调节植物对生长素敏感性的基因及其应用

摘要

本发明公开了磷脂酶D zeta 2蛋白在调节植物对生长素的敏感性或对低磷胁迫的响应方面的用途。本发明还公开了制备对生长素敏感性高或对低磷胁迫响应性高的植物的方法。本发明首次将磷脂酶D zeta2蛋白与植物的生长素敏感性和低磷胁迫响应相关联，可制备出对生长素敏感性高或对低磷胁迫响应性高的转基因植物，从而可大大降低田间生长素的施用量，增加植物对低磷的吸收，大幅降低农业成本。

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及到植物中一种磷脂水解酶的应用，具体是关于PLDzeta2在调控植物对植物激素生长素响应以及植物对低磷胁迫响应中的应用。

背景技术

磷脂是机体内广泛存在的一类由磷酸组成的脂类，主要包括甘油磷脂和鞘磷脂，通常所说的磷脂主要指甘油磷脂，其种类多、体内周转快，是同时具亲水性和疏水性的一类兼性分子，不仅是组成细胞膜的基本成分，而且还可以作为信号物质响应外界的环境刺激。植物中常见的磷脂分子有磷脂酰肌醇、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆固醇、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸等，这些磷脂不仅是植物细胞内膜系统的重要组分，同时在植物细胞的信号传导中的也具有重要的作用。

磷脂酶D(PLD)是普遍存在于细菌、真菌、植物及动物中的一类磷脂水解酶，可以水解磷脂分子内特定的酯键从而生成磷脂酸(PA)和自由的头部基团分子。在植物中，PLD及其产物PA参与了逆境胁迫、囊泡运输、细胞骨架蛋白重组等多个重要的细胞过程。拟南芥中的基因组中存在12个PLD的编码基因，不同的PLD基因在植物种子萌发、幼苗生长、主根的伸长和根毛的形态建成、花粉管萌发和顶端生长、叶片的衰老与果实成熟，以及植物对植物激素脱落酸(Abscisic Acid，ABA)、干旱、失水、低温、低磷等多个逆境胁迫响应过程中起到重要的调节作用。

在以往的研究中，本发明人采用PCR筛库的方法通过筛选拟南芥下胚轴cDNA噬菌体文库，克隆得到了一个PLD的编码基因的cDNA序列，测序证明该序列为PLDzeta2的cDNA序列，编码的产物为PLDzeta2蛋白。该cDNA序列已递交到EMBL基因库，登录号为AM182458。

然而，本领域目前对于PLDzeta2基因的功能仍然知之甚少，因此需要进一步对PLDzeta2基因的功能加以研究，以期将之应用于植物的培育中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种磷脂酶D zeta2(PLDzeta2)及其用途。

在本发明的第一方面，提供磷脂酶D zeta2蛋白的用途，用于调节植物对生长素的敏感性，或调节植物对低磷胁迫的响应。

在本发明的另一优选例中，所述的磷脂酶D zeta2蛋白可用于提高植物对生长素的敏感性；或者，所述的磷脂酶D zeta2蛋白可用于促进植物对低磷胁迫的响应。

在本发明的另一优选例中，所述的植物选自下组：十字花科芸苔属植物，或禾本科植物，或茄科植物等。

在本发明的另一优选例中，所述的十字花科芸苔属植物包括(但不限于)：

拟南芥、油菜、白菜；

所述的禾本科植物包括(但不限于)：水稻、小麦；或者

所述的茄科植物包括(但不限于)：马铃薯、西红柿。

在本发明的另一优选例中，所述的磷脂酶D zeta2蛋白具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。或者，是具有与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列较高同源性的氨基酸序列(如同源性＞60％；优选的，同源性＞80％；更优选的，同源性＞90％或更高)。

在本发明的第二方面，提供一种提高植物对生长素的敏感性的方法，所述的方法包括：

在生长素浓度≥10nM时(优选的，为10-1000000nM，更优选的，为10-10000nM；最优选的10-1000nM)，提高植物中磷脂酶D zeta2蛋白的表达，从而提高植物对生长素的敏感性；或

在生长素浓度≤1nM时(优选的，为0.00001-1nM，更优选的，为0.0001-1nM)，降低植物中磷脂酶D zeta2蛋白的表达，从而提高植物对生长素的敏感性。

在本发明的第三方面，提供一种制备在生长素浓度≥10nM时对生长素敏感性高的植物(如转基因植物)的方法，所述的方法包括：

(1)将磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因转入植物细胞、组织或器官，获得转化入磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；和

(2)将步骤(1)获得的转入了磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织或器官再生并选出转基因植株。

在本发明的另一优选例中，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使磷脂酶Dzeta2蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入了磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

在本发明的另一优选例中，生长素的浓度为10-1000000nM(更优选的，为10-10000nM；最优选的，为10-1000nM)。

在本发明的另一优选例中，所述的表达载体选自(但不限于)：p35S-1301、p35S-1302。

在本发明的第四方面，提供一种制备在生长素浓度≤1nM时对生长素敏感性高的植物、或对低磷胁迫响应性高的植物的方法，所述的方法包括：

(1)提供携带反义表达载体(或者最终可以降低基因表达的载体)的农杆菌，所述的反义表达载体内含有反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因(或基因片段)；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述反义载体内含有的反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入了所述反义载体内含有的反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；以及

(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，生长素的浓度为0.00001-1nM(更优选的，为0.0001-1nM)。

在另一优选例中，所述的“反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因”是指在将基因克隆入载体时，所述基因的5’端的起始密码子的位置与载体的相应启动子的位置相远离，而3’端终止子的位置与载体的启动子位置相靠近(即与常规的基因克隆入载体的方向相反)。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1为野生型植株与PLDzeta2缺失突变体atpldζ2对生长素(IAA)敏感度变化比较图。WT为野生型拟南芥，atpldζ2为PLDzeta2基因缺失表达的突变体株系。atpldζ2与野生型相比降低了对生长素的敏感性，即比野生型对生长素的敏感性差。

图2为野生型植株与PLDzeta2过表达和缺失表达转基因株系对生长素敏感度比较图。WT为野生型拟南芥，pO-PLDζ2-LO11和pO-PLDζ2-LO19为PLDzeta2基因表达上调的两个转基因株系，pO-PLDζ2-LA3和pO-PLDζ2-LA11为PLDzeta2基因表达下调的两个转基因株系。pO-PLDζ2-LA3和pO-PLDζ2-LA11与野生型相比降低了对生长素的敏感性，与PLDzeta2基因表达下调转基因植株对生长素的反应正好相反的是，基因上调的转基因株系pO-PLDζ2-LO11和pO-PLDζ2-LO19与野生型植株相比，增加了对生长素敏感度。其中，Control表示野生型对照植株，即WT。

图3为p35S-1301/AtPLDζ2正义过量表达双元载体图谱。

图4为p35S-1301/反义AtPLDζ2缺失表达双元载体图谱。

具体实施方式

本发明人经过长期的研究，首次将磷脂酶D zeta2(简称PLDzeta2，或PLDζ2)基因与植物的生长素敏感性相关联，发现PLDzeta2基因的过表达或低表达(包括不表达)能够调节植物对生长素的敏感性；并且，PLDzeta2基因还参与了植物对低磷胁迫的响应，PLDzeta2的低表达(包括不表达)促进了植物对低磷胁迫的适应。基于此完成了本发明。

如本发明所用，所述的“对生长素敏感性高的植物”或“对生长素敏感性升高的植物”是指一种植物(如转基因植物)，其在适当的生长条件下对生长素的敏感性比在相同条件下野生型植物的敏感性高10％或更高(更优选的高20％或更高)。如在1nM的IAA处理的情况下，转基因植株比对照植株对IAA的敏感性高15％以上(见表1和表2)。

如本发明所用，所述的“对生长素敏感性低的植物”或“对生长素敏感性降低的植物”是指一种植物(如转基因植物)，其在适当的生长条件下对生长素的敏感性比在相同条件下野生型植物的敏感性低10％或更低(更优选的低20％或更低)。

如本发明所用，所述的“低磷胁迫响应性高的植物”是指一种植物(如转基因植物)，可以更好更快地适应低磷胁迫，如野生型拟南芥植株在低磷(1μM pi)处理的情况下，8天左右才能有大量的根毛的产生，而PLDzeta2缺失的突变体在2天的时候就会有大量的根毛产生。所述的“低磷胁迫响应”是指植物在磷养分缺乏时，引发异于正常代谢的生理活动，是植物适应磷养分不足的自身调节，其产生的响应主要有增加侧根和根毛的数目，促进磷酯分子的水解，增加机体内无机磷的含量。

磷脂酶D zeta2

磷脂酶D zeta2(PLDzeta2)是广泛存在于植物(如拟南芥、水稻、白菜、油菜、小麦等)中的一种PLD基因，PLDzeta2在各种植物中是高度保守的，具有非常高的蛋白同源性。

在本发明中，所用的PLDzeta2蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自植物。此外，所述的PLDzeta2蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重组PLDzeta2蛋白。优选的，本发明可采用重组的PLDzeta2蛋白。

任何适合的PLDzeta2蛋白均可用于本发明。所述的PLDzeta2蛋白包括全长的PLDzeta2蛋白或其生物活性片段。优选的，所述的PLDzeta2蛋白的氨基酸序列可以与SEQ ID NO：2所示的序列基本上相同。

经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的PLDzeta2蛋白的氨基酸序列也包括在本发明中。PLDzeta2蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换氨基酸是本领域的公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等Molecular Biology of The Gene，第四版，1987，TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。

任何一种PLDzeta2蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，PLDzeta2蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的PLDzeta2蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长PLDzeta2蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长PLDzeta2蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

本发明也可采用经修饰或改良的PLDzeta2蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的PLDzeta2蛋白。所述经过修饰或改良的PLDzeta2蛋白可以是一种PLDzeta2蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经过修饰或改良的PLDzeta2蛋白或者基因可以是与天然存在的PLDzeta2蛋白或基因虽然具有一定的不同点，但也能调节植物对生长素敏感性或对低磷胁迫的响应，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响PLDzeta2蛋白的生物活性或者说是基因的生物功能的变化形式都可用于本发明中。

任何与所述的PLDzeta2蛋白同源性高(比如与PLDzeta2蛋白的同源性为70％或更高，优选的，同源性为80％或更高，更优选的，同源性为90％或更高)的、且具有PLDzeta2蛋白相同功能的蛋白也包括在本发明内。

作为本发明的一个实例，提供一种获自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的PLDzeta2蛋白(又称为AtPLDzeta2或AtPLDζ2)，所述的PLDzeta2蛋白的编码基因全长3370bp，包含53bp的5’UTR和176bp的3’UTR，编码1046AA的一个多肽，该基因如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白如SEQ ID NO：2所示。

PLDzeta2的用途

本发明提供了PLDzeta2蛋白的用途，用于调节植物对生长素的敏感性或调节植物对低磷胁迫的响应；或用于筛选调节植物对生长素敏感性或调节植物对低磷胁迫的响应的物质(即：所述物质通过调节PLDzeta2蛋白的表达来调节植物对生长素的敏感性或对低磷胁迫的响应)。

本领域技术人员均了解，生长素对于植物生长的调节是双重的，在生长素浓度较低的情况下(如≤0.1nM)可促进植物的生长，而在生长素浓度较高(如≥10nM)的情况下可抑制植物的生长。对拟南芥等植株而言，判断生长素浓度对于植物的生长究竟是促进还是抑制的临界浓度约在1-10nM，也即生长素浓度高于10nM时对植物的生长产生抑制，而在生长素浓度低于1nM时对植物的生长产生促进。并且，对于各种植物生长素或不同的物种，所述的临界浓度虽有所差异但还是接近的(即约1-10nM)。

通常根据农业上的应用，来选择制备PLDzeta2基因过表达的植株(如转基因植株)还是制备PLDzeta2基因低表达的植株。

作为一种优选方式，所述的PLDzeta2蛋白可用于提高植物对生长素的敏感性，比如使植物能够在施加很少生长素(如≤1nM)的情况下快速生长，从而达到降低植物培植的成本的目的；还比如使植物在施加高剂量(如≥10；更优选的≥100nM)的植物生长素(根据不同的需要，生长素可在植物生长的某个阶段施加)的情况下发生局部部位或全部部位(植物的不同器官对于生长素的敏感度存在差异)生长抑制，从而使得植物发生矮化或其它生理机制(比如促进生根，防止果实脱落，或延长植物花期等)，满足农业应用所需。作为另一种优选方式，所述的PLDzeta2蛋白可还用于提高植物对低磷胁迫的响应，促进植物对低磷的吸收，从而达到降低植物培植成本的目的。

由于植物对于各种植物生长素的运输机制或响应机制是相似的，因此所述的PLDzeta2不仅可以调节植物对IAA的敏感性，同时可调节植物对于多种生长素的敏感性，所述的生长素包括但不限于吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)，萘乙酸(NAA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)等。

为了论证PLDzeta2的上述用途，本发明人通过克隆PLDzeta2基因，用包含PLDzeta2基因的全长构建正义表达载体，用非保守区的N端DNA片段构建反义表达载体，然后将PLDzeta2基因的正义及反义表达载体转入农杆菌，并用农杆菌介导法转化拟南芥，建立了拟南芥的转基因株系。通过对PLDzeta2的突变体、正义及反义表达转基因植株的分析，发现PLDzeta2通过调节植物细胞中生长素在细胞膜与细胞内的循环，从而调控植物对生长素的响应，并且，PLDzeta2还调控了植物对低磷胁迫的响应。

此外，本发明人通过搜索Salk研究所的拟南芥T-DNA插入突变体库(http://signal.salk.edu/tabout.html)发现并得到了PLDzeta2的T-DNA插入突变体株系，进一步的实验证明该株系是PLDzeta2缺失表达的突变体；同时通过PLDzeta2过表达和缺失表达的转基因株系与野生型植株的比较研究，发现PLDzeta2调控了植物对生长素的响应，同时参与了植物对低磷胁迫的响应。

利用PLDzeta2调节植物对于生长素的敏感性，可以使转基因植株对于外源施加的生长素非常敏感；同时该基因的缺失表达可以使植物增加对低磷胁迫的响应，这一发现不仅具有理论意义，同时也显示了PLDzeta2基因在现代农业中的应用前景。

利用PLDzeta2基因调节植物对于生长素的敏感性，可以使过量表达或低表达的转基因植株对于外源施加的生长素非常敏感，同时该基因的低表达或缺失表达促进了植物对低磷胁迫的响应。

本领域人员均了解，生长素在低浓度(如≤约1nM)的情况下促进植物的生长，在高浓度(如≥约10nM)的情况下抑制植物的生长。因此，通常根据农业上的应用，来选择制备PLDzeta2基因过表达的植株(如转基因植株)还是制备PLDzeta2基因低表达的植株。

当生长素用于促进植物的生长和发育时，通过制备PLDzeta2基因低表达的植株，所述植株在生长素浓度低(如≤约1nM)时即可表现出对生长素的高敏感性(即与野生型相比对生长素更敏感)，从而可在施加很少量的生长素的情况下茁壮成长，达到降低施加生长素所需成本的目的。

另一方面，但生长素用于减缓或抑制植物的生长时，通过培植PLDzeta2基因高表达的植株，所述植株在生长素浓度高时(如≥约10nM)表现出对生长素的高敏感性(即与野生型相比对生长素更敏感)，从而可在施加适当量的生长素的情况下发生生长抑制，从而发生矮化或其它生理机制。例如在培植马铃薯时，通过制备对生长素敏感性高的植株，在植株培植的适当阶段加入高浓度的生长素，可抑制地上部分的过度生长从而促进马铃薯块茎的膨大，从而达到增加产量的目的。

此外，本发明人还发现，PLDzeta2蛋白水解磷脂所生成的产物磷脂酸也具有调节植物对于生长素的敏感性的功能。

调节植物对生长素敏感性或对低磷胁迫的响应的方法

本发明还提供了一种调节植物对生长素敏感性的方法，所述的方法包括：使所述植物过量表达PLDzeta2蛋白，或低表达PLDzeta2蛋白(包括使磷脂酶Dzeta2蛋白不表达或低表达)。

更优选的，所述的方法选自以下两方面：

(1)在生长素浓度≥10nM时(优选的，为10-1000000nM，更优选的，为10-10000nM；最优选的10-1000nM)，提高植物中磷脂酶D zeta2蛋白的表达，从而提高植物对生长素的敏感性；或

(2)在生长素浓度≤1nM时(优选的，为0.00001-1nM，更优选的，为0.0001-1nM)，降低植物中磷脂酶D zeta2蛋白的表达，从而提高植物对生长素的敏感性。

本发明还提供了一种提高植物对低磷胁迫响应性的方法，所述的方法包括：降低所述植物中磷脂酶D zeta2蛋白的表达(包括使磷脂酶D zeta2蛋白不表达或低表达)。

在得知了所述的PLDzeta2蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来促进所述的PLDzeta2蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带PLDzeta2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表达活性的PLDzeta2蛋白。此外，也可以采用本领域人员熟知的多种方法来降低PLDzeta2蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义PLDzeta2基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，使得细胞或植物组织不表达或降低表达PLDzeta2蛋白。

作为本发明的一种实施方式，将编码PLDzeta2蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如双元载体p35S-1301)中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述PLDzeta2蛋白的植物细胞、组织或器官中，进而获得过量表达PLDzeta2基因的植物。

优选的，制备对生长素敏感性高的植物的方法包括：(1)将外源的PLDzeta2蛋白的编码基因转入植物细胞、组织或器官，获得转化入PLDzeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官；和(2)将步骤(1)获得的转入了外源PLDzeta2蛋白的编码基因的植物细胞、组织、器官再生成植物植株。

作为一种优选的实例，所述的方法包括步骤：

(s1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有PLDzeta2蛋白的编码基因；

(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(s1)中的农杆菌接触，从而使PLDzeta2蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(s3)选择出转入PLDzeta2蛋白的编码基因的转基因植物细胞、组织、器官；以及

(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并筛选出转基因植物。

作为一种实施方式，当用于制备拟南芥的转基因植物时，本发明人利用携带所述含PLDzeta2蛋白的表达载体的农杆菌来侵染拟南芥未开放的花苞，在花苞开花结果后，收到的种子中含有转基因的种子，然后通过抗性筛选直接获得转基因的植株。而在制备水稻等的转基因植株时，利用携带所述含PLDzeta2蛋白的表达载体的农杆菌来侵染水稻的愈伤组织，之后使所述组织再生成转基因植物。

作为另一种优选的实例，所述的方法包括：

(1)提供携带反义表达载体的农杆菌，所述的反义表达载体含有反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因(或基因片段)；

(2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述反义表达载体含有的反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入了所述反义表达载体含有的反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的转基因植物细胞、组织、器官；以及

(4)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并筛选出转基因植物。

所述的反义表达载体在转入植物细胞后，通过转录获得一段PLDzeta2反方向编码的全长基因或基因片断，该反向片断可以与植物体内正常转录的PLDzeta2的正向mRNA序列相互识别配对，进而抑制PLDzeta2的mRNA的正常翻译，最终导致植物细胞内不表达或低表达磷脂酶D zeta2蛋白。

用于所述反义载体内所含有的反方向启动的磷脂酶D zeta2蛋白的编码基因的基因片段的长度一般在100bp-3kb，优选的为300bp-1.5kb，如1kb。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含PLDzeta2蛋白编码基因的序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如新霉素抗性、绿色荧光蛋白(GFP)、Hyg抗性、Kan抗性。

包含上述的适当基因序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

本发明的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。

本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的蛋白。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组蛋白可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的主要优点在于：

首次将磷脂酶D zeta2(PLDzeta2)基因与植物的生长素敏感性相关联，发现PLDzeta2基因能够用于调节植物对生长素的敏感性。并且，该基因还能调节植物对低磷胁迫的响应。所述基因对于植物培植领域具有广泛的应用价值，其能够使植物对生长素更敏感，从而可大大降低田间生长素或磷的施用量，可非常有效地降低农业成本。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室指南(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照以下文献中公布的方法：Carl W.Dieffenbach和Gabriela S.Devksler eds.PCRPrimet：A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Laboratory Press，1995。或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 PLDzeta2基因的克隆

利用常规的96孔板PCR的方法筛选噬菌体文库(Alfandari，D.，and Darribère，T.(1994).A simple PCR method for screening cDNA libraries.PCR Methods Appl.4，46-49)的方法获得了PLDzeta2基因的全长cDNA克隆。在以下实施例或附图中，从拟南芥中获得的PLDzeta2基因也称为AtPLDzeta2或AtPLDζ2。

首先根据已知基因组序列信息(即GenBank中At3g55940的基因序列)在该基因的3’端设计引物：

AtPLDζ2-1：5’-TGATCGTTATTCCGCTAC-3’(SEQ ID NO：3)；

AtPLDζ2-2：5’-AAGGTTCCCTCTTGTCTC-3’(SEQ ID NO：4)。

用所述引物筛选拟南芥下胚轴噬菌体cDNA文库(购自拟南芥生物研究中心，ABRC，或参见http://www.arabidopsis.org/)，分离得到包含AtPLDzeta2的cDNA全长序列的cDNA克隆pBSK-AtPLDζ2。

前述筛选得到的阳性克隆(BSK-AtPLDζ2质粒)，经测序验证，其中包含的AtPLDζ2的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，包含5’端非翻译区53bp和3’端非翻译区176bp，共3370bp长，该cDNA序列已经提交到Genbank基因库中，登录号为AM182458。

BLAST发现，该cDNA序列，与拟南芥基因组预测得到的PLDzeta2基因编码区序列完全相同，表明筛库获得的基因为PLDzeta2的编码基因。

实施例2 PLDζ2的T-DNA插入突变体atpldζ2的分离及鉴定

为了研究AtPLDζ2基因的生理功能，本发明人还检索了Salk研究所的拟南芥T-DNA插入突变体库(http://signal.salk.edu/tabout.html)。搜索结果显示编号为Salk_119084的突变体株系为AtPLDζ2的插入突变体，插入位点在其相应的AtPLDζ2基因(Locus number为At3g55940)中的第三个内含子末端距离第四个外显子14bp的位置。

从Salk突变体库得到的突变体，经Kan抗性筛选后具有抗性的植株再进行T-DNA插入位点的检测。采用常规方法从该植株的幼苗提取DNA，利用T-DNA载体上的引物Lbal(5’TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 3(SEQ ID NO：5)’)与基因特异引物P2(5’-CTCTAGCAAATGAGAGTCTAG-3’(SEQ ID NO：6))进行PCR扩增，验证了T-DNA载体的插入；T-DNA插入位点前后的引物P1(5’-ATGTCGACGGATAAATTACTAC-3’(SEQ ID NO：7))和P2进行PCR扩增，验证了T-DNA的纯合插入。

PCR鉴定为杂合体的植株，单株收种，后代植株进行Kan抗性筛选，并统计抗性分离比，具有Kan抗性的植株与不具有Kan抗性的植株分离比符合3∶1，证明了突变体中T-DNA只有一个插入拷贝，因此该突变体与野生型相比仅有AtPLDζ2基因的变异，其它基因与野生型相同。

突变体的纯合体植株，提取总RNA反转录后进行RT-PCR。采用T-DNA插入位点后3’端的引物P3(即：AtPLDζ2-1)和引物P4(即：AtPLDζ2-2)进行PCR扩增，用来验证在突变体纯系植株中PLDzeta2基因的mRNA转录水平是否受到抑制。RT-PCR的结果显示，在突变体中PLDzeta2基因的表达完全被阻止，该基因不表达。

实施例3 PLDζ2的过量表达及缺失表达转基因株系的获得

利用实施例1中经cDNA文库筛选获得的pBSK-AtPLDζ2质粒，在cDNA的两端选择KpnI和BamHI酶切位点，进行酶切，连入到经过同样酶切处理后的p35S-1301双元载体(参见Liu W，Xu ZH，Luo D，Xue HW.(2003).Roles of OsCKI1，arice casein kinase I，in root development and plant hormone sensitivity.Plant J.36，189-202)中，构建成为35S启动子驱动AtPLDζ2的正义双元载体(p35S-1301/AtPLDζ2)，该正义双元载体的图谱见图3，其中，Over-PLDzeta2即表示正义插入的PLDzeta2基因。

PCR扩增AtPLDζ2基因5’端非保守的1kb的片断，BamHI和SalI酶切后连入同样酶切处理的p35S-1301双元载体中，构建成为含有35S启动子驱动的AtPLDζ2反向序列的的反义双元载体(p35S-1301/反义AtPLDζ2)，即AtPLDζ2基因5’端的起始密码子的位置与载体的启动子位置相远离，而3’端终止密码子的位置与载体的启动子位置相靠近，该反义双元载体的图谱见图4，其中，A-PLDzeta2即表示反义插入的PLDzeta2基因片段。

采用常规的液氮冻融方法，将构建好的双元载体转入农杆菌GV3101(参见Plant Mol Biol 26：1115-1124，konczc C，Schell J，1986)，采取花序轴侵染的常规拟南芥转化方法转化拟南芥Col野生型植株(购自拟南芥生物研究中心，ABRC)，收获该植株的种子，经Hyg抗性筛选后获得转基因植株，并抽取基因组DNA后用PCR的方法验证双元载体的T-DNA序列整合到染色体上。

过量表达的转基因植株选择通用的35S-primer(5’-ATGCCATCATTGCGATAAAGG-3’(SEQ ID NO：8))和AtPLDζ2 5’端引物AtPLDζ2-pxA(5’AGCAAATGAGAGTCTAG 3’(SEQ ID NO：9))进行PCR扩增验证T-DNA整合到染色体上；缺失表达的转基因植株选择引物s35S-primer和基因5’端引物(5’ATGTCGACGGATAAATTACTAC 3’(SEQ ID NO：10))进行PCR扩增验证T-DNA整合到染色体上。

实施例4 PLDζ2的缺失突变体atpldζ2及过量表达及缺失表达转基因株系对生长素敏感度的检测

根据生长素在低浓度(≤1nm)的情况下促进主根生长，在≥10nM的情况下抑制主根生长，来判断植物对生长素的敏感性。在本实施例中，本发明人用相对根长来分析，即相对根长为IAA处理情况下主根的长度相对于未处理植株主根长度的百分比。

生长素敏感性实验：表面消毒的①野生型、②pldzeta2缺失突变体(即实施例2中获得的T-DNA插入突变体)、③PLDzeta2过表达型(即实施例3获得的过量表达转基因植株)或④缺失表达型(即实施例3获得的缺失表达转基因植株)的拟南芥种子点播在添加有不同浓度的IAA(吲哚乙酸)(0，1nM，10nM，100nM和1μM)的MS培养基上(1010cm方板)，4℃春化(在4摄氏度的冰箱中，让拟南芥的种子打破休眠，保持萌发一致)处理2天后，移至人工气候室中萌发生长。光下竖直培养9天后，分别测量主根的长度，每个处理测量植株至少30株，计算平均值；重复3次。

实验结果如图1和表1以及图2和表2所示。根据图1和表1可见，在低浓度生长素(1nM IAA)处理的情况下，野生型植株在IAA处理的情况下相对主根长度(是未处理对照植株的94.97％)并没有明显的变化，但突变体植株明显的受到了生长素的诱导(是未处理对照植株的112.96％)；在10nM IAA处理的情况下，野生型植株受IAA抑制明显，其相对根长为未处理植株的79.31％，突变体植株的相对根长为97.52％，并没有明显的受到生长素的抑制；在100nIAA处理的情况下，野生型植株受IAA抑制明显，其相对根长为未处理植株的61.30％，而突变体植株的相对根长为84.83％。

根据图2和表2可见，在低浓度生长素(1nM IAA)处理的情况下，野生型和两株AtPLDζ2过量表达的转基因植株在IAA处理的情况下相对主根长度(分别是未处理对照植株的97.91％、94.09％和97.53％)并没有明显的变化，但两株AtPLDζ2缺失表达植株明显的受到了生长素的诱导(分别是未处理对照植株的122.02％和127.13％)。当外源施加较高浓度的IAA时，AtPLDζ2过量表达的转基因植株增加了对生长素的敏感性。当外源施加10nM的IAA时，野生型植株的主根长度为未处理对照植株的82.1％；AtPLDζ2过量表达的转基因植株pO-PLDζ2-LO11、LO19的主根长度分别为未处理对照植株的68.9％和55.6％；当外源施加100nM的IAA时野生型植株的主根长度为未处理对照植株的60.6％；AtPLDζ2过量表达的转基因植株pO-PLDζ2-LO11、LO19的主根长度分别为未处理对照植株的48.7％和33.8％。而缺失表达的转基因植株收生长素的影响没有那么显著。

atpldζ2(即：PLDzeta2缺失突变型)与野生型相比降低了对生长素的敏感性，PLDzeta2缺失表达的转基因株系PO-PLDζ2-LA3和PO-PLDζ2-LA11与野生型相比降低了对生长素的敏感性，相反的是PLDzeta2过量表达的转基因株系PO-PLDζ2-LO11和PO-PLDζ2-LO19增加了植物对生长素的敏感度。

表1

  0 IAA  1nm IAA  10nm IAA  100nm IAA  1μm IAA  WT  100％  94.97％  79.31％  61.30％  30.17％  atpldζ2  100％  112.96％  97.52％  84.83％  42.33％

表2

  0 IAA  1nm IAA  10nm IAA  100nm IAA  1μm IAA  对照  100％  97.91％  82.15％  60.62％  14.50％  pO-PLDζ2-LO11  100％  94.09％  68.94％  48.71％  12.56％  pO-PLDζ2-LO19  100％  97.53％  55.67％  33.87％  12.03％  pO-PLDζ2-LA3  100％  122.02％  97.73％  78.12％  31.74％  pO-PLDζ2-LA11  100％  127.13％  98.80％  80.96％  44.30％

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>调节植物对生长素敏感性的基因及其应用

<130>066106

<160>

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3370

<212>DNA

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>1

cggacatgca atcgtgaacg gcgagtttcg acgacggttt ggggagttaa tcgatgtcga      60

cggataaatt actacttcct aacggcgtta agtcagacgg agtcatcaga atgaccagag     120

ctgatgctgc ggcggcggca gcttcttctt ctctcggcgg tggaagtcaa atattcgacg     180

agcttcccaa ggctgcgatc gtctcggtct cgagacctga caccaccgat tttagtccct     240

tgcttctttc ttacaccttg gagcttcagt ataaacagtt caagtggaca ttacaaaaga     300

aggcttctca agttctgtac ttacattttg cgttgaagaa acgtttgatc attgaagaac     360

ttcacgacaa gcaagaacag gttagagagt ggctacacag cttggggatt tttgatatgc     420

aaggatcagt tgtgcaagat gatgaagaac ctgacgatgg tgctcttcct ctgcactata     480

ctgaagatag tatcaagaac aggaatgttc cttcccgtgc agcgcttcca atcattcgtc     540

caacgatagg ccggtcagag acagttgtag atcgtgggag aaccgcaatg caaggctact     600

tgagtctctt tctagggaac ttggacattg taaactccaa agaggtctgc aagttcctag     660

aagtttctag actctcattt gctagagagt acggttccaa gatgaaagaa gggtatgtca     720

cagtgaagca cttgagggac gtcccaggtt ctgatggtgt ccgatgctgt cttcctacac     780

actgtctcgg tttcttcgga actagctgga caaaggtttg ggcggttctg aaaccaggat     840

ttttggcgtt actagaagat ccattcagcg gaaagcttct agatataatg gtgttcgaca     900

cattggggtt gcaaggtact aaagagtctt ctgaacaacc gcgtttggct gaacaggtga     960

aggaacacaa cccattgcgt tttggcttta aagttactag tggggaccga accgtgaggc    1020

tgagaacaac gagcagcagg aaagttaaag agtgggttaa ggccgtggac gaagctggtt    1080

gttacagtcc acatcggttt ggttcgtttg caccacctag aggcttgaca tcggacggaa    1140

gccaggcaca gtggttcgta gacggtcaca ctgcgtttga agctatcgcg tttgcaatcc    1200

aaaacgcaac atcagagata tttatgactg gttggtggtt atgtccggag ctatatctca    1260

aacgcccctt tgaagatcat ccatcattgc ggctcgatgc attgctggag acaaaagcaa    1320

aacagggcgt taagatatat attcttctgt ataaggaagt ccaaatcgcg ctgaaaatca    1380

acagcttgta cagcaagaaa cggcttcaaa acattcacaa gaacgtcaaa gttcttcgtt    1440

atccagacca tctctcctcc ggcatttacc tctggtcgca ccacgagaaa atagtgattg    1500

tagattacca agtttgtttc attggagggt tagatctctg ttttgggcgg tacgatacag    1560

cggagcacaa gattggagat tgccctcctt atatatggcc tggaaaagat tactacaatc    1620

ctagagaatc tgaaccaaat tcgtgggaag aaacgatgaa agatgagtta gacaggagaa    1680

agtacccgcg aatgccgtgg cacgatgtcc actgcgctct atggggaccg ccttgtcggg    1740

atgtggctcg acattttgtc cagcggtgga accactctaa gagaaacaag gcacctaatg    1800

aacagacgat tccattgttg atgcctcacc accacatggt tcttcctcac tacttgggaa    1860

ctagagagat cgatataatc gcagcggcta aaccagagga agaccctgac aaacctgtcg  1920

ttcttgccag acatgactct ttctcttctg cctcaccgcc ccaagaaatc cctttgcttc  1980

tcccacaaga aaccgatgca gatttcgccg gcagaggaga tctgaagtta gacagcggtg  2040

caagacaaga tcctggggaa acttcagagg aaagcgatct ggacgaggct gtgaacgact  2100

ggtggtggca gattgggaag cagagtgatt gccggtgtca aataatcaga agtgttagcc  2160

aatggtctgc tgggacgagc cagcctgaag atagcattca tagagcttat tgttcgctta  2220

tccagaacgc tgaacatttt atctacatag agaaccaatt cttcatctcc gggctagaaa  2280

aagaggacac gatcctaaac cgcgttctag aagcgttata cagacgcatt ctgaaggctc  2340

atgaagagaa caagtgcttc cgcgttgtga tcgttattcc gctactccct ggatttcagg  2400

gaggtattga tgacttcgga gcagccacgg ttcgagcact gatgcattgg caataccgta  2460

cgatctctag agaaggaact tcgattcttg acaaccttaa cgctttgctc ggtcccaaga  2520

cgcaagatta catctctttc tatggtttga gatcgtacgg acggctgttt gaggacggtc  2580

caattgccac tagccagatt tacgtgcata gcaagttaat gattgttgat gaccggatcg  2640

cagtgatcgg atcttctaat ataaacgata ggagcttact aggttcacga gactctgaga  2700

tcggtgttgt gattgaagac aaagaattcg tggaatcttc gatgaacgga atgaagtgga  2760

tggccgggaa gttctcttac agtcttagat gttccttgtg gtcagagcat ctcggccttc  2820

acgccggaga gattcagaag atcgaagatc caatcaaaga tgcaacatac aaagacttat  2880

ggatggcaac agctaagaaa aacacggaca tctacaacca agtcttctcg tgcatcccga  2940

atgaacatat acgctcaaga gctgcattga gacacaatat ggctctttgt aaagacaagt  3000

tgggtcacac tacgatcgac cttggcattg caccggagag gctagaatca tgcggcagcg  3060

actcgtggga gattctgaag gagacaagag ggaaccttgt gtgcttccca ttacagttca  3120

tgtgtgatca agaagatctc agaccaggtt tcaacgaatc tgagttctac actgctcctc  3180

aagtcttcca ctaaccacta tttattgtac gcccagttct ctttaatcag ttaatagagt  3240

acctaagctc acacgttact tatgtataga gatgttagtt atatagaaag aagaaattca  3300

tttgattgct tcctaggttc gcagaggtat gtgtgtgtat agtatacact tcttgtaaat  3360

cataatgttt                                                         3370

<210>2

<211>1046

<212>PRT

<213>拟南芥(Arabidopsis thaliana)

<400>2

Met Ser Thr Asp Lys Leu Leu Leu Pro Asn Gly Val Lys Ser Asp Gly

1                5                    10                   15

Val Ile Arg Met Thr Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ser Ser

             20                   25                   30

Ser Leu Gly Gly Gly Ser Gln Ile Phe Asp Glu Leu Pro Lys Ala Ala

        35                    40                  45

Ile Val Ser Val Ser Arg Pro Asp Thr Thr Asp Phe Ser Pro Leu Leu

    50                   55                   60

Leu Ser Tyr Thr Leu Glu Leu Gln Tyr Lys Gln Phe Lys Trp Thr Leu

65                   70                   75                   80

Gln Lys Lys Ala Ser Gln Val Leu Tyr Leu His Phe Ala Leu Lys Lys

                 85                   90                   95

Arg Leu Ile Ile Glu Glu Leu His Asp Lys Gln Glu Gln Val Arg Glu

             100                  105                  110

Trp Leu His Ser Leu Gly Ile Phe Asp Met Gln Gly Ser Val Val Gln

         115                 120                  125

Asp Asp Glu Glu Pro Asp Asp Gly Ala Leu Pro Leu His Tyr Thr Glu

    130                  135                  140

Asp Ser Ile Lys Asn Arg Asn Val Pro Ser Arg Ala Ala Leu Pro Ile

145                  150                  155                  160

Ile Arg Pro Thr Ile Gly Arg Ser Glu Thr Val Val Asp Arg Gly Arg

                 165                  170                  175

Thr Ala Met Gln Gly Tyr Leu Ser Leu Phe Leu Gly Asn Leu Asp Ile

             180                  185                 190

ValAsn Ser Lys Glu Val Cys Lys Phe Leu Glu Val Ser Arg Leu Ser

        195                  200                 205

Phe Ala Arg Glu Tyr Gly Ser Lys Met Lys Glu Gly Tyr Val Thr Val

    210                  215                  220

Lys His Leu Arg Asp Val Pro Gly Ser Asp Gly Val Arg Cys Cys Leu

225                  230                  235                  240

Pro Thr His Cys Leu Gly Phe Phe Gly Thr Ser Trp Thr Lys Val Trp

                 245                  250                  255

Ala Val Leu Lys Pro Gly Phe Leu Ala Leu Leu Glu Asp Pro Phe Ser

             260                  265                 270

Gly Lys Leu Leu Asp Ile Met Val Phe Asp Thr Leu Gly Leu Gln Gly

        275                  280                  285

Thr Lys Glu Ser Ser Glu Gln Pro Arg Leu Ala Glu Gln ValLys Glu

    290                  295                  300

His Asn Pro Leu Arg Phe Gly Phe Lys Val Thr Ser Gly Asp Arg Thr

305                  310                  315                  320

Val Arg Leu Arg Thr Thr Ser Ser Arg Lys Val Lys Glu Trp Val Lys

                 325                  330                  335

Ala Val Asp Glu Ala Gly Cys Tyr Ser Pro His Arg Phe Gly Ser Phe

             340                  345                  350

Ala Pro Pro Arg Gly Leu Thr Ser Asp Gly Ser Gln Ala Gln Trp Phe

        355                  360                  365

Val Asp Gly His Thr Ala Phe Glu Ala Ile Ala Phe Ala Ile Gln Asn

    370                  375                  380

Ala Thr Ser Glu Ile Phe Met Thr Gly Trp Trp Leu Cys Pro Glu Leu

385                  390                  395                  400

Tyr Leu Lys Arg Pro Phe Glu Asp His Pro Ser Leu Arg Leu Asp Ala

                 405                  410                  415

Leu Leu Glu Thr Lys Ala Lys Gln Gly Val Lys Ile Tyr Ile Leu Leu

             420                  425                 430

Tyr Lys Glu Val Gln Ile Ala Leu Lys Ile Asn Ser Leu Tyr Ser Lys

        435                  440                  445

Lys Arg Leu Gln Asn Ile His Lys Asn Val Lys Val Leu Arg Tyr Pro

    450                  455                  460

Asp His Leu Ser Ser Gly Ile Tyr Leu Trp Ser His His Glu Lys Ile

465                  470                  475                  480

Val Ile Val Asp Tyr Gln Val Cys Phe Ile Gly Gly Leu Asp Leu Cys

                 485                  490                  495

Phe Gly Arg Tyr Asp Thr Ala Glu His Lys Ile Gly Asp Cys Pro Pro

             500                 505                  510

Tyr Ile Trp Pro Gly Lys Asp Tyr Tyr Asn Pro Arg Glu Ser Glu Pro

        515                  520                  525

Asn Ser Trp Glu Glu Thr Met Lys Asp Glu Leu Asp Arg Arg Lys Tyr

    530                  535                  540

Pro Arg Met Pro Trp His Asp Val His Cys Ala Leu Trp Gly Pro Pro

545                  550                  555                  560

Cys Arg Asp Val Ala Arg His Phe Val Gln Arg Trp Asn His Ser Lys

                 565                  570                  575

Arg Asn Lys Ala Pro Asn Glu Gln Thr Ile Pro Leu Leu Met Pro His

             580                  585                 590

His His Met Val Leu Pro His Tyr Leu Gly Thr Arg Glu Ile Asp Ile

        595                  600                  605

Ile Ala Ala Ala Lys Pro Glu Glu Asp Pro Asp Lys Pro Val Val Leu

    610                  615                  620

Ala Arg His Asp Ser Phe Ser Ser Ala Ser Pro Pro Gln Glu Ile Pro

625                  630                  635                  640

Leu Leu Leu Pro Gln Glu Thr Asp Ala Asp Phe Ala Gly Arg Gly Asp

                 645                  650                  655

Leu Lys Leu Asp Ser Gly Ala Arg Gln Asp Pro Gly Glu Thr Ser Glu

             660                  665                  670

Glu Ser Asp Leu Asp Glu Ala Val Asn Asp Trp Trp Trp Gln Ile Gly

        675                   680                 685

Lys Gln Ser Asp Cys Arg Cys Gln Ile Ile Arg Ser Val Ser Gln Trp

    690                  695                  700

Ser Ala Gly Thr Ser Gln Pro Glu Asp Ser Ile His Arg Ala Tyr Cys

705                  710                  715                  720

Ser Leu Ile Gln Asn Ala Glu His Phe Ile Tyr Ile Glu Asn Gln Phe

                 725                  730                  735

Phe Ile Ser Gly Leu Glu Lys Glu Asp Thr Ile Leu Asn Arg Val Leu

             740                  745                 750

Glu Ala Leu Tyr Arg Arg Ile Leu Lys Ala His Glu Glu Asn Lys Cys

        755                  760                  765

Phe Arg Val Val Ile Val Ile Pro Leu Leu Pro Gly Phe Gln Gly Gly

    770                  775                  780

Ile Asp Asp Phe Gly Ala Ala Thr Val Arg Ala Leu Met His Trp Gln

785                  790                  795                  800

Tyr Arg Thr Ile Ser Arg Glu Gly Thr Ser Ile Leu Asp Asn Leu Asn

                 805                  810                  815

Ala Leu Leu Gly Pro Lys Thr Gln Asp Tyr Ile Ser Phe Tyr Gly Leu

             820                  825                  830

Arg Ser Tyr Gly Arg Leu Phe Glu Asp Gly Pro Ile Ala Thr Ser Gln

        835                  840                  845

Ile Tyr Val His Ser Lys Leu Met Ile Val Asp Asp Arg Ile Ala Val

    850                  855                  860

Ile Gly Ser Ser Asn Ile Asn Asp Arg Ser Leu Leu Gly Ser Arg Asp

865                  870                  875                  880

Ser Glu Ile Gly Val Val Ile Glu Asp Lys Glu Phe Val Glu Ser Ser

                 885                  890                  895

Met Asn Gly Met Lys Trp Met Ala Gly Lys Phe Ser Tyr Ser Leu Arg

             900                  905                  910

Cys Ser Leu Trp Ser Glu His Leu Gly Leu His Ala Gly Glu Ile Gln

        915                  920                   925

Lys Ile Glu Asp Pro Ile Lys Asp Ala Thr Tyr Lys Asp Leu Trp Met

    930                  935                  940

Ala Thr Ala Lys Lys Asn Thr Asp Ile Tyr Asn Gln ValPhe Ser Cys

945                  950                  955                 960

Ile Pro Asn Glu His Ile Arg Ser Arg Ala Ala Leu Arg His Asn Met

                 965                  970                  975

Ala Leu Cys Lys Asp Lys Leu Gly His Thr Thr Ile Asp Leu Gly Ile

             980                  985                 990

Ala Pro Glu Arg Leu Glu Ser Cys Gly Ser Asp Ser Trp Glu Ile Leu

        995                  1000                  1005

Lys Glu Thr Arg Gly Asn Leu Val Cys Phe Pro Leu Gln Phe Met

    1010                 1015                 1020

Cys Asp Gln Glu Asp Leu Arg Pro Gly Phe Asn Glu Ser Glu Phe

    1025                 1030                 1035

Tyr Thr Ala Pro Gln Val Phe His

    1040                 1045

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

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<210>4

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

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<211>22

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<213>人下序列

<220>

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<210>6

<211>21

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<220>

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<211>22

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<220>

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<210>8

<211>21

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<220>

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<220>

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<210>10

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