一株具杀线虫活性的木霉属真菌及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一株具毒杀植物寄生线虫作用的真菌的培养方法及其代谢物制备方法和应用，属于微生物农药技术领域。本发明涉及的木霉菌菌株Snef85为哈茨木霉Trichoderma harzianum，已于2007年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2235。该木霉菌菌株Snef85的分类地位是半知菌亚门，丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，木霉属，哈茨木霉。通过液体发酵培养制备，其代谢产物对植物寄生线虫，特别是对南方根结线虫、水稻干尖线虫和大豆胞囊线虫具有毒力高，杀线虫效果明显的突出特点。该菌株的发酵液对根结线虫(Meloidogynespp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)防治效果明显。不同稀释浓度发酵液的处理和无菌水处理有显著差异，发酵原液的杀线虫效果可达到95％以上，具良好的应用开发前景。

说明书

技术领域：

本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种毒杀植物寄生线虫的真菌及其制备方法和应用。

背景技术：

植物寄生线虫在世界上许多国家和地区发生和为害，种类多种多样。在全球范围内，植物寄生线虫的发生与危害随着农林业的发展和耕作栽培制度的变化日益严重，据Esser统计，到1990年为止全世界已报道发现植物寄生线虫207属4832种(刘维志，段玉玺.2000.植物病原线虫学.北京：中国农业出版社，p1-2)。据估计，植物寄生线虫造成世界主要农作物的年损失率为12.3％，超过1000亿美元，而实际的损失远远超过估计，理由是许多线虫造成的危害因没有田间可见症状或专化性特征而未引起注意(王寿华.果树线虫学.北京：中国农业科技出版社，1994.P.1-5)，此外，世界范围内对线虫为害的新发现还在不断增加，而且一些更新的农业栽培体制使线虫问题更加突出，再者，线虫与其它生物相互作用而对植物产生的直接或间接影响还在急剧增加。从这种意义上说，线虫造成的危害较其它生物更加隐蔽！目前对植物有害的线虫约有3000多种，在我国主要有根结线虫、胞囊线虫、松材线虫、甘薯茎线虫等。根结线虫是农业上为害最大的一类线虫，病害发生后，一般减产10％左右，严重的高达75％以上，甚至绝收(A.G.Whitehead，1998.Plant Nematode Control.ISBN0851991882 CAB International)。目前，植物寄生线虫的防治仍以化学防治为主，但近年来，化学杀线剂的应用浪费大，污染环境，选择性差，灭生性强，破坏土壤生物区系等弊端日益为人们所重视(张克勤，何世川，周薇等.1991.真菌和细菌在线虫生防中的作用及其研究进展.杀虫微生物.3：55-66)，21世纪称为环保世纪，一些有效的化学杀线剂的应用逐步受到限制，因此对植物寄生线虫的生物防治研究自然成为热点问题。本发明正是基于上述理论，以植物寄生线虫为靶标，从真菌代谢产物中寻找具有高效杀线虫活性物质，拟为研究开发新型生物杀线虫剂寻找新的资源。

早在1932年，Weindling(1932)首次发现木素木霉菌(Trichoderma lignorum)对植物病原真菌有拮抗作用，之后研究者发现了木霉菌对许多植物病害都有防治能力。多年来，人们对木霉菌的生防应用、生物药剂的开发以及生防机制做了许多尝试和深入的研究。然而，木霉菌在植物寄生线虫领域上的研究却起步较晚，在国内，木霉菌对线虫的生防作用的研究很少，在国外，已有一些利用木霉防治植物寄生线虫的报道，尤其以研究哈茨木霉为重点，但多数报道都是利用哈茨木霉等木霉菌株的活菌剂对植物寄生线虫进行生物防治(Akhtar，2005.；Abd-El-Moity et al.，1997.；Reddy et al，1996.)，但利用活菌剂防治植物寄生线虫存在弊端，如生防效果稳定性较差等等；也有少数报道是利用哈茨木霉发酵液对植物寄生线虫进行防治的，Djian等(1991)在淡紫拟青霉(Paecilomyces lilacinus)和长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)的发酵滤液中分离并鉴定了一种活性杀线产物——乙酸。它对植物寄生线虫的防治非常有效，而其他线虫如腐生线虫、食真菌线虫，捕食线虫和动物寄生线虫对乙酸都不敏感。Khattak et al.(2001，2002)利用哈茨木霉防治爪哇根结线虫，其发酵液抑制线虫卵孵化，发酵液稀释2×时抑制率高达80％，稀释100×抑制率可达20％。Ansari等(2002)利用哈茨木霉等菌株的发酵液抑制爪哇根结线虫卵孵化。Pathak等(1996)利用50％哈茨木霉的发酵液对侵染水稻的拟禾本科根结线虫的致死率超过96％。Sankaranarayanan等(1998)研究哈茨木霉发酵液毒杀南方根结线虫和爪哇根结线虫的影响，结果表明24h后，哈茨木霉对两种线虫的致死率能达到100％。Pathak等(2003)研究哈茨木霉的发酵液对侵入水稻根部的拟禾本科根结线虫的影响，结果表明哈茨木霉能抑制线虫侵入寄主组织。除木霉菌对线虫的互作外，木霉菌还可诱导寄主植物的防卫反应，促进植物生长。Begum等(2004)利用绿色木霉和印楝渣混合对受木豆胞囊线虫和菜豆壳球孢侵染的绿豆进行处理，结果显示叶片中酚类化合物含量和过氧化物酶活性有明显升高，这两种物质能使植株产生对病原物和害虫的抗性。除此之外，Harman(2000)指出，木霉的生防机制可能还包括：在逆境中，如干旱、养分的胁迫下，通过加强根系和植株的发育提高耐性；可通过增加土壤中营养成分以及各种矿物质成分的溶解性，促进植株吸收；以及钝化病原菌的酶，促进植物生长。

综上所述，利用哈茨木霉对植物寄生线虫进行生物防治具有重大的理论研究意义和实际应用的潜力，但在世界范围内尤其是我国均未对其进行更深入的研究。本研究旨在利用哈茨木霉对植物寄生线虫的生物防治研究进行更全面、透彻的研究，以期发明新型线虫生防制剂，为我国植物寄生线虫的生物防治开辟新的途径。

发明内容：

本发明的目的是选择对根结线虫(Meloidogyne spp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)具高杀虫活性的真菌菌株，将菌株按常规液体发酵培养后，从代谢产物中提取具杀线虫活性物质的有效成分，开发杀线虫生物农药。

本发明筛选到的一株具有杀线虫活性的木霉菌菌株Snef85为哈茨木霉Trichodermaharzianum，已于2007年10月30日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：中国北京市朝阳区大屯路，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.2235。木霉菌Snef85是从人参土壤中筛选出的一株对根结线虫(Meloidogyne spp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoidesbesseyi)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)都具有良好杀线虫活性的真菌菌株。

本发明通过研究发现，土壤真菌有很多株真菌都具有较高的杀线虫活性，从这些真菌中筛选出一株性状相对最好的木霉菌菌株Snef85进行了进一步的研究。

本发明还涉及用于防治植物寄生线虫的真菌代谢物，其是由本发明木霉菌菌株Snef85经过常规的液体发酵培养后提取制备的。

本发明的木霉菌菌株Snef85是通过试管种培养后，再经扩大发酵培养来制备，其具体方法如下：

1.试管种培养

培养基配方为马铃薯琼脂(PDA)培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；蒸馏水1000mL。

2.液体发酵培养

其中液体发酵培养基为查氏培养基，配方为：NaNO₃：2.0g、K₂HPO₄：1.0g、KCl：0.5g、MgSO₄·7H₂O：0.5g、FeSO₄：0.01g、蔗糖：30.0g；蒸馏水：1000mL。

将试管种接种到100mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基中，25℃～28℃下，摇床转速以150r.min^-1～200r.min^-1、发酵168h。

本发明还涉及一种杀线虫制剂，其包含有效量的本发明所述的木霉菌菌株Snef85本身或其代谢物作为有效活性成分。

本发明的木霉菌菌株Snef85或其代谢物具有杀线虫活性物质，可用于植物寄生线虫的生物防治，特别是根结线虫(Meloidogyne spp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。

具体实施方式：

为了更详细地进一步阐明而不是为了限制本发明，给出了下列实施例。

首先对木霉菌菌株Snef85进行发酵培养，然后对发酵培养后的代谢产物进行杀线虫活性试验，确定其对线虫的作用。

实施例1：木霉菌菌株Snef85的培养

将木霉菌菌株Snef85的菌丝体接种到试管琼脂培养基上，培养基配方为PDA培养基，即马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂17g；蒸馏水1000mL。25℃培养10d，获得试管种。

再将试管种接种到100mL三角瓶(每瓶装50mL)液体培养基(查氏培养基)中，培养基配方为：NaNO₃：2.0g、K₂HPO₄：1.0g、KCl：0.5g、MgSO₄·7H₂O：0.5g、FeSO₄：0.01g、蔗糖：30.0g；蒸馏水：1000mL。25℃～28℃下，摇床转速以150r·min^-1～200r·min-¹、发酵168h。将发酵液配成不同的倍数进行杀线虫药效试验。

实施例2：木霉菌菌株Snef85的杀线虫活性：

将发酵液浓缩10×液的基础上依次稀释为1×(原液)、5×、8×、10×、15×、20×液6个浓度梯度，分别处理根结线虫(Meloidogyne spp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)和大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)。

1.制备试验用制剂

按前述液体发酵培养方法制备的木霉菌菌株Snef85，用不同倍数的发酵液进行杀线虫活性试验。

2.制备试验用线虫

根结线虫(Meloidogyne spp.)：采自沈阳浑南地区受根结线虫侵染的番茄。将番茄根系取出，用水轻轻冲洗，小心取下卵囊，放在1％的次氯酸钠中消毒3min、再用无菌水冲洗3次，放在内有少量无菌水的培养皿里，25℃恒温箱中培养，每隔24h收集一次新孵化的根结线虫J2。水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)：采自受水稻干尖线虫侵染严重的水稻稻粒。取发病严重的稻粒放在盛有无菌水的培养皿中，在25℃下，24h后用贝曼漏斗收集活的线虫。大豆胞囊线虫(Heterodera glycines)：大豆胞囊线虫3号生理小种采自本实验室的实验地。通过淘洗过筛法^[3]收集胞囊，0.5％的次氯酸钠表面消毒3min，用无菌水冲洗3次，放在含有少量无菌水的培养皿里，在25℃的恒温箱中培养，每隔24h收集一次新孵化的J2。。

3.试验方法：

3.1木霉菌菌株Snef85不同倍数发酵液处理相同时间对三种线虫的毒力作用：

在经灭菌的冠状小皿内中加入不同浓度的试验用发酵液各200μL，以加200μL无菌水作为对照，然后分别向处理和对照中各加入100μL线虫悬浮液(约含线虫30条)，放入25℃培养箱中，24h后观察线虫死亡情况，计算校正死亡率即为杀线虫药效。每处理重复3次。

3.2木霉菌菌株Snef85五倍稀释发酵液不同处理时间对各种线虫的毒力

在经灭菌的冠状小皿中加入200μL五倍稀释浓度的木霉菌菌株Snef85发酵液，分别加入各种线虫的悬浮液100μL，内含约30条线虫，放在25℃温箱中培养，设置3次重复，以加200μL无菌水作为对照。分别在6h、12h、24h和48h观察线虫的死亡情况，根据以下公式计算线虫的校正死亡率即为杀线虫药效。

试验3.1和3.2的操作均在无菌环境下进行，尽量避免环境和人为因素对试验结果的影响。

4.试验结果

4.1木霉菌菌株Snef85不同倍数发酵液处理相同时间对3种线虫的毒力作用

表1不同倍数发酵液处理相同时间对3种线虫的毒力作用

    发酵液稀释倍数  根结线虫校正  死亡率/％水稻干尖线虫校正死亡率/％大豆胞囊线虫校正死亡率/％    1    5    8    10    15    20  98.12Aa  93.21Aa  88.40Aa  59.56Bb  41.66Bc  13.85Cd  97.22Aa  92.13Aa  88.00Aa  50.54Bb  36.47Bc  3.32Bc    93.40Aa    83.43Aa    51.82Aa    36.97Bb    34.17Cc    23.00Dd

注：数字后字母为Duncan’s新复极差测验结果，不同大小写英文字母分别表示差异极显著(p＜0.01)和差异显著(p＜0.05)，下表同。

通过测定了不同倍数发酵液处理24h对各种线虫的毒力作用(见表1)，结果表明，不同倍数发酵液对不同的线虫有不同的作用效果。发酵原液(1×)作用根结线虫的校正死亡率为98.12％，而水稻干尖线虫的校正死亡率达到97.22％，大豆胞囊线虫的校正死亡率为93.40％。随着稀释倍数的增加，对各种线虫的毒力作用逐渐减弱。根结线虫和水稻干尖线虫在稀释10×时，对线虫的校正死亡率均能达到50％以上，对大豆胞囊线虫的校正死亡率较根结线虫和水稻干尖线虫差，为36.97％。5×发酵液稀释液对3种线虫的作用效果与原液的作用效果无明显差异，说明木霉菌的发酵液5×液时较合理的稀释倍数。

4.2木霉菌菌株Snef85五倍稀释发酵液不同处理时间对各种线虫的毒力作用

表2五倍稀释发酵液不同处理时间对各种线虫的毒力作用

    不同处理时间/h    根结线虫校正    死亡率/％水稻干尖线虫校正死亡率/％大豆胞囊线虫校正死亡率/％    6    12    24    48    35.14Aa    89.40Bb    94.38Bb    100.00Bb    0.00Aa    29.36Ab    91.80Bc    99.27Bc    16.88Aa    45.66Bb    88.35Cc    94.18Cc

木霉菌菌株Snef85发酵液5倍稀释液处理各种线虫结果发现，随着处理时间的延长，对各种线虫的死亡率有明显增加的现象。在处理6h内，未发现死亡的水稻干尖线虫，而对大豆胞囊线虫的校正死亡率为16.88％，处理12h，对根结线虫的校正死亡率明显多于其他种类线虫，处理12h后，水稻干尖线虫和大豆胞囊线虫的死亡速度加快，处理48h，根结线虫的校正死亡率达到100％。

通过以上用试验结果表明，木霉菌菌株Snef85是一株极具有应用价值的真菌，特别是对根结线虫(Meloidogyne spp.)、水稻干尖线虫(Aphelenchoides besseyi)和大豆胞囊线虫(Heteroderaglycines)的杀线虫作用，显示出其良好的应用开发前景。