稻瘟菌激发子CSBⅠ基因及其克隆方法

摘要

本发明公开了一种稻瘟菌激发子CSB Ⅰ基因及其克隆方法，所述基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID NO：1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2。根据已测的CSB Ⅰ激发子的肽端编码序列设计引物，以稻瘟病菌ZC

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种稻瘟菌糖蛋白激发子CSB I基因及其克隆方法。

背景技术

稻瘟病(rice blast disease)是山子囊菌Magnaporthe grisea(Hebert)Barr[其无性世代为Pyricularia grisea(Cooke)Sacc.]引起的水稻三大病害之一，在水稻栽培的国家和地区广泛分布并严重影响水稻的产量和质量。稻瘟病常年均有不同程度的发生，流行年份一般减产10％-20％，严重时达50％以上。水稻抗稻瘟病品种的选育和利用是防治稻瘟病的有效措施。但由于稻瘟菌的遗传背景复杂，易于变异，而且抗稻瘟病品种相对单一化，主栽品种的遗传同质性，使抗病育种难以跟上稻瘟病菌生理小种的变异速度，常常导致一个新的具有抗稻瘟病的水稻品种在大面积种植3到5年后就严重感病。稻瘟菌有多个生理小种，其中ZC₁₃是广东省优势小种，对水稻造成很大危害。

激发子是来自于生物的化合物，病原菌产生的激发子能诱导植物产生不同类型的防卫反应，包括离子渗漏，氧化突发，植物细胞壁的修饰，植保素及病原相关蛋白的合成，过敏性反应的发生，防御基因的诱导启动等，从而使植物对病原菌具有杀伤作用或产生抗性。如果能找到稻瘟菌ZC₁₃生理小种的激发子，将对稻瘟菌诱导抗病机制研究提供重要的技术资料和基础，为有效提高水稻的产量和质量做出贡献。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的空白，提供一种稻瘟菌激发子CSB I基因。

本发明的另一个目的是提供了所述稻瘟菌激发子CSB I基因的简单准确有效的克隆方法。

本发明的技术方案是提供一种稻瘟菌激发子CSB I基因，基因编码的核苷酸序列，cDNA全长序列如SEQ ID NO：1，氨基酸序列如SEQ ID NO：2。

本发明同时提供了所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法，包括以下步骤：

(1)稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA；

(2)以(1)总RNA为模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一链；利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生理小种CSB I激发子的推导cDNA序列。

步骤(1)所述稻瘟病菌生理小种菌株为稻瘟病菌ZC₁₃生理小种。

步骤(1)所述菌株培养为在合适的培养基中25℃培养4天。

所述培养基为采用酵母浸膏5g和葡萄糖22g用水定容至1000mL，于121℃灭菌20min。

所述稻瘟菌激发子CSB I基因的克隆方法的步骤(2)包括以下步骤：

(a)设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病菌ZC₁₃生理小种总RNA的3’RACE，得到CSB I基因cDNA的3’端的片段；

(b)在cDNA的3’端设计一特异引物P5B，并根据3’端序列与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白hypothetical protein MG07877.4的cDNA编码序列的5’端设计一特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5’端，得到CSB I基因cDNA的5’末端片段；

(c)3’和5’末端拼接得到序列；用3’端序列设计特异引物P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。

步骤(a)所述引物分别为：

P33A：5’-GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3’；

P39A：5’-CARCARGCBTGGGTBATYCGTC-3’；

M13 Primer M4：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’。

步骤(b)所述特异引物分别为：

P5B：5’-CTGCAAACACCCTCGAATGACCC-3’；

P5endA：5’-GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT-3’。

步骤(c)所述引物为：

P3endB：5’-GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA-3’。

本发明的有益效果是本发明中的CSB I激发子可以诱导水稻产生抗病性，抵抗稻瘟病菌的侵染。所获得的CSB I激发子cDNA序列，除了可以作为进一步研究稻瘟病菌与水稻相互作用的机制之外，可以进行转化水稻进行抗病育种使用，并且将CSB I激发子基因转化到真核微生物中，所表达的CSB I可以作为防治水稻病害的新药剂——植物抗病诱导剂使用。这种抗病诱导剂具有高效、安全、持久的特点。

附图说明

图1 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列3’RACE第一次扩增产物电泳图

图2 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列3’RACE巢式扩增产物电泳图

图3 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列5’RACE产物电泳图

图4 ZC₁₃CSB I激发子cDNA推导序列巢式扩增产物电泳图

具体实施方式

下面结合具体实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。

根据已测的稻瘟菌ZC₁₃生理小种CSB I激发子肽段编码序列设计引物，克隆CSB I cDNA的全长序列，按照编码规则推导出CSB I的氨基酸序列。包括以下步骤：

(1)稻瘟病菌生理小种菌株培养后提取总RNA；

(2)以(1)总RNA为模板，采用RT-PCR法合成cDNA第一链；利用cDNA末端快速扩增技术克隆得到稻瘟病菌生理小种CSB I激发子的推导cDNA序列。

步骤(1)过程如下：

低温保存的稻瘟病菌ZC₁₃生理小种菌株经活化后接种在液体培养基于25℃培养4天，液体培养基为酵母浸膏5g、葡萄糖22g，用水定容至1000mL，121℃，灭菌20min。然后用2层普通滤纸以布氏漏斗滤出菌丝，经双蒸水ddH₂O充分洗涤，真空泵抽干水分。

改进OMEGA公司的真菌RNA抽提纯化试剂盒E.Z.NA Fungal RNAKit方法提取总RNA。方法如下：

首先将抽滤收获的菌丝放入研钵中，加液氮速冻后研磨成粉末，取约50mg粉末转移到用液氮预冷的1.5mL离心管中，向离心管中加入600μL RNA裂解液RFL和12μL β-巯基乙醇快速混匀，振荡10秒，使菌丝粉末完全溶解。然后加入140μL RNA抽提液SP，颠倒混合数秒钟，冰浴15分钟，室温离心10 000g，10min，吸取上清，再加入140μL RNA抽提液SP，重复抽提一次，以完全除去除菌丝体中的蛋白质和多糖。接着吸取上清，加入等体积异丙醇，室温离心10 000g，10min，弃上清，离心管倒置于干净滤纸上，流干其中的液体。加350μL 65℃预热RB缓冲液，350μL溶解RNA沉淀，加入350μL 75％的乙醇，振荡混匀。再将混匀的样品移入HiBindRNAspin吸附柱中，放入2mL离心管中，室温离心10 000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入750μL洗脱缓冲液I，室温离心10 000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液。吸附柱中加入500μL洗脱缓冲液II，室温离心10 000g，30sec，取出吸附柱，倒掉离心管中的滤液，重复一次。最后加入30μL的DEPC水，放入新的1.5mL离心管中，室温离心10 000g，1min，所获洗脱液即为提取的RNA。

步骤(2)实验过程如下：

(a)设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行所述稻瘟病菌ZC₁₃生理小种总RNA的3’RACE，得到CSB I基因cDNA的3’端的片段。见附图1 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列3’RACE第一次扩增产物电泳图，其中M：DNA Marker(标志)，3’RACE第一次扩增产物，不同退火温度条件摸索：1、60.8℃、2：60.5℃、3：59.8℃、4：59.0℃、5：58.2℃、6：57.8℃、7：57.5℃、8：56.9℃。

质谱测得的CSB I激发子肽段氨基酸序列，在GenBank中查找同源序列，根据同源序列的氨基酸密码子的偏好性，同时考虑稻瘟菌密码子使用频率，利用Oligo6软件设计两条上游简并引物P33A和P39A，进行3’RACE。

P33A：5’-GYATYAACTACGARWCCGAYCGC-3’

P39A：5’-CARCARGCBTGGGTBATYCGTC-3’

M13 Primer M4：5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’

首先合成cDNA的第一链，在200μL PCR管中配制下列反应液：1μL总RNA，1μL 10×反转录缓冲液，10mM的dNTPs 1μL，40units/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，2.5pmol/μL的OligodT-Adaptor反转录引物0.5μL，5units/μL的AMV反转达录酶0.5μL，25mmol/L的MgCl₂ 2μL，加DEPC处理ddH₂O至总体积10μL。混合均匀后置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30℃反应10min，42℃保温60min，99℃反应5min，5℃冷却5min。然后以P33A和3’端锚定引物M13 Primer M4进行第一轮RT-PCR，在冰上准备下列反应物：5units/μL的Ex Taq HS 0.25μL，5×PCR缓冲液10μL，20μmol/L的上游引物P33A 0.5μL，20μmol/L的M13 Primer M4 0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积40μL。混匀后加入到上述反应完成的10μL cDNA模板中，置TaKaRa PCR ThermalCycler Dice上进行扩增：94℃，2min预变性；94℃，30sec变性；59.0℃，30sec退火；72℃，2min延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸7min。反应结束后用1％琼脂糖凝胶电泳检测到约1400bp的特异性最强的条带。

然后将第一轮PCR产物稀释10倍用于第二轮巢式PCR扩增。见附图2 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列3’RACE巢式扩增产物电泳图，其中M：DNA Marker，3’RACE巢式扩增产物，不同退火温度条件摸索：1：55.7℃、2：56.4℃、3：57.2℃、4：58.0℃、5：58.9℃、6：59.7℃、7：60.6℃、8：61.6℃。巢式PCR的反应体系为：1μL第一轮扩增产物，5units/μL的rTaq 0.25μL，10×PCR缓冲液5μL，2.5mmol/L的dNTPs4μL，25mmol/L的MgCl₂ 3μL，20μmol/L的上游引物P39A 1μL，20μmol/L的下游引物M13 Primer M4 1μL，加入灭菌ddH₂O至总体积50μL。混匀后在TaKaRa PCR ThermalCycler Dice上，进行扩增：94℃，2min预变性；94℃，30sec变性；61.6℃，30sec退火；72℃，1min30sec延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸7min。反应结束后在1％琼脂糖凝胶电泳检测到一条约900bp的特异DNA条带，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将该片段与首轮扩增特异性最强的片段克隆、交上海英骏生物技术有限公司测序后，发现首轮扩增特异性条带全长1362bp，巢式扩增序列特异性条带全长907bp。分析后发现，巢式扩增片段与首轮扩增片段的下游部分完全重合，首轮扩增的特异性片段编码序列包含CSB I激发子用于设计简并引物的两肽段。在片断中还包括一个终止密码子TGA。在终止密码子下游包含一个长139bp的3’端非编码区，含16个腺苷酸的poly(A)，由此证实得到的片段为CSB I基因的3’端的片段。(b)在cDNA的3’端设计一特异引物P5B，并根据3’端序列与稻

瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白hypothetical protein MG07877.4的cDNA编码序列的5’端设计一特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5’端，得到CSB I基因cDNA的5’末端片段；见附图3 ZC₁₃CSB I激发子cDNA序列5’RACE产物电泳图，其中，M：DNA Marker，1、2：cDNA5’末端扩增产物。

根据3’RACE克隆测序结果在cDNA的3’端设计一特异引物P5B，并根据3’端序列与稻瘟菌全基因组数据库的比对结果，在同源性最高的假定蛋白(hypothetical protein MG07877.4)的cDNA编码序列的5’端设计一特异引物P5endA，将其分别作为下游和上游引物扩增cDNA的5’端：

P5B：5’-CTGCAAACACCCTCGAATGACCC-3’

P5endA：5’-GCTTGTTCCGACGAGTCCTTGT-3’

首先合成cDNA的第一链，在200μL PCR管中配制下列反应液：1μL总RNA，1μL 10×反转录缓冲液，10mM的dNTPs 1μL，40units/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，2.5pmol/μL的P5B反转录引物0.5μL，5units/μL的AMV反转达录酶0.5μL，25mmol/L的MgCl₂ 2μL，加DEPC处理ddH₂O至总体积10μL。混合均匀后置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上，30℃反应10min，42℃保温30min，99℃反应5min，5℃冷却5min。

然后进行RT-PCR，在冰上准备下列反应物：5units/μL的Ex TaqHS 0.25μL，5×PCR缓冲液10μL，20μmol/L的上游引物P5endA0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积40μL。混匀后加入到上述反应完成的10μL cDNA模板中，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上进行扩增：94℃，2min预变性；94℃，30sec变性；55.3℃，30sec退火；72℃，1min30sec延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸7min。反应结束后在1％琼脂糖凝胶电泳检测到一条约1200bp的特异DNA条带，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将该片段克隆、交上海英骏生物技术有限公司测序后，发现扩增特异性条带全长1158bp。序列分析后发现，除掉它与3’端重叠片段后，还包含969nt序列，其中包含N-端全部已测出氨基酸序列和1个起始密码子ATG。起始密码子前有35nt的5’端非编码区。从序列分析结果可以证实，片段为CSBI基因的5’末端片段。

(c)3’和5’末端拼接得到序列；用3’端序列设计特异引物P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。

用3’端序列设计特异引物P3endB，与P5endA扩增由P3endB反转录稻瘟菌ZC13生理小种总RNA得到的cDNA，验证拼接得到序列。

P3endB：5’-GGCGCATTACAGGTAGCTAGTCA-3’

合成cDNA的第一链，在200μL PCR管中配制下列反应液：1μL总RNA，1μL 10×反转录缓冲液，10mM的dNTPs 1μL，40units/μL的RNA酶抑制剂0.25μL，2.5pmol/μL的P3endB反转录引物0.5μL，5units/μL的AMV反转达录酶0.5μL，25mmol/L的MgCl₂2μL，加DEPC处理ddH₂O至总体积10μL。混合均匀后置TaKaRa PCRThermal Cycler Dice上，30℃反应10min，42℃保温60min，99℃反应5min，5℃冷却5min。

然后进行RT-PCR，在冰上准备下列反应物：5units/μL的Ex TaqHS 0.25μL，5×PCR缓冲液10μL，20μmol/L的上游引物P5endA0.5μL，加入灭菌ddH₂O至总体积40μL。混匀后加入到上述反应完成的10μL cDNA模板中，置TaKaRa PCR Thermal Cycler Dice上进行扩增：94℃，2min预变性；94℃，30sec变性；55℃，30sec退火；72℃，2min30sec延伸；35个重复循环，最后72℃，延伸7min。反应结束后在1％琼脂糖凝胶电泳检测到一条约2200bp的特异DNA条带，用北京天根生化科技有限公司的TIANgel Mini普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将该片段克隆、交上海英骏生物技术有限公司测序后，发现扩增特异性条带大小为2281bp。

测序结果发现该序列与由3’和5’末端拼接得到的序列吻合。CSB I cDNA序列全长2331bp，包含一个2157bp的ORF，编码含有718个氨基酸残基的蛋白质。附图4为ZC₁₃ CSB I激发子cDNA推导序列巢式扩增产物电泳图，其中M：DNA Marker，1、2：cDNA序列巢式扩增产物。

SEQUENCE LISTING