果见表3。

表3：2004年湖南省某县疑似禽流感鸡样品病毒分离方法比较实验结果

从以上实施例可以看出，采用本发明“二孔法”分离病毒增加了尿囊腔接种量0.8-ml/胚。结果显著提高了病毒分离率，经统计学分析(表1，表2，表3)“二孔法”病毒分离率比传统接种方法提高了3.0～3.75倍。