一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法及一种试剂盒。本发明提供的检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法是检测中国荷斯坦牛自GenBank AccessionNo.AJ318490中自5′端第10433－10434位(即DGAT1外显子8的第15－16位)脱氧核糖核苷酸是AA还是GC，确定所述中国荷斯坦牛的基因型，然后通过基因型确定产奶性状。本发明提供的试剂盒包括用于PCR扩增含有自GenBank AccessionNo.AJ318490中自5′端第10433－10434位(即DGAT1外显子8的第15－16位)核苷酸的基因组片段的引物、限制性核酸内切酶CfrI、PCR试剂和限制性核酸内切酶缓冲液。本发明方法及试剂盒操作简便、快速、灵敏，使用本方法及试剂盒检测到的结果可靠、稳定、准确。因此，本发明方法及试剂盒在牛的育种领域将有广阔的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法及试剂盒。

背景技术

二十世纪末以来，世界卫生组织把人均乳品占有量列为衡量一个国家人民生活水平的主要指标。据最新资料表明，世界人均占有奶量保持在100kg(2006)左右，其中发达国家大多超过200kg(法国达到456kg)，日本在不长时间内已从不到10kg上升到现在的70kg，邻近的泰国、印度等也都超过60kg，而我国目前仅为6.8kg，是世界平均水平的1/15。

我国人均奶产品的占有量之所以远低于世界平均水平，除了受传统饮食习惯和其它一些因素的影响外，最主要的原因是我国的奶牛产业还不发达，尤其是奶牛育种水平还比较落后。因此需要加大对奶牛生产育种方面的科研投入，以提高奶业生产效率。

伴随着遗传学理论的发展，奶牛育种技术也从表型值选择发展到育种值选择。尤其是分子数量遗传学的产生及其理论和技术的发展为动物育种提供了新的策略，使动物育种学家从操纵数量性状表型逐步过渡到操纵数量性状基因型，从由表型的选择转为标记辅助选择(Marker-Assisted Selection，MAS)(Soller andBeckmamn，1983)，最终实现了分子育种。标记辅助选择是在基因组分析的基础上，通过DNA标记技术对畜禽数量性状座位进行直接选择，或通过标记辅助渗入导入有利基因，通过标记辅助淘汰清除不利基因等，从而达到更有效地改良畜禽的目的。

牛奶中的脂类主要是甘油三酯(triglycerides)，占乳脂肪的98％。合成甘油三酯的最主要途径是甘油磷酸二酯途径。二酰甘油转酰基酶(acylCoA：diacylglycerol acyltransferase)是甘油磷酸二酯途径的最后一步反应中催化甘油三酯合成的关键酶，所以二酰甘油转酰基酶的编码基因DGAT1对乳脂的合成有重要影响。因此，将DGAT1基因作为数量性状来研究其与生长性状和产奶性状的关系对牛的育种有很大的实践意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法。

本发明所提供的检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法是检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸是AA还是GC，确定所述中国荷斯坦牛的基因型，然后通过基因型确定产奶性状；

其中，所述基因型是按照如下方法确定的：如果自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸是AA，其纯合体的基因型为KK；如果自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸是GC，其纯合体的基因型为MM；它们的杂合体基因型为KM。

当所述产奶性状为产奶量时，MM基因型个体的产奶量高于KM基因型个体和KK基因型个体，KM基因型个体高于KK基因型个体；所述产奶性状为乳脂量时，KK基因型个体的乳脂量高于KM基因型个体和MM基因型个体，KM基因型个体高于MM基因型个体；所述产奶性状为乳蛋白量时，MM基因型个体的乳蛋白量高于KM基因型个体和KK基因型个体。

在实际应用中，本发明方法确定的产奶性状可作为中国荷斯坦牛育种的辅助选择标记。

本发明中所述检测中国荷斯坦牛自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸是AA还是GC的方法具体可为先PCR扩增含有自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)核苷酸的基因组片段，然后对扩增产物进行测序或者用限制性核酸内切酶CffI酶切扩增产物。其中，PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。

其中，用限制性核酸内切酶CffI酶切所述PCR扩增产物，若只得到201bp片段，其基因型为KK纯合体；若得到201bp、178bp及23bp三个酶切片段，其基因型为KM杂合体；若得到178bp和23bp两个片段，其基因型为MM纯合体。

本发明的另一个目的是提供一种试剂盒。

本发明所提供的试剂盒，包括用于PCR扩增含有自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)核苷酸的基因组片段的引物、限制性核酸内切酶CffI、PCR试剂和限制性核酸内切酶缓冲液。PCR扩增的一对引物中，一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2。

本发明的检测中国荷斯坦牛产奶性状的方法及试剂盒可在个体早期进行产奶性状的检测，加快育种进程，高效改善牛群的产奶性能。本发明的方法与常规产奶性状检测相结合，可提高检测的准确性和效率。本发明方法及试剂盒操作简便、快速、灵敏，检测的结果可靠、稳定、准确。

附图说明

图1为部分个体的血液基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为部分个体的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

泳道M：DNA分子量标准100 ladder Marker，泳道1到15：PCR产物。

图3为部分个体的酶切分型结果图。

泳道M为DNA分子量标准MarkI，泳道7、10-11为KK基因型，泳道1、3-6、8-9、12-14为KM基因型，泳道2为MM基因型。

图4为三种基因型个体的PCR产物的测序结果。箭头所示为突变位点。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

试剂：

(1)50×TAE(1L)：Tris碱242g、冰乙酸57.1ml，0.5mol/L的EDTA(pH＝8.0)100ml加水充分溶解，定溶到1L。

(2)0.7％琼脂糖凝胶：将0.7g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。

(3)2.0％琼脂糖凝胶：将2.0g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。

(4)4.0％琼脂糖凝胶：将4.0g琼脂糖加入含有100ml 1×TAE的三角瓶中，微波炉加热。

实施例1、检测中国荷斯坦牛产奶性状

一、实验动物的选取

从北京三元集团绿荷奶牛养殖中心所属14个牛场选取17头中国荷斯坦公牛的后代，每头公牛女儿数平均为12-153头，共计1222头奶牛，并对该1222头奶牛分别进行采血取样。样本分布情况见表1。

表1试验材料结构

  牛场数  14  公牛头数  17  各场泌乳母牛头数  平均：87.3；最少：2；  最多：206  每头公牛女儿数  平均：71.9；最少：12；最多：153

选取305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率作为研究产奶性状。

二、利用试剂盒检测中国荷斯坦牛的基因型

1、血液基因组DNA的提取

对1222头奶牛分别进行血液基因组DNA的提取，提取的基因组DNA作为PCR模板。采用天根血液基因组DNA提取试剂盒DP318，主要步骤如下：

剪取200μl血凝块于1.5ml离心管中，剪碎

                    ↓

加500μl细胞裂解液CL，颠倒混匀，10000rpm离心1min，弃上清，留下细胞核沉淀，如裂解不彻底可重复以上步骤一次

                    ↓

向离心管收集到的细胞核沉淀中加200μl缓冲液GS，混匀

                    ↓

             加入20μl蛋白酶K

                    ↓

加220μl缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃消化10min左右，其间颠倒混匀数次至溶

                  液变清亮

                    ↓

加220μl无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀

                    ↓

倾入到CB3吸附柱中(吸附柱放入废液收集管中)，12000rpm离心30s

                    ↓

     加500μl去蛋白液GD，12000rpm离心30s，弃废液

                    ↓

     加700μl漂洗液PW，12000rpm离心30s，弃废液

                    ↓

    将CB3吸附柱放回废液收集管中，12000rpm离心2min

                    ↓

将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，加入100μl洗脱液TB(洗脱液在60℃-70℃水浴预热，效果更好)，室温放置2-5min，12000rpm离心30s，将溶液收集到离心

                             管中

                              ↓

将离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心2min，将离心管中的DNA溶液4℃保存以备利用。

将提取的血液基因组DNA用0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果表明提取的DNA基本无降解(图1)。

2、利用试剂盒检测中国荷斯坦牛的基因型

该试剂盒包括：PCR扩增的一对引物，其中一个引物的核苷酸序列是序列表中序列1，另一个引物的核苷酸序列是序列表中序列2；其它PCR扩增试剂；限制性核酸内切酶CfrI及其酶切缓冲液。

1)引物设计

根据GenBank数据库中奶牛DGAT1基因的序列(AJ318490)，采用OLIgo6.0软件设计引物，引物序列分别为：5’ctcgtagctttggcaggtaag3’(F)(序列表中序列1)，5’aagttgagctcgtagcacagg3’(R)(序列表中序列2)。该引物由上海生工生物工程公司合成。

2)PCR扩增

PCR扩增反应总体系20μl：模板DNA(100ng/μl)1μl；引物(10pmol/μl)，各0.6μl；dNTP(2.5mmol/L)，1.6μl；TaqDNA聚合酶(5U/μl)，0.1μl；10×PCR缓冲液(Mg²⁺Free)，2μl；MgCl₂(25mmol/L)，1ul；补超纯水至20ul。

PCR扩增程序：先94℃欲变性5min；然后94℃ 45s，60℃ 30s，72℃ 40s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

将PCR扩增产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳。结果表明1222头中国荷斯坦牛的PCR扩增均得到一条清晰的201bp的DNA片段，部分个体的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果如图2。

3)酶切分型：

酶切反应体系：8μl PCR扩增产物，1μl CfrI内切酶(10U/μl)，1μl内切酶缓冲液(10×buffer)。水浴锅中37℃酶切2小时。将酶切产物进行4％琼脂糖凝胶电泳检测(图3)。

结果表明共有三种带型，分别为201bp、178bp、23bp，其中，23bp的片段太短，因此在胶图上无法显示出来(图3)。三种带型分别对应三种基因型：将得到的只有201bp片段的基因型命名为KK型，只得到178bp和23bp二个片段的基因型命名为MM型，得到201bp、178bp和23bp三个片段的基因型命名为KM型。

该1222头试验母牛中KK基因型175头，KM基因型745头，MM型302头。

所有试验母牛的PCR扩增产物直接测序，每头母牛重复3次，得到中国荷斯坦牛DGAT1基因外显子8的部分DNA序列，用CHROMAS软件进行分析(图4)。结果表明所有KK基因型的个体自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸均是AA；所有MM基因型的个体自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸均是GC；所有KM基因型的个体自GenBank Accession No.AJ318490中自5′端第10433-10434位(即DGAT1外显子8的第15-16位)脱氧核糖核苷酸既含有AA又含有GC。图4中，NN＝AA或GC。

对所有试验母牛重复进行上述PCR扩增及RFLP酶切分析，两次实验结果完全一致。

3、基因型与产奶性状的关联性分析

采用动物模型对数据进行拟合，通过SAS(8.2)软件的MIXED过程对305天产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率和乳蛋白率等5个产奶性状和基因型进行关联分析，线性方程式如下：

y＝μ+hys+b×M+G+a+e

其中：y＝产奶性状(产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率、乳蛋白率)观察值

μ＝群体均值

hys＝场年季效应

b＝协变量M的回归系数

M＝产犊月龄效应

G＝基因型效应

a＝随机加性遗传效应

e＝随机残差效应

其中$\mathrm{Var}\left(a\right)=G=A{\sigma }_a^2,$在动物模型下，A阵是所有动物个体之间的加性遗传相关矩阵，A阵的每一元素用以下的递推公式来计算：

其中s_i(s_j)和d_i(d_j)为个体i(j)的父亲和母亲。

在利用上式计算A阵时，要先将系谱中的所有个体按个体号、父号和母号列成一个3列表(数据文件)，在列表时应注意：

1)在个体一列中应包括所有在父和母列出现过的个体；

2)在个体一列中应保证后代决不会出现在其父母之前，一般可按出生日期排序，先出生的在前。

3)为便于编写程序，个体应用自然数从1开始连续编号。

根据上述原则，使用Fortran95编写程序计算1222头个体之间的加性遗传相关系数，得到A阵。σ_a²为各性状的加性遗传方差，产奶量、乳脂量、乳脂率、乳蛋白量、乳蛋白率的加性遗传方差分别是696800kg²、713.3 kg²、0.05091、585.2kg²、0.003363。将G读入MIXED过程。

关联分析结果表明，DGAT1基因对产奶量、乳脂量和乳蛋白量的效应均达到极显著(P＜0.01)水平，对乳脂率和乳蛋白率的效应不显著(P＞0.05)。

通过Bonferroni多重比较分析了DGAT1基因三种基因型对产奶性状的影响。结果表明：MM基因型个体的产奶量显著高于KM和KK基因型个体(P＜0.01)，KM基因型个体显著高于KK基因型个体(P＜0.01)；KK基因型个体乳脂量显著高于KM和MM基因型个体(P＜0.01)，KM基因型个体显著高于MM基因型个体(P＜0.01)；MM基因型个体乳蛋白量显著高于KM和KK基因型个体；不同基因型对乳脂率和乳蛋白率的影响差异不显著(P＞0.05)(表2)。

表2 DGAT1基因不同基因型的产奶性状的最小二乘均值及标准误

  基因型  产奶量  (校正305d)/Kg  LSM±SE  乳脂量/Kg  LSM±SE  乳脂率/％  LSM±SE 乳蛋白量/Kg LSM±SE  乳蛋白率/％  LSM±SE  KK(175)  8060.l3^A±98.87  339.87^A±4.55  4.238±3.9E-4 259.43^A±2.87  3.230±1.4E-4  KM(745)  8114.91^B±59.66  319.34^B±2.76  3.952±2.3E-4 259.35^A±1.74  3.207±0.8E-4  MM(302)  8521.70^C±78.60  314.48^C±3.61  3.694±3.1E-4 268.76^B±2.28  3.164±1.1E-4

注：同列中具有不同字母肩标的平均值间差异极显著(p＜0.01)

4、DGAT1基因及基因型效应分析

基因、基因型效应指标及计算公式为：

$a=\frac{X_{\mathrm{KK}}-X_{\mathrm{MM}}}{2}$$d=X_{\mathrm{KM}}-\frac{X_{\mathrm{KK}}+X_{\mathrm{MM}}}{2}$$\bar{a}=\alpha +d(q-p)$

其中：a为显性效应；d为加性效应；为基因替代平均效应；X_KK、X_KM、X_MM为相应基因型产奶性状最小二乘均值。

对不同基因型差异显著的产奶性状计算基因和基因型效应，结果表明(表3)：产奶量、乳脂量和乳蛋白量的基因替代平均效应分别为-248.739kg、11.882kg和-5.158kg，均达到极显著水平(P＜0.01)，从另一方面说明DGAT1基因对产奶性状有重要影响。通过计算和检验加性效应、显性效应和基因型效应表明：基因型对产奶性状的影响是由于加性效应造成的，不同基因型的显性效应不显著，说明DGAT1基因对产奶性状的影响是可以遗传的。

表3 DGAT1基因、基因型效应

  产奶性状  基因替代平均效应    基因型效应    加性效应    显性效应  产奶量/Kg  -248.739**    -406.475**    -230.470**    -176.005  乳脂量/Kg  11.882**    4.860**    12.695**    -7.835  乳蛋白量/Kg  -5.158**    -9.410**    -4.665**    -4.745

注：**表示差异极显著(p＜0.01)

序列表

<160>2

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>1

ctcgtagctttggcaggtaag    18

<210>2

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>2

aagttgagctcgtagcacagg    18