法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2012-09-05
授权
授权
2008-07-16
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-05-21
公开
公开
技术领域：
本发明涉及一种用于外源性血液凝固检查的凝固检查用试剂及其生产方法。
背景技术：
凝血致活酶是一种被称为组织因子的蛋白质和磷脂的复合物。凝血致活酶参与血液凝固。因此，凝血致活酶被应用于各种凝固检查。比如，综合性检测血中第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的凝固功能的凝血检查用试剂中含有牛脑组织凝血致活酶、纤维蛋白原、第V因子、钙和磷脂。
凝血检查用试剂的主要成份之一牛脑组织凝血致活酶是磷脂结合到被称为组织因子的蛋白质中生成的复合物。组织因子正如高榎裕子(音译)等人所著文献(“cDNA and amino acid sequences of bovine tissue factor”，Biochemical and Biophysical Research Communications，Vol.181，1991，pages1145-1150)的图3所示，全部氨基酸数为257个的蛋白质。组织因子由从N末端到第213位的细胞外区(可溶性细胞区)、从第214到第236位的跨膜区和从237到257位的细胞内区组成。
有此种结构的凝血致活酶历来以牛大脑为原料通过用丙酮粉或生理盐水提取凝血致活酶的方法生产。
作为原料使用的牛大脑是疯牛病(BSE)的高感染部位之一。因此，近年来，生产现场发出了不使用牛大脑作原料的呼声。
有报告称可以利用遗传工程学技术生产作为检测试剂成份之一的具有活性的重组组织因子基因。例如WO 93/07492、WO 98/48283，Cheryl LBrucatol等所著文献(“Expression of recombinant rabbit tissue factor in Pichiapstoris，and its application in a prothrombin time reagent”，Protein Expressionand purification，Vol.26，2002，pages 386-393)。
具体而言，根据WO 93/07492，先在大肠菌中表达重组人组织因子遗传基因，再运用固定针对人组织因子的单克隆抗体的亲和色谱法，纯化重组人组织因子。并将纯化的重组人组织因子应用到凝血致活酶试剂。
根据Cheryl L Brucatol等所著文献，在酵母中表达重组兔组织因子(rTF)，然后利用组氨酸标记纯化rTF，将所得rTF应用到凝血酶原时间测定试剂。此文献报告称，所表达的兔组织因子是由细胞内区、跨膜区和细胞外区组成的全长因子。
同样，WO 98/48283也是在酵母中表达由细胞外区、脂质结合区、细胞内区构成的全长重组兔组织因子，然后利用有选择性地放大重组组织因子的组氨酸标记，纯化重组兔组织因子。将纯化的兔组织因子应用于凝血酶原时间测定试剂。
如上所述，上述任何一种形式都使用经色谱法等纯化的重组组织因子来防止来源于宿主细胞的不纯物混入试剂所造成的试剂凝固活性降低和测定精度降低等问题。然而，要纯化重组组织因子，必须构筑有效分离、去除来源于宿主细胞的不纯物的体系。当大量生产重组组织因子时，这种纯化工作费时、费力、费成本，给重组组织因子的生产效率带来问题。
比如使用特异性抗体的亲和色谱法在大量纯化、生产时，特异性抗体的使用是造成高成本的原因。
使用组氨酸标记的亲和色谱法作为适于大量生产的纯化方法在重组兔组织因子中已经实用化。然而，根据宿主的种类和组织因子的种类不同，有些种类中组氨酸标记与重组组织因子的结合会影响凝固活性。因此，这种纯化方法一般在纯化后切断组氨酸标记。追加这种标记切断步骤，是生产成本增加的原因。
有些种类的组织因子由于其立体结构，即使使用组氨酸标记的色谱法也不能很好地纯化。
由于上述原因，在使用遗传工程学技术的组织因子生产中，有必要构筑一个既不影响凝固活性、又能满足成本和产量等生产率的生产体系。而且，人们希望有一种凝固检查试剂能够应用所构筑的生产体系生产的组织因子。
发明内容：
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
本发明的第一方面提供一种凝固检查用试剂，包含：
磷脂与以昆虫或昆虫培养细胞为宿主所获得的重组组织因子的复合物；以及
来源于所述昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。
所述重组组织因子为具有可溶性区域和跨膜区的重组牛组织因子。
所述重组组织因子有序列号1所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1个或数个氨基酸被缺失、附加或取代而获得的氨基酸序列。
所述重组组织因子所具有的氨基酸序列与序列号1所示的氨基酸序列有至少95％的相同性。
所述昆虫为鳞翅目昆虫，所述鳞翅目昆虫是家蚕。
所述来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份包含来源于所述昆虫或昆虫培养细胞的可溶性蛋白质。
所述凝固检查用试剂是第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂、肝促凝血活酶试验用试剂或凝血致活酶时间用试剂。
所述试剂，还包含选自于由第I因子、第V因子、硫酸钡吸附血浆和钙离子构成的组群中的至少一种成份。
本发明的第二方面提供一种凝固检查用试剂的生产方法，包括以下步骤：将组织因子的cDNA插入杆状病毒(BacuLovirus)DNA中获得重组杆状病毒，让昆虫或昆虫培养细胞感染此重组杆状病毒；在上述昆虫或昆虫培养细胞中表达用上述cDNA编码的重组组织因子；破碎表达上述重组组织因子的昆虫或昆虫培养细胞，从含所得破碎物的溶液中去除不溶性成份，获得含上述重组组织因子的可溶性组份；以及混合上述可溶性组份和磷脂，生成上述重组组织因子和磷脂的复合物。
所述cDNA对牛组织因子的可溶性区域和跨膜区编码。
所述cDNA对具有序列号2所示的氨基酸序列、或由所述氨基酸序列中的1个或数个氨基酸被缺失、附加或取代而获得的氨基酸序列的重组组织因子进行编码。
所述cDNA所编码的重组组织因子有与序列号2所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
所述方法，在获得所述可溶性组份的步骤中，含破碎物的溶液含有表面活性剂
附图说明：
图1为显示含有重组组织因子的溶液SW的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结果的照片。
图2为显示含有重组组织因子的溶液SF的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果的照片。
图3为对照试剂1的活性值与试剂SW的活性值的关系图。
图4为对照试剂1的活性值与试剂SF的活性值的关系图。
图5为在使用实施例中制备的PIVKA感受性试验用试剂的测定中血浆的稀释倍率和凝固时间的关系图。
具体实施方式：
作为本发明一实施方式的凝固检查用试剂包括：磷脂与以昆虫或昆虫培养细胞为宿主获得的重组组织因子的复合物以及来源于上述昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。
此凝固检查用试剂含有用遗传工程学技术制造的重组组织因子，还含有宿主为昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。但是，它显示出能够与含有天然凝血致活酶的传统凝固检查用试剂相匹敌的凝固活性和敏感度。
因此，此凝固检查用试剂由于使用重组组织因子取代天然凝血致活酶，所以在生产现场可以不使用造成疯牛病等原因的大脑，非常安全。而且，此凝固检查用试剂在其生产方法中可以简化重组组织因子的纯化工序，故具有优越的生产效率并可期望降低生产成本。
重组组织因子和该组织因子的磷脂复合物
首先，就用于凝固检查用试剂的重组组织因子和该重组组织因子与磷脂的复合物(以后也称重组组织因子-磷脂复合物)进行说明。
重组组织因子由以昆虫或昆虫培养细胞为宿主、通过遗传工程学方法生成的。作为重组组织因子有如通过遗传工程学方法生成的重组牛组织因子、重组兔组织因子和重组人组织因子等。
天然组织因子通过与磷脂复合，激活来源于人血的第VII因子。因此，作为重组组织因子至少应该有天然组织因子的可溶性区域和跨膜区。重组组织因子的可溶性区域是与第VII因子相互作用所需的区域，跨膜区则是合成与磷脂的复合物所必需的区域。
更理想的重组组织因子应该是在不破坏其与磷脂合成复合物、激活第VII因子的能力的范围内具有可溶性区域、跨膜区和细胞内区。如以重组牛组织因子为例，序列号1所示氨基酸序列中的数个氨基酸被取代、附加或缺失，但可与磷脂合成复合物，激活第VII因子。具体而言，重组组织因子以其序列至少95％与序列号1所示氨基酸序列相同为宜，重组组织因子其序列至少97％与序列号1所示氨基酸序列相同更好，重组组织因子的序列最好至少99％与序列号1所示氨基酸序列相同。
在此，序列号1为上述高榎裕子(音译)等人所著文献的图3所示正常牛组织因子的氨基酸序列。即，在序列号1中，从第1位氨基酸到第213位氨基酸为可溶性区域(细胞外区)，从第214位氨基酸到第236位为跨膜区，从第237位到第257位为细胞内区。
上述重组组织因子通过以昆虫或昆虫培养细胞为宿主的遗传工程学方法生成。详待后述。
重组组织因子-磷脂复合物是磷脂结合到上述重组组织因子的跨膜区的产物，而且具有与天然凝血致活酶(磷脂复合物型的天然组织因子)同等程度的凝血活性。这种复合物用众所周知的方法通过重组组织因子与磷脂混合即可制备。比如，可以用WO 93/07492、WO 98/48283和上述Cheryl LBrucatol等人的文献所记载的方法制造。
用于合成复合物的磷脂以含有一般碳原子数为12～22的脂肪酸的磷脂为宜。脂肪酸可以是饱和脂肪酸也可以是不饱和脂肪酸。具体而言，理想的磷脂有：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油和磷脂酰丝氨酸等。这些磷脂也可以是天然物或合成品之一。这些磷脂也可以有不同种类的脂肪酸。而且，这些磷脂根据所希望的性状、特性等也可以将二种混合用于复合物的合成。
凝固检查用试剂
作为本发明实施方式的凝固检查用试剂含有上述重组组织因子-磷脂复合物或获得重组组织因子时使用的来源于宿主昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。
凝固检查用试剂所含重组组织因子是用以昆虫或昆虫培养细胞为宿主的遗传工程学方法获得的基因。作为宿主使用的昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份是与重组组织因子一起从宿主中提取出来的，最终与重组组织因子一起含在凝固检查用试剂中。
作为宿主使用的昆虫，对其种类没有限定。作宿主用的昆虫可以使用鳞翅目昆虫。在鳞翅目昆虫中尤以家蚕(学名：Bombyx mori)更好。
用作宿主的昆虫如可以有Sf9、Sf21、HiFive等。其中，以使用Sf9更好。
从宿主中提取重组组织因子时，首先要在水和缓冲液等适当溶液中破碎作为宿主的昆虫或昆虫培养细胞。然后通过过滤和离心分离等从含有破碎所得破碎物的溶液中除去不溶成份。来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份是通过过滤从含昆虫或昆虫培养细胞破碎物的溶液中除去不溶性成份所得滤液中可能含有的成份。或来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份是通过离心分离从含昆虫或昆虫培养细胞破碎物的溶液中除去不溶成份所得上清液中可能含有的成份。比如，溶在昆虫体液中的成份、溶在昆虫培养细胞的细胞质溶胶(细胞溶胶)中的成份等。具体而言，含有构成昆虫或昆虫培养细胞的可溶性蛋白质、水溶性糖链或昆虫或昆虫培养细胞产生的可溶性蛋白等。
凝固检查用试剂含有上述重组组织因子-磷脂复合物和上述昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。也可根据凝固检查用试剂的种类(即要检测的凝固因子的种类)适当地在试剂中添加凝固因子、钙离子和磷脂等。
比如，如果凝固检查用试剂为第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂，则试剂含有重组牛组织因子-磷脂复合物、昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。作为其他成份，试剂最好还含有第I因子、第V因子和钙离子。也可以用除去第II因子、第VII因子、第IX因子和X因子的血浆取代添加第I因子和第V因子。该血浆最好使用用硫酸钡吸附血浆(以牛血浆为宜)所得的硫酸钡吸附血浆。硫酸钡吸附血浆可以在血浆(以牛血浆为宜)中添加硫酸钡，混合后再除去硫酸钡来制备。
如果凝固检查用试剂为综合性检测第II、第VII、第X因子的凝固功能的肝促凝血活酶试验(Hepaplastin Test、HPT)用试剂，则试剂含有重组兔组织因子-磷脂复合物、昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。作为其他成份，试剂最好还含有第I因子、第V因子和钙离子。也可以用除去第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的血浆取代添加第I因子和第V因子。
如果凝固检查用试剂为凝血活酶时间用试剂，则试剂含有重组兔组织因子-磷脂复合物或重组人组织因子-磷脂复合物及昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。作为其他成份，试剂最好还含有钙离子。
上述钙离子源一般从氯化钙、乳酸钙和葡萄糖酸钙等选择。
根据需要，也可以在试剂中添加选自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、BISTRIS、Glycine等组群的缓冲液，使其PH值达5～9、最终浓度约为10～100MM。
有以上组份的凝固检查用试剂虽然含有来源于获取重组组织因子时使用的宿主昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份，但尽管如此，凝固检查用试剂也具有可以与天然凝血致活酶试剂相匹敌的凝固活性。当凝固检查用试剂为含有重组牛组织因子-磷脂复合物的第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂时，在对维生素K缺乏或拮抗剂诱导的蛋白质(PIVKA：protein inducedin vitamin K absence or antagonists)的感受性上，凝固检查用试剂也不亚于使用天然凝血致活酶的第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂。因此，凝固检查用试剂也可以作为用于监视华法林(Warfarin)等疗效的试剂使用。
所谓PIVKA是无正常凝血因子活性的前驱体的总称。PIVKA在维生素K缺乏或维生素K拮抗物存在的情况下出现在血液中。比如，凝血因子中第II、第VII、第IX和第X因子都在肝脏合成。在其合成的最后阶段需要维生素K。因此，当维生素K缺乏症、用华法林等维生素K抑制剂时，这些因子以无正常凝血因子活性的前驱体出现在血液中。Hemker等人的文献(“Kinetic aspects of the interaction of blood clotting enzymes.III.Demonstration of an inhibitor of prothrombin conversion in vitamin Kdeficiency.”，Thromb Diath Haemorrh，Vol.19，pages 346-363，1968)和Denson等人的文献(Denson KW，Reed SV，Haddon ME.“Validity of the INR systemfor patients with liver impairment.”，Thromb Haemost，Vol.73，pases 162，1995)报告称，牛组织因子对PIVKA的感受性高，兔组织因子和人组织因子对PIVKA的感受性低。因此，现在检测华法林等疗效时多利用含牛组织因子的第II、第VII、第IX和第X因子测定用试剂。使用含牛组织因子的第II、第VII、第IX和第X因子测定用试剂进行的检测也称为凝血试验(Thrombotest)。
凝固检查用试剂的生产方法
凝固检查用试剂的生产方法包括以下步骤：将组织因子的cDNA插入杆状病毒DNA获得重组杆状病毒，让昆虫或昆虫培养细胞感染杆状病毒；让被上述cDNA编码的重组组织因子在上述昆虫或昆虫培养细胞中表达；破碎表达上述重组组织因子的昆虫或昆虫培养细胞，从含有上述所得破碎物的溶液中除去不溶性成份，获得含上述重组组织因子的可溶性成份；以及混合上述可溶性成份和磷脂，合成上述重组组织因子与磷脂的复合物。
在生产方法中使用的组织因子的cDNA是用于目标凝固检查用试剂的组织因子的cDNA。组织因子的cDNA至少有编码可溶性区域的碱基序列和编码跨膜区的碱基序列。组织因子的cDNA最好有能够编码组织因子的可溶性区域、跨膜区和细胞内区全部区域的碱基序列。比如，以牛组织因子为例，最好使用能够对序列号2所示氨基酸序列(AAB20 7 55)的碱基序列编码或能够对该氨基酸序列中一个或数个氨基酸取代、附加或缺失的氨基酸序列编码的碱基序列。具体而言，以能够对与序列号2所示氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列编码的碱基序列为宜，能够对至少97％相同的氨基酸序列编码的碱基序列更好，最好是能够对至少99％相同的氨基酸序列编码的碱基序列。更具体地说，可以使用能够从Clonetech公司和Stratagene公司的cDNA库等得到的牛组织因子的cDNA。
将这种cDNA插入杆状病毒DNA中，制备重组杆状病毒。
杆状病毒作为基因有双链环状DNA。杆状病毒是昆虫病原病毒。作为杆状病毒如有核型多角体病毒(NPV：nucleopolyhedrovirus)、GN(geanulovirus)等。作为杆状病毒以使用NPV为宜。NPV是一种在感染的细胞内大量合成被称为多角体的蛋白质的病毒。对这种多角体蛋白质编码的基因在杆状病毒扩增中是不需要的。通过将目标组织因子的cDNA插入多角体基因的启动子下游取代多角体基因即可以在感染细胞内大量合成目标组织因子。
作为杆状病毒，最好使用人为地使半胱氨酸蛋白酶基因缺失的杆状病毒，以避免病毒产生的半胱氨酸蛋白酶造成蛋白质分解的影响。
导入了组织因子cDNA的重组杆状病毒可以用众所周知的重组技术制备。比如，将组织因子cDNA插入杆状病毒转移载体。将所得转移载体和杆状病毒DNA转染到昆虫细胞。在昆虫细胞内生成相同的重组，以此即可构建组织因子cDNA被插入杆状病毒DNA的重组杆状病毒。当使用含杆状病毒的大肠杆菌DH10 Bac(Gibco BRL公司)时，通过将插入组织因子cDNA的转移载体转染到大肠杆菌DH10 Bac，即可构建重组杆状病毒。
然后，让作为宿主的昆虫或昆虫培养细胞感染构建的重组杆状病毒。
如果宿主是昆虫，则对昆虫种类没有特别限定。用作宿主的昆虫最好是鳞翅目昆虫。鳞翅目昆虫中尤以家蚕(学名：Bombyx mori)更好。对蚕的种类无特别限定，最好使用裸蛹家蚕。裸蛹家蚕是结茧基因变异的一种。因此，裸蛹家蚕化蛹但不结茧。这种裸蛹家蚕已知有比如Nd、Ndb、Nd-s和Nd-t系统的家蚕。最好使用这种蚕的蛹。蛹存在于家蚕幼虫的消化管中用于分解食物(桑)的丝氨酸蛋白酶活性比蚕虫体低得多。可以利用这一点防止在蚕内表达的蛋白质分解。蚕蛹对杆状病毒的感受性比幼虫高。因此，病毒很容易在蚕蛹内增殖，可使大量组织因子表达。
当宿主是昆虫培养细胞时，可使用Sf9、Sf21、HiFive等培养的昆虫培养细胞。其中尤以Sf9为宜。
使用昆虫培养细胞时，作为表达的生成蛋白的组织因子可以在细胞外分泌也可在细胞内积累。
作为感染方法可以利用众所周知的方法。比如，当宿主为昆虫时，可以运用向昆虫注射病毒液的注射法、将涂有微量病毒液的针给昆虫接种的微量接种法。或者将重组杆状病毒转染到昆虫培养细胞，将所得昆虫培养细胞培养一定时间使重组杆状病毒增殖，再将增殖的昆虫培养细胞接种到昆虫，这样也可以让昆虫感染病毒。使用昆虫培养细胞作为宿主时，可以通过在含有病毒的培养液中培养昆虫培养细胞一定时间，让昆虫培养细胞感染病毒。
当宿主为昆虫时，饲养感染昆虫5～10天。在饲养过程中，插入重组杆状病毒的cDNA在宿主内表达，在昆虫内生成目标组织因子。生成的组织因子在昆虫内积蓄。在昆虫内积蓄的组织因子可以认为其N端经翻译后的处理已经被切断。比如，以重组牛组织因子为例，在昆虫内积蓄的重组牛组织因子为序列号1所示因子。
饲养一定时间后，将生成的组织因子从宿主中提取出来。
当宿主为昆虫培养细胞时，将昆虫培养细胞与病毒液一起培养2～7天。培养过程中，插入重组杆状病毒的cDNA在宿主内表达，在昆虫培养细胞内生成目标组织因子。生成的组织因子在培养细胞内积蓄或在培养基内分泌。与宿主为昆虫的情况一样，在昆虫培养细胞内，可以认为其N端经翻译后的处理已经被切断。比如，以重组牛组织因子为例，在昆虫培养细胞内积蓄的重组牛组织因子为序列号1所示因子。
培养一定时间后，将生成的组织因子从培养细胞内或培养基内提取出来。
如果以昆虫为宿主，组织因子可以通过以下方法从昆虫提取。先破碎有重组组织因子表达的昆虫。从含所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。这样就可以获得含有上述重组组织因子的可溶性成份。
昆虫可以用搅拌器、均质器、搅切器(blender)和超声波等机械粉碎。机械处理还可以配合使用表面活性剂等非机械处理使用。昆虫的破碎最好在水和缓冲液等适当溶液中进行。这种溶液以下称“破碎处理液”。破碎处理液如有水、磷酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液等缓冲液以及添加表面活性剂的缓冲液等。
从含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通过过滤、离心分离或这些方法适当组合使用。
若以昆虫培养细胞为宿主，则组织因子可以通过如下方法从昆虫培养细胞和培养基抽取。首先破碎表达重组组织因子的培养细胞。从含有所得破碎物的溶液中除去不溶性成份。如此即可获得含有上述重组组织因子的可溶性成份。
培养细胞可用均质器和超声波等机械破碎。培养细胞还可用表面活性剂等非机械破碎溶解。也可将机械处理与非机械处理配合使用。培养细胞的破碎与以昆虫为宿主时一样，最好在适当破碎处理液中进行。从含有破碎物的溶液中除去不溶性成份可通过过滤、离心分离或这些方法适当组合使用。
含破碎昆虫或昆虫培养细胞所得破碎物的溶液中含有含重组组织因子的可溶性组份。可溶性组份含有重组组织因子和来源于宿主昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份。含破碎物的溶液中除含此可溶性组份外，还含有导入基因时使用的杆状病毒。表面活性剂有抑制此病毒活性的作用，因此最好在抽取上述重组组织因子时使用表面活性剂。作为表面活性剂可用非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂任何一种。从杀菌性看，最好使用非离子型表面活性剂作为表面活性剂。而且添加非离子型表面活性剂还可促进重组组织因子的溶解。
所谓破碎处理液，如上所述，是破碎宿主昆虫和昆虫培养细胞时使用的溶液。作为破碎处理液如有水、磷酸缓冲液和三羟甲基氨基甲烷缓冲液等缓冲液以及添加表面活性剂的缓冲液等。在破碎处理液中破碎昆虫和昆虫培养细胞，生成的重组组织因子和来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份会溶解在破碎处理液中。
在此，所谓来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份指可溶于破碎处理液的成份，因此，即使在通过过滤和离心分离等方法从含有破碎物的溶液中除去不溶性成份后，仍然可含在经过滤除去不溶性成份所得滤液和经离心分离除去不溶性成份所得上清中。昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份如有昆虫体液或溶于昆虫培养细胞的细胞质溶胶(胞质溶胶)的成份。具体而言，如有构成昆虫或昆虫培养细胞的可溶性蛋白质、水溶性糖链、昆虫或昆虫培养细胞产生的可溶性蛋白等。
所谓不溶性成份指不溶于上述破碎处理液的成份。具体而言，如有破碎的角质层和细胞膜等固体成份、脂蛋白、脂质和不溶性蛋白质等。
如此从含有破碎物的溶液中除去不溶性成份，获得不溶性成份去除液。作为不溶性成份去除液，具体来说，有过滤含破碎物溶液所得滤液和离心分离含破碎物溶液所得上清等。而且这种不溶性成份去除液可作为含重组组织因子的溶液(以下称“重组组织因子含有液”)使用。
还可以HEPES等缓冲液(pH6～7)等为外液透析除去不溶性成份后的不溶性成份去除液。也可将透析后所得不溶性成份去除液作为重组组织因子含有液使用。
重组组织因子-磷脂复合物的合成可以按照常规方法进行(参照MethodsEnzymol.，222，p173，1993等)。尤以在有镍参与的条件下混合重组组织因子含有液和磷脂溶液，合成复合物为佳。
重组组织因子-磷脂复合物的合成工序在过滤、离心分离等除去不溶性成份后进行即可。如果要透析不溶性成份去除液，则复合物合成工序既可在透析后，也可在透析前进行。盐析也同样，复合物合成工序既可在盐析后，也可在盐析前进行。
上述磷脂溶液含有合成复合物所用的磷脂。作为磷脂最好使用有碳原子数为12～22的脂肪酸或不饱和脂肪酸的磷脂。具体而言，可使用上述重组组织因子-磷脂复合物例示的磷脂。重组组织因子含有液和磷脂液的克分子比率约为1∶10～1∶2×107范围为宜，1∶3000～1∶15000更好。
作为镍，可使用氯化镍和硫酸镍等镍盐水溶液或将镍溶解在缓冲液中形成的溶液。
将以上重组组织因子含有液、磷脂液和镍盐溶液混合搅拌，反应约1～2个小时，即可合成组织因子和磷脂的复合物。
当要生产的凝固检查用试剂含有钙离子时，在生产过程中添加氯化钙、乳酸钙和葡萄糖酸钙等作为钙离子源。
当要生产的凝固检查用试剂是第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂时，在生产过程中，添加第I因子和第V因子。也可用除去第II因子、第VII因子、第IX因子和第X因子的血浆取代第I因子和第V因子。作为该血浆也可使用用硫酸钡吸附血浆(最好是牛血浆)获得的硫酸钡吸附血浆。硫酸钡吸附血浆的配制无特别限定，比如可以用Charles等所著文献(“One-stage Prothrombin Time techniques”，Thrombosis and BleedingDisorders Theory and Method，1971，p92-97)中记述的Owren等方法配制。
另外，在生产过程中，根据需要，还可按pH5～9、最终浓度约10～100mM添加选自HEPES、TRIPS、MOPS、PIPES、B ISTRIS、Glycine等组群中的缓冲液。
根据需要添加的第I因子和第V因子(或硫酸钡吸附血浆等)、钙离子源、缓冲剂等既可以在牛组织因子-磷脂复合物合成前添加，也可以在复合物合成后添加。对第I因子和第V因子、钙离子源、缓冲剂等的添加顺序也没有特别限定。
如上制备的凝固检查用试剂含有重组组织因子-磷脂复合物和作为凝固检查用试剂不可缺少的成份。在此，作为凝固检查用试剂不可缺少的成份，具体而言，如果是凝血酶原时间测定试剂，则有钙离子。如果是第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂或肝促凝血活酶试验用试剂，则有钙、第I因子和第V因子。也可以用硫酸钡吸附血浆取代第I因子和第V因子。用上述配制方法制备的凝固检查用试剂含有上述重组组织因子构建中使用的宿主的可溶性成份。本发明人发现宿主(昆虫或昆虫培养细胞)的可溶性成份不影响检查中的凝血反应。基于这一发现，在抽取用遗传工程学生产的重组组织因子的过程中，即使不使用色谱法等对重组组织因子进行高度纯化，实际上也可以提供没有问题的凝固检查用试剂。因此，用上述凝固检查用试剂的配制方法简化了遗传工程学方法生产重组组织因子的纯化步骤，可望降低生产成本。
实例
以家蚕为宿主的重组组织因子的生成
购买牛脑的cDNA库(Clonetech公司)，根据非专利文献1的方法用PCR扩增牛组织因子的基因，克隆对牛组织因子的可溶性区域和跨膜区编码的全长牛组织因子编码遗传基因。用PCR法扩增时，作为上游引物使用有BgIII片段的引物(5′-agatctatggcgacccccaacgggcc)，作为下游引物使用有EcoRI片段的引物(5′-acttaagaatacgtcgcaactcgccgc)。用DNA sequencer(DNA测序仪(4200型、莱卡))对克隆基因的碱基序列进行测序，确认是序列号2的蛋白质编码的DNA。
将克隆的cDNA插入半胱氨酸蛋白酶基因缺失病毒(片仓工业、pYNG)的克隆细胞，获得重组杆状病毒。以此构建杆状病毒表达体系，使牛组织因子表达。
让蚕蛹感染重组杆状病毒，5℃放置7天，使之充分感染。
用均质器在缓冲液中破碎感染后的蚕蛹。通过过滤和离心分离等方法从所得破碎液中除去固形成份。在此，从牛组织因子cDNA插入杆状病毒到除去固形成份的过程中均使用片仓工业株式会社的“Superworm”服务。
从片仓工业株式会社购买除去固形成份的溶液，再对此溶液进行均质化(AS-1会社、转数5000rpm10冲程)和离心分离(3000×G、8℃、10分)处理。回收上清，向8容量上清添加2容量的10％NP-40表面活性剂(Calbiochem公司)。所得混合液的NP-40表面活性剂最终浓度为2％。然后，30℃培养混合液3小时，让杆状病毒失活，同时对重组组织因子增溶。
杆状病毒失活的确认是根据Reed-MuencH法(Reed，L.J.andMuench，H.：Amer.J.Hyg.，27，493(1938))用显微镜目测有无病毒感染来确认混合液的病毒价。
离心分离(3000×G、8℃、30分钟)混合液，得除去脂朊和脂质成份的上清。接下来将所得上清用20MM HEPES(150MM氯化钠缓冲液(pH7.2))透析(透析用纤维素管、三光纯药株式会社)。透析后，抽取透析管内的溶液，以此作为重组牛组织因子含有液SW。此重组牛组织因子含有液SW含重组牛组织因子和来源于家蚕的可溶性成份。
以Sf9为宿主的重组牛组织因子的生产
购买牛脑的cDNA库(Stratagene公司)，根据非专利文献1的方法用PCR扩增牛组织因子的基因，克隆对牛组织因子的可溶性区域和跨膜区编码的全长牛组织因子编码遗传基因。用PCR法扩增时，作为上游引物使用有BamHI片段的引物(5′-ggatccatggcgacccccaacgggccccg)，作为下游引物使用有XhoI片段的引物(5′-ctcgagttatgcagcgttgagcggcgtg)。用4000L DNAsequencer(LI-COR公司)对克隆基因的碱基序列进行测序，确认是序列号2的蛋白质编码的DNA。
用BamHI和XhoI消化克隆的cDNA后，将其插入转移载体pFast Bac(GIBCO BRL公司)。将此pFast Bac转移到含有杆状病毒基因组DNA的大肠杆菌DH10 Bac。最终得到导入了牛组织因子的cDNA的杆状病毒(牛组织因子重组杆状病毒)。将重组杆状病毒转染到昆虫培养细胞Sf9，培养72小时后得到P1病毒。然后让Sf9感染P1病毒，在含10％FBS的格雷斯介质(Grace Medium)(invitrogen公司)中培养4天得P2病毒。将所得P2病毒感染到其他Sf9，将感染的Sf9在Sf-900II无血清介质(Serum FreeMedium)(invitrogen公司)中培养。获取培养后的Sf9。用三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.5、含1％CHAPS)从获得的Sf9中抽取重组牛组织因子，制备重组牛组织因子含有液SF。此重组牛组织因子含有液SF含有重组牛组织因子和来源于Sf9细胞的可溶性成份。
用重组牛组织因子含有液作SDS-PAGE
用在以上配制方法过程中获得的重组牛组织因子含有液SW和重组牛组织因子含有液SF进行SDS-PAGE(十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳)。
在10μL重组牛组织因子含有液SW中添加SDS上样缓冲液pH7.5(含200MM Tris、72MM甘氨酸、0.02％SDS)10μL。将所得混合液100℃沸腾5分钟，制备SDS用试样(SDS用试样SW)。
将所得SDS用试样SW10μL注入5～10％聚丙烯酰胺梯度凝胶孔，用电泳槽(微型蛋白质II电泳装置(日本伯乐生命医学产品株式会社))加电50V泳动3小时。泳动后用银色染色试剂盒(第一化学药品株式会社)对聚丙烯酰胺凝胶染色。其结果如图1所示。在图1中，条带1为分子量标记(标准品、日本伯乐生命医学产品株式会社))，条带2为SDS用试样SW的泳动结果。重组牛组织因子的条带出现的位置(约是分子量40kDa的位置)用箭头表示。
在10μL重组牛组织因子含有液SF中添加2×SDS上样缓冲液pH7.5(含200MM Tris、72MM甘氨酸、0.02％SDS)10μL。将所得混合液100℃沸腾5分钟，制备SDS用试样(SDS用试样SF)。
将所得SDS用试样SF10μL注入5～10％聚丙烯酰胺梯度凝胶孔，用电泳槽(微型蛋白质II电泳装置(日本伯乐生命医学产品株式会社))加电100V泳动1小时。泳动后用CCB染色试剂盒(和光纯药工业株式会社)对聚丙烯酰胺凝胶染色。其结果如图2所示。在图2中，条带1为分子量标记(标准品、日本伯乐生命医学产品株式会社))，条带2为SDS用试样SF的泳动结果。重组牛组织因子的条带出现的位置(约为分子量40kDa的位置)用箭头表示。
由图1和图2的结果可以看出，重组牛组织因子含有液SW中和重组牛组织因子含有液SF中除重组牛组织因子外还含有大量来源于宿主的蛋白质。
由图1的结果可以认为，重组牛组织因子在重组牛组织因子含有液SW中的纯度约为5～10％左右。
由图2的结果可以认为，重组牛组织因子在重组牛组织因子含有液SF中的纯度约为1～5％左右。
重组牛组织因子-磷脂复合物的合成
先将基础大豆卵磷脂0.4g(日清制油株式会社)溶解到0.25％去氧胆酸钠DOC(20ML)中。用旋转混合器在室温下让基础大豆卵磷脂完全溶解，在该混合液中悬浮1，2-油烯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(1，2-oleyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine)0.1g和1，2-二油烯基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸(1，2-dioleyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine)0.3g(均为Avanti polar lipid、Inc.产品)，配制磷脂溶液。
在此磷脂溶液37.5ML中添加0.5M氯化镍溶液5ML、10MM HEPES缓冲液(pH 7.3)5.0ML和上述重组牛组织因子含有液(重组牛组织因子含有液SW或重组牛组织因子含有液SF)2.5ML。将所得混合液旋涡搅拌30秒。搅拌后用BRANSON#2210型超声波装置在37℃下让混合液反应15分钟后，37℃放置1小时。将混合液移至透析膜(透析用纤维素管、三光纯药工业株式会社)，用10MM HEPES(含0.15M氯化钠)pH7.3进行三次透析，得透析管内经透析后的溶液，将此作为牛组织因子-磷脂复合物含有液(重组牛组织因子-磷脂复合物含有液SW或重组牛组织因子-磷脂复合物含有液SF)使用。
第II、第VII、第IX、第X因子检查用试剂的制备
(1)硫酸钡吸附血浆的配制
在添加了柠檬酸的牛血浆中加入牛血浆的30w/v％量的硫酸钡和牛血浆的20v/v％量的生理盐水，用旋转混合器搅拌60分钟。
将此混合液以4℃5000rpm离心分离15分钟后，回收上清。在此上清中逐滴添加该上清的30w/v％量的硫酸钡。这样，血浆中的第II、第VII、第IX、第X因子即吸附于硫酸钡中。然后，再离心分离，回收上清。将该上清注入透析管(透析用纤维素管、三光纯药工业株式会社)，以生理盐水为外液在2～8℃进行透析。用0.45μm的滤膜过滤透析管内经透析后的溶液。以所得滤液为硫酸钡吸附血浆，用于以下试剂的制备。
(2)第II、第VII、第IX、第X因子检查用试剂的制备
将上述配制的牛组织因子-磷脂复合物含有液和硫酸钡吸附血浆以及40mM HEPES缓冲液(含pH7.3、4mM乳酸钙)以1∶2∶1的比率混合搅拌，制备第II、第VII、第IX、第X因子检查用试剂。在此，以用重组牛组织因子-磷脂复合物含有液SW制备的第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂为试剂SW，以用重组牛组织因子-磷脂复合物含有液SF制备的第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂为试剂SF。
例1
来源于蚕的可溶性成份对凝血活性的影响
基于上述制备方法制备试剂SW3批(SW-1、SW-2和SW-3)。
由未感染杆状病毒的家蚕按上述制备方法制备第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂SW。以此为试剂SW(未感染)。试剂SW(未感染)中虽然含有来源于家蚕个体的可溶性成份，但是不含来源于重组牛组织因子和杆状病毒的可溶性成份。
再让蚕蛹感染未插入牛组织因子cDNA的杆状病毒，根据上述制备方法从感染的蚕蛹制备第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂SW。以此为试剂SW(不含cDNA)。试剂SW(不含cDNA)中虽然含有来源于蚕蛹个体及来源于杆状病毒的可溶性成份，但是不含重组牛组织因子。
用这五种试剂(SW-1、SW-2、SW-3、SW(未感染)和SW(不含cDNA))分别用全自动凝血分析仪Coagrex-800(岛津制作所(株))测定正常血浆的凝固时间(秒)。再将上述五种试剂以生理盐水稀释2倍、稀释4倍、稀释8倍制备稀释试剂，用这些稀释试剂同样测定正常血浆的凝固时间(秒)。作为正常血浆，使用的是正常值质控血浆N(希森美康(株))。用各种试剂获得的凝血时间(秒)的结果如表1所示。
表1
在表1中，当使用试剂SW(未感染)和试剂SW(不含cDNA)时，没有检测出凝固时间。而当使用试剂SW-1、试剂SW-2、试剂SW-3时，检测出凝固时间。由此得知，试剂中所含来源于蚕个体的可溶性成份和来源于杆状病毒的可溶性成份不引起凝血反应。
而且，试剂SW-1、试剂SW-2和试剂SW-3均随着稀释倍率的增高而凝固时间延长。试剂的稀释倍率越高，试剂中的重组牛组织因子的浓度越低。由此可以确认，试剂中的重组牛组织因子的浓度变化与凝固时间之间存在相关关系。
从上得知，试剂中所含来源于蚕个体的可溶性成份和来源于杆状病毒的可溶性成份不对血液的凝固反应产生影响。因此，制备凝固检查用试剂时不必纯化重组组织因子、除去这些可溶性成份。进而可以认为，以Sf9等昆虫培养细胞为宿主时，来源于宿主的可溶性成份也同样不会影响血液的凝固反应。
例2
试剂SW和试剂SF的敏感度
分别使用上述方法制备的试剂SW和试剂SF用全自动凝血分析仪Coagrex-800(岛津制作所(株))测定4种Ak-Calibrant(AK校准品)(AK-Aa、AK-Bb、AK-Cc和AK-Dd，均为Immuno公司制，奥地利)的凝固时间(秒)及国际标准敏感度指数(ISI值)。Ak-Calibrant(AK校准品)是具有在OQUASTA检测中被预先确定INR显示值的校准品。
使用算出的已知ISI值的复合因子T“KOKUSAI”作为对照试剂1与上述同样测定AK校准品的凝固时间(秒)和ISI值。复合因子T“KOKUSAI”是以牛组织因子-磷脂复合物为天然牛大脑凝血致活酶的市场销售的凝血致活试验(TT)试剂。
另外，作为对照试剂2制备了含纯化的重组牛组织因子的第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂。用此对照试剂2与上述同样测定AK校准品的凝固时间(秒)及ISI值。对照试剂2除在制备试剂SW的工序中进行硫铵盐析以使重组牛组织因子含有液SW中所含重组牛组织因子纯度达约95％以上外，其他均与试剂SW一样制备。且试剂SW、试剂SF和对照试剂2在测定正常值质控血浆N(希森美康(株))时，调制得可以得出与使用对照试剂1时相同的凝固时间。
用各试剂测得的凝固时间(秒)和ISI值的结果如表2所示。
表2
从表2结果可以确认，试剂SW和试剂SF对于校准品AK-Aa～AK-Dd显示与对照试剂1和对照试剂2同等程度的凝固时间和敏感度。据此得知，试剂SW和试剂SF的任何一个均显示出与使用天然牛脑凝血致活酶的传统试剂和含纯化重组牛组织因子的试剂同样的凝固时间和敏感度。
例3
试剂SW或试剂SF与对照试剂的凝固活性的相关性
使用与上述例2中所用同样试剂(试剂SW、试剂SF、对照试剂1和对照试剂2)用全自动凝血分析仪Coagrex-800(岛津制作所(株))测定服用华法林(Warfarin)患者的血浆(N＝20)的凝固活性(％)。绘制用于计算活性值(％)的标准曲线使用的是正常值质控血浆N(希森美康(株))。服用华法林患者的血浆使用的是Multi-Coumadin Set(Georoge KingBiomedical公司)。
使用各种试剂所得的活性值(％)结果如表3所示。
表3
从表3的结果可以确认，对于各种血浆标本，试剂SW和试剂SF均显示出与对照试剂1和对照试剂2同等程度的活性值。由此得知，试剂SW和试剂SF的任何一个均显示出与使用天然牛脑凝血致活酶的传统试剂和含纯化重组牛组织因子的试剂同样的活性值。
针对各种血浆标本，使用对照试剂1时的活性值和使用试剂SW时的活性值的关系图如图3所示。使用对照试剂1时的活性值和使用试剂SF时的活性值的关系图如图4所示。图3的横轴表示用对照试剂1测定时的活性值(％)，纵轴表示用试剂SW测定时的活性值(％)。图4的横轴表示用对照试剂1测定时的活性值(％)，纵轴表示用试剂SF测定时的活性值(％)。
正如图3和图4所明示，试剂SW的活性值(％)和试剂SF的活性值(％)均与传统的对照试剂1的活性值(％)之间存在很高的相关性。由此得知，本实施例的试剂SW和试剂SF的活性相当于使用天然牛脑凝血致活酶的传统试剂。
例4
第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂对PIVKA的感受性
用重组牛组织因子含有液SW测试PIVKA的感受性。
具体而言，将第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂SW与20MM氯化钙溶液等量混合。再将所得混合液与人吸附血浆混合，制备PIVKA感受性试验用试剂。
作为对照，再用含有从牛脑抽取的凝血致活酶的牛脑来源凝血致活酶溶液和含有从兔脑抽取的凝血致活酶的兔脑来源凝血致活酶溶液与上述同样制备PIVKA感受性试验用试剂。
用制备的PIVKA感受性试验用试剂通过全自动凝血分析仪Coagrex-800(岛津制作所(株))测定正常血浆和3种华法林服用患者血浆的凝固时间。
正常血浆使用的是正常值质控血浆N(希森美康(株))和用生理盐水将其稀释的溶液。正常值质控血浆N的稀释倍率为稀释3倍、稀释5倍和稀释7倍。
华法林服用患者血浆使用Multi-Coumadin Set(Georoge KingBiomedical公司)及其用生理盐水稀释的溶液。华法林服用患者血浆的稀释倍率为稀释2倍、稀释3倍和稀释5倍。
所得结果如图5所示。
图5的A为使用重组牛组织因子含有液SW时的结果。B为使用牛脑来源凝血致活酶溶液时的结果。C为使用兔脑来源凝血致活酶溶液时的结果。图5的纵轴为凝固时间(秒)，横轴为血浆的稀释倍率。按照Hemker和Denson等方法探讨对PIVKA的感受性。
按照Hemker和Denson等方法比较正常血浆所示直线和华法林服用患者血浆所示直线。此时你会发现，使用牛脑来源凝血致活酶溶液时(图5B)在华法林服用患者血浆有由PIVKA造成的抗凝(虚线)。另一方面，使用兔脑来源凝血致活酶溶液时(图5C)没有由PIVKA造成的抗凝(虚线)。因此可以说，天然的牛凝血致活酶对PIVKA有感受性，但天然的兔凝血致活酶对PIVKA感受性很低。这种结果与Hemker和Denson等的报告一致。
使用第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂SW时(图5A)所得结果与使用牛脑来源凝血致活酶溶液时(图5B)一致。从这些结果可以确认，本实施例试剂中的重组牛组织因子和磷脂的复合物显示出与天然牛凝血致活酶同样的性质。还了解到，第II、第VII、第IX、第X因子测定用试剂SW中所含来源于蚕的可溶性成份不会对PIVKA感受性产生影响。
从以上各实施例的结果得知，上述凝固检查用试剂尽管含有来源于昆虫或昆虫培养细胞的可溶性成份，但仍显示出与传统凝固检查试剂同样的敏感度和凝固活性。由此得知，上述凝固检查用试剂可以替代传统的凝固检查用试剂使用。另外，用于上述凝固检查用试剂的重组组织因子因为可以简化纯化工序，因此可望比传统的用重组组织因子的凝固检查方法生产率高，生产成本低。
序列表
<110>希森美康株式会社
<120>凝固检查用试剂及其试剂的生产方法
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>257
<212>PRT
<213>黄牛
<400>1
Thr Asp Val Val Val Ala Tyr Asn Ile Thr Trp Lys Ser Thr Asn Phe
1 5 10 15
Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Ile Asn His Val Tyr Thr
20 25 30
Val Gln Ile Ser Pro Arg Leu Gly Asn Trp Lys Asn Lys Cys Phe Tyr
35 40 45
Thr Thr Asn Thr Glu Cys Asp Val Thr Asp Glu Ile Val Lys Asn Val
50 55 60
Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Arg Val Leu Ser Tyr Pro Ala Asp Thr Ser
65 70 75 80
Ser Ser Thr Val Glu Pro Pro Phe Thr Asn Ser Pro Glu Phe Thr Pro
85 90 95
Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser Phe Glu Gln
100 105 110
Val Gly Thr Lys Leu Asn Val Thr Val Gln Asp Ala Arg Thr Leu Val
115 120 125
Arg Ala Asn Ser Ala Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe Gly Lys Asp
130 135 140
Leu Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ala Ser Ser Thr Gly Lys Lys
145 150 155 160
Lys Ala Thr Thr Asn Thr Asn Gly Phe Leu Ile Asp Val Asp Lys Gly
165 170 175
Glu Asn Tyr Cys Phe His Val Gln Ala Val Ile Leu Ser Arg Arg Val
180 185 190
Asn Gln Lys Ser Pro Glu Ser Pro Ile Lys Cys Thr Ser His Glu Lys
195 200 205
Val Leu Ser Thr Glu Leu Phe Phe Ile Ile Gly Thr Val Met Leu Val
210 215 220
Ile Ile Ile Phe Ile Val Val Leu Ser Val Ser Leu His Lys Cys Arg
225 230 235 240
Lys Val Arg Ala Glu Arg Ser Gly Lys Glu Asn Thr Pro Leu Asn Ala
245 250 255
Ala
<210>2
<211>292
<212>PRT
<213>黄牛
<400>2
Met Ala Thr Pro Asn Gly Pro Arg Val Pro Cys Pro Gln Ala Ala Val
1 5 10 15
Ala Arg Ala Leu Leu Phe Gly Leu Val Leu Ile Gln Gly Ala Gly Val
20 25 30
Ala Gly Thr Thr Asp Val Val Val Ala Tyr Asn Ile Thr Trp Lys Ser
35 40 45
Thr Asn Phe Lys Thr Ile Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Ile Asn His
50 55 60
Val Tyr Thr Val Gln Ile Ser Pro Arg Leu Gly Asn Trp Lys Asn Lys
65 70 75 80
Cys Phe Tyr Thr Thr Asn Thr Glu Cys Asp Val Thr Asp Glu Ile Val
85 90 95
Lys Asn Val Arg Glu Thr Tyr Leu Ala Arg Val Leu Ser Tyr Pro Ala
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Glu Pro Pro Phe Thr Asn Ser Pro Glu
115 120 125
Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr Ile Gln Ser
130 135 140
Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Leu Asn Val Thr Val Cln Asp Ala Arg
145 150 155 160
Thr Leu Val Arg Ala Asn Ser Ala Phe Leu Ser Leu Arg Asp Val Phe
165 170 175
Gly Lys Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ala Ser Ser Thr
180 185 190
Gly Lys Lys Lys aLa Thr Thr Asn Thr Asn Gly Phe Leu Ile Asp Val
195 200 205
Asp Lys Gly Glu Ash Tyr Cys Phe His Val Gln Ala Val Ile Leu Ser
210 215 220
Arg Arg Val Asn Gln Lys Ser Pro Glu Ser Pro Ile Lys Cys Thr Ser
225 230 235 240
His Glu Lys Val Leu Ser Thr Glu Leu Phe Phe Ile Ile Gly Thr Val
245 250 255
Met Leu Val Ile Ile Ile Phe Ile Val Val Leu Ser Val Ser Leu His
260 265 270
Lys Cys Arg Lys Val Arg Ala Glu Arg Ser Gly Lys Glu Asn Thr Pro
275 280 285
Leu Asn Ala Ala
290
机译： 用于临床检查的细颗粒分散剂，检查试剂，试剂的生产方法，检查方法和用途
机译： 血液凝固检验试剂和血液凝固检查方法
机译： 用于检查重要组织的含氧同位素标记的血红蛋白的试剂及其生产方法
