法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2014-02-05
专利权的转移 IPC(主分类):C12N5/10 变更前: 变更后: 登记生效日:20140106 申请日:20060831
专利申请权、专利权的转移
2013-12-18
文件的公告送达 IPC(主分类):C12N5/10 收件人:梁旻 文件名称:缴费通知书 申请日:20060831
文件的公告送达
2012-01-04
授权
授权
2009-10-28
实质审查的生效
实质审查的生效
2008-04-09
公开
公开
2007-08-29
地址不明的通知 收件人:梁旻 文件名称:生物材料样品视为未保藏通知书 申请日:20060831
地址不明的通知
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技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是利用基因重组技术构建用以生产病毒等生物制品的细胞系,以及该细胞系在病毒等生物制品制备过程中的用途。
背景技术
某一特定病毒的生产需要特定的宿主细胞系,通常,病毒与其宿主细胞之间存在着相互适应的关系。例如,已经被广泛应用于遗传性疾病、恶性肿瘤的治疗以及新型基因工程疫苗等领域的研究腺病毒载体,在体外培养腺病毒过程中最为广泛的宿主细胞是HEK293细胞。近年来,随着腺病毒载体的应用日益广泛,特别是随着腺病毒载体大量、深入的应用于各种疾病的临床试验,人们发现利用HEK293细胞培养第一代腺病毒载体(E1区或/和E3区缺失)时,整合于HEK293细胞基因组中的腺病毒序列(包括4.3kb长度的腺病毒DNA片段,该段DNA含有完整的腺病毒E1a和E1b序列及E1a启动子区域)可以和第一代腺病毒载体发生重组,从而产生回复突变野生腺病毒。这种现象对于腺病毒载体的临床应用是一个重大的安全隐患。
针对HEK293细胞的这一缺陷,荷兰的Crucell公司发展了一种新的细胞系PER.C6,该细胞株来源于腺病毒E1a/E1b基因转化的人胚成视网膜细胞(retinoblasts),在大规模生产腺病毒载体的过程中应用PER.C6细胞作为宿主细胞可以大大减少或杜绝回复突变野生腺病毒的产生。随后的研究及应用扩大了该细胞株的使用范围,目前将该细胞株应用于抗体生产以及流感疫苗的生产中也取得了很好的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种改进的人胚肺转化细胞系SL-1,该细胞系具有优于HEK293细胞的特性。本发明的另一目的是提供利用SL-1细胞系生产腺病毒、流感病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒和轮状病毒等病毒的用途。
人胚肺细胞是对腺病毒天然敏感的细胞之一,相对于人胚成视网膜细胞,人胚肺细胞更适合被用来培养腺病毒,而为了将其大规模应用于腺病毒的生产,需要利用合适的腺病毒基因片段转化该细胞,建成可以稳定传代的人胚肺转化细胞系。目前尚没有应用腺病毒E1a/E1b基因转化的人胚肺细胞系。
本发明首先建立了人胚肺转化细胞系SL-1。在本发明中,我们首先构建了质粒pSL28,该质粒缺失了腺病毒左侧100个碱基长度的基因片段,保留了腺病毒启动子和E1a/E1b基因。随后我们将该质粒转化人胚肺细胞,获得了转化细胞系SL-1。我们对该细胞系的特性进行了测试和评估,结果发现,该细胞系具有良好的生长特性,其生长密度是HEK293细胞的2.5倍,单个细胞的病毒产量与HEK293细胞相当(12000-14000病毒颗粒/每细胞),病毒总产率是HEK293细胞的2.5-3倍,而回复突变野生腺病毒的产生几率是HEK293细胞的1/100以下。
综上结果,人胚肺转化细胞系SL-1具有良好的特性,可以应用于病毒以及疫苗等生物制品的生产。
附图说明
图1.转化细胞用质粒pSL28的结构图谱
图2.SL-1细胞和HEK293细胞E1a基因的表达,图中可见SL-1细胞的E1a表达水平高于HEK293细胞
具体实施方式
实施例1 pSL28质粒的构建
pXC1质粒含有人腺病毒基因序列,从bp22到bp5790(McKinnon et.al.Gene.1982,19,33-42)。我们首先删除了pXC1质粒中的Bsa BI片段,得到质粒pSL26。利用PCR方法扩增出腺病毒左侧bp100到XbaI(bp1339)片段,扩增引物是:
正义链引物:5’-AGA ATT CCC CTT CCA GCT CTC TGC CCC-3’
反义链引物:5’-ACA GCT ATC CGT ACT ACT AT-3’
将扩增出的片段克隆入T载体pCST,由此得到质粒pSL27。
将pSL27质粒中的EcoRI-XbaI片段置换pXC1质粒中的EcoRI-XbaI片段,得到质粒pSL28。(pSL28质粒结构图谱见附图1)
实施例2应用pSL28质粒对人胚肺细胞的转化
制备pSL28质粒,在添加Invitrogen公司转化试剂Lipofectmine的情况下,利用pSL28质粒转化人胚肺细胞,得到人胚肺转化细胞株。我们共得到10个转化细胞克隆,经过对各个细胞克隆的E1a基因表达的检测,挑取其中高效表达E1a基因的一株细胞克隆,命名为SL-1细胞株。与HEK293细胞相比,SL-1细胞可以更高水平的表达E1a基因。检测结果见附图2。图中可见,平行重复三次检测的试验中,SL-1细胞的E1a基因表达水平高于HEK293细胞。 SL-1细胞是人胚肺转化细胞系,该细胞系已经保藏于中国典型培养物保藏中心(地址:中国武汉武汉大学430072,保藏日期:2006年8月29日,保藏编号:CCTCCC200633,该生物材料的分类名称:人胚肺转化细胞系(Transformed HumanEmbryo Lung Cell)。
实施例3 SL-1细胞株生产腺病毒特性检测
我们对SL-1细胞株生产病毒特性进行一系列检测。在细胞株稳定性检测中,我们将SL-1细胞株连续传代50次,所有后代次的细胞均能够稳定表达E1a基因产物。利用Ad5LacZ腺病毒载体(缺失E1区基因)感染各个代次的SL-1细胞,Ad5LacZ腺病毒载体可以在所有代次的SL-1细胞中顺利生长,经检测,各个代次的SL-1细胞,经Ad5LacZ腺病毒载体感染,收获子代病毒,平均每个细胞中可以产生12000--14000病毒颗粒。经培养中对单位培养面积内细胞数量的计数,并与HEK293细胞比较,发现在单位培养面积内,SL-1细胞的数量是HEK293细胞数量的2.5倍。对单位培养面积内产生的病毒总数进行比较,发现SL-1细胞产生的病毒数量是HEK293细胞产生的病毒数量的2.5-3倍。
对产生回复突变野生腺病毒水平的检测:利用经过噬斑纯化的Ad5LacZ腺病毒载体分别培养在相同数量的SL-1细胞和HEK293细胞中,感染三天后,收获细胞,采用超速离心方法纯化得到子代病毒,并检测子代病毒中回复突变野生腺病毒的水平,结果显示,经HEK293细胞培养,子代Ad5LacZ腺病毒载体中回复突变野生腺病毒水平为1/107,经SL--1细胞培养,子代Ad5LacZ腺病毒载体中回复突变野生腺病毒水平为1/109。由此可见,应用SL--1细胞株生产腺病毒,回复突变野生腺病毒的产生几率是HEK293细胞的1/100以下。
本发明中的SL-1细胞株也适用于制备其它病毒及生物制品,如用作流感病毒、单纯疱疹病毒、麻疹病毒和轮状病毒等病毒生产的宿主细胞,以及用作抗体生产中的工程细胞。
尽管上文以实施例详细描述了本发明,但本领域专业人员应当理解,可对本发明进行任何改变而不偏离本发明的范围。
机译: 用于检测癌干细胞的重组表达载体,由重组表达载体转化的细胞系以及生产转化的细胞系的方法
机译: 单倍体人胚胎干细胞系和体细胞系及其生产方法
机译: 转化的CHO细胞系以及使用转化的CHO细胞系生产靶蛋白的方法