一种钙磷合剂及其应用

摘要

本发明公开了一种钙磷合剂及其应用。该钙磷合剂含有下列重量百分比的组分：1.2％≤钙≤2.2％，0.4≤磷＜0.67％。该钙磷合剂可通过抑制骨吸收、刺激骨形成双重作用从而增加骨量，可用于制备抑制骨吸收和刺激骨形成的食品、保健品或药品以及制备治疗PTH缺乏引起的骨代谢异常的食品、保健品或药品。

说明书

技术领域

本发明涉及一种钙磷合剂及其应用。

背景技术

钙剂是目前用于预防骨质疏松所致骨折最简单而廉价的制剂，然而它的效果存在着争议^[1，2]。美国FDA已承认高钙食物有益于骨骼的健康并能降低骨质疏松发生的危险，但Shea等对1966-2000年发表的有关钙剂对骨密度和停经后妇女骨折影响的资料进行综合分析，得出的结论是：钙的补充虽然对骨的丢失有影响，但这种影响不大，而且是否能降低骨折率尚无定论^[3]。

人体正常的骨代谢是一个复杂的过程，包括骨吸收和骨形成两个方面：骨形成时，成骨细胞先形成类骨质并矿化形成新骨；骨吸收时，破骨细胞清除旧骨的矿物质。骨代谢受到众多因子的调节，从而使骨形成和骨吸收处于一个动态平衡状态。这种平衡的失调将引起不同的骨骼系统疾病，钙是骨骼生长发育和钙化的必不可少的元素。对于钙增加骨量的机制，先前的研究发现钙的补充能够抑制骨的吸收^[4]。钙的补充使血清钙增加，继而降低血清甲状旁腺素(PTH)和1，25-二羟基维生素D₃(1，25(OH)₂D₃)水平，进而降低破骨细胞的骨吸收^[5]。钙的补充能否刺激骨形成尚未见报道。

磷也是骨生长发育和钙化的必需元素之一，然而，它不像钙已经受到足够的重视。先前的研究发现，钙吸收增加同时，磷吸收降低。而磷的降低可影响钙的吸收而增加破骨细胞骨吸收^[6]。但是高磷饮食可引起低钙血症，继发性高PTH血症，并可能引起骨密度降低和骨折危险增加^[7]。

由于钙磷都为骨钙化所必须，它们既受钙磷调节激素调节，也反馈性调节钙磷调节激素，它们之间通过钙磷调节激素介导相互影响，因此钙磷之间的平衡对于维持骨骼的健康至关重要^[8]。针对如何提高青春期骨峰值和防止骨质疏松，有学者已经提出：应该考虑使用适当比例的钙磷制剂。先前的报道已经发现升高饮食中的钙/磷比例可能增加肠钙的吸收和抑止骨的丢失^[9]。然而，该研究只观察了钙磷比例对骨代谢的影响，而对钙的浓度未加重视，从而忽略了饮食中的高钙成份在促进骨形成中作用。

虽然钙剂己广泛用于防治骨质疏松和促进儿童骨骼的发育，但单独钙剂应用效果欠佳。鉴于磷也是骨骼生长和钙化的必备成份，可过高的磷饮食又可能损伤骨的形成，目前各种国产和进口钙剂达400多种，但尚无恰当钙磷比例和浓度的钙磷合剂产品用于骨的保健和预防骨质疏松等方面。

参考文献：

1.Kanis JA，Passmore R.Calcium supplementation of the diet--I.Bmj.Jan 211989；298(6667)：137-140.

2.Nordin BE，Heaney RP.Calcium supplementation of the diet：justified by presentevidence.Bmj.Apr 21 1990；300(6731)：1056-1060.

3.Papadimitropoulos E，Wells G，Shea B，et al.Meta-analyses of therapies forpostmenopausal osteoporosis.VIII：Meta-analysis of the efficacy of vitamin Dtreatment in preventing osteoporosis in postmenopausal women.Endocr Rev.Aug2002；23(4)：560-569.

4.Ricci TA，Chowdhury HA，Heymsfield SB，et al.Calcium supplementation suppressesbone turnover during weight reduction in postmenopausal women.J Bone Miner Res.Jun 1998；13(6)：1045-1050.

5.Rubinacci A，Divieti P，Polo RM，et al.Effect of an oral calcium load on urinarymarkers of collagen breakdown.J Endocrinol Invest.Dec 1996；19(11)：719-726.

6.Lotz M，Zisman E，Bartter FC.Evidence for a phosphorus-depletion syndrome in man.N Engl J Med.Feb 22 1968；278(8)：409-415.

7.Sax L.The institute of medicine′s″dietary reference intake″for phosphorus：a criticalperspective.J Am Coll Nutr.Aug 2001；20(4)：271-278.

8.Koshihara M，Masuyama R，Uehara M，et al.Reduction in dietary calcium/phosphorusratio reduces bone mass and strength in ovariectomized rats enhancing bone turnover.Biosci Biotechnol Biochem.Oct 2005；69(10)：1970-1973.

9.Koshihara M，Masuyama R，Uehara M，et al.Effect of dietary calcium：Phosphorusratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats.Biofactors.2004；22(1-4)：39-42.

发明内容

本发明的目的是提供一种通过抑制骨吸收和刺激骨形成双重作用从而增加骨量的钙磷合剂。

本发明另一个目的是提供上述钙磷合剂的应用。

本发明的目的是通过下列技术措施实现的：

一种钙磷合剂，含有下列重量百分比的组份：1.2％≤钙≤2.2％，0.4≤磷＜0.67％。

所述的钙磷合剂，在含有上述钙磷含量之外，其余可以为辅料、食物或食品添加剂等组分。

所述的钙磷合剂，含有下列重量百分比的组分：2.0％钙，0.4％磷，其余为辅料、食物或食品添加剂。

所述的钙磷合剂在制备抑制骨吸收和刺激骨形成的食品、保健品或药品中的应用。

所述的钙磷合剂在制备促进胎儿或儿童骨骼生长发育的食品、保健品或药品中的应用。

所述的钙磷合剂在制备预防骨质疏松症的食品、保健品或药品中的应用。

所述的钙磷合剂在制备治疗PTH缺乏引起的骨代谢异常的食品、保健品或药品中的应用。

本发明使用的辅料、食物或食品添加剂可以采用不含钙磷的辅料、食物或食品添加剂，如果采用的辅料、食物或食品添加剂中含有钙磷(尤其是含有钙磷含量较高时)，应当将所含钙、磷计算在所述钙磷合剂的钙、磷含量范围内。采用的辅料、食物或食品添加剂不宜含有阻碍机体对钙、磷吸收和利用的物质，这些阻碍钙、磷吸收和利用的物质是本领域普通技术人员熟知的，如与钙结合形成难溶性钙的物质、抑制肠道对钙磷吸收的物质等，这里不一一赘述。

本发明提供的钙磷合剂也可以与其他促进钙磷吸收和利用的药物形成复方，以进一步增强机体对钙磷的吸收和利用。

本发明提供的钙磷合剂用量以钙含量换算每日用量可在200～1000mg之间。

除非另有说明，本发明涉及钙、磷含量的百分比均是钙、磷在组合物中的重量百分比。

本发明有效效果：

发明人认为钙磷比例只有维持在适当范围内且钙的浓度必须达到高钙水平方能发挥最佳的调节骨代谢作用。本发明利用小鼠模型，采用距常饮食和高钙低磷饮食喂养母鼠或断奶后的小鼠至4月龄，通过血尿生化、组织形态学和细胞分子生物学的分析观察高钙低磷饮食对骨代谢的影响，从整体、细胞和分子水平分别研究高钙低磷饮食对骨骼生长发育和骨的代谢的作用。结果表明高钙低磷饮食(1.2％≤钙≤2.2％，0.4≤磷＜0.67％)不影响血液钙磷的水平，但增加尿钙的排泄，降低血清PTH和1，25(OH)₂D₃水平；增加骨小梁容量；通过降低RANKL/OPG比例，抑制破骨细胞的形成和活性，继而抑制了骨吸收，降低了骨的新陈代谢；通过促进骨髓成骨细胞前体的征收，分化(上调成骨细胞特异性基因表达)，增加成骨细胞骨形成而使骨形成率增加。这些实验数据表明恰当比例和浓度的高钙低磷饮食通过抑制骨吸收，刺激骨形成双重作用从而增加骨量。我们利用高钙低磷饮食分别喂养孕期和哺乳期的PTH缺乏母鼠，发现由这些母鼠喂养的3周龄仔鼠的骨容量和骨密度明显增加；当正常成年鼠实行卵巢切除术后，给予高钙低磷饮食喂养8周，同样发现它们的骨容量和骨密度明显增加。根据本研究的结果，发明人提供了恰当钙磷比例的钙磷合剂，该钙磷合剂可供孕妇、哺乳期妇女和儿童服用，促进胎儿和儿童骨骼生长发育；可以供青春前期和青春期儿童服用，以增加骨峰值达到预防骨质疏松的目的；可以供老年人服用，尤其是停经后妇女，防止骨量丢失，预防骨质疏松的发展和骨折的发生；可以供PTH缺乏患者服用，矫正因PTH缺乏引起的骨代谢异常。

注：2周龄小鼠为未成年小鼠，还在吃奶，相当于人类幼儿期至儿童期；3周龄小鼠，已断奶，相当人类儿童期至青春前期；4周龄至6周龄小鼠相当于人类青春期；6周龄(即1月半龄)以后的小鼠才能够进行交配和繁殖。

附图说明

图1：高钙低磷饮食对血清和尿钙、磷水平及血清1，25(OH)₂D₃和PTH水平的影响。

图2：高钙低磷饮食对骨容量的影响。

图3：高钙低磷饮食对骨吸收指数的影响。

图4：高钙低磷饮食对骨形成指数的影响。

图5：高钙低磷饮食对骨形成指数的影响。

图6：高钙低磷饮食对正常和PTH缺乏仔鼠骨容量和骨密度的影响。

图7：高钙低磷饮食对卵巢切除的成年鼠骨容量和骨密度的影响。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。

效果实施例1：高钙低磷饮食对正常成年小鼠骨形成的影响

实验动物：三周龄C57/6J小鼠20只

实验分组：断奶后(三周龄)C57/6J小鼠20只，随机分为2组，每组10只，一组为正常饮食组，给予正常饮食(含1％钙，0.67％磷)，另一组给予高钙低磷饮食(含2.0％钙，0.4％磷)。2组小鼠喂养至四月龄，用于下列实验。

取材：四月龄实验小鼠通过吸入麻醉经心腔穿刺取血，离心取血清，冻存备用；经膀胱穿刺取尿液，冻存备用；取右侧股骨和胫骨经70％酒精固定，避光保存用于微-CT分析和制备树脂包埋半薄切片；取左侧股骨、胫骨和腰椎体用PLP固定液(浓度为2％副醛，含0.075M赖氨酸和0.01M过碘酸钠)固定过夜，磷酸缓冲液洗涤，用于制备石蜡切片；取左右两侧肱骨-80℃冻存用于RNA提取。

血清和尿液生化学分析：血清和尿液钙、磷及尿肌酐通过自动分析仪分析(Beckman)测定，血清1，25(OH)₂D₃和PTH水平经放免法测定。

微-CT分析：经70％酒精固定的胫骨上端使用SkyScan1072微CT扫描仪扫描，经SkyScan，软件(Antwezp，Belgium)，重建胫骨干骺端三维图像。

组织学分析:PLP固定的股骨下端、胫骨上端和腰椎体经EDTA-G脱钙液^[10](14.5％EDTA，10％甘油)脱钙，梯度酒精(酒精浓度从100％，95％，80％，降至70％)脱水，石蜡包埋并切片，石蜡切片分别作常规HE染色、碱性磷酸酶(ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)和总胶原组织化学染色。

钙黄绿素双重染色标记：为了检查高钙低磷对骨形成的影响，动物处死前10天和3天分别腹腔注射10μg钙黄绿素/g体重，70％酒精固定的股骨上端经树脂包埋，使用超薄切片机切1μm厚的切片。在荧光显微镜下观察并拍照。使用Northern Eclipse 6.0分析软件测量双重钙黄绿素标记的间距。矿盐沉积率(MAR)通过下列公式计算。

MAR(μm/d)＝双重钙黄绿素标记间距÷两次注射间隔天数

骨髓细胞培养：取四月龄实验小鼠无菌分离股骨和胫骨，使用DMEM培养液冲沈出骨髓并通过反复吹打及通过22号针头制备成单细胞骨髓细胞悬液。2×10⁶个骨髓细胞在5ml DMEM培养液(含有10％胎牛血清，50μg/ml抗坏血酸，10mM β-磷酸甘油和10^-8M地塞米松)中培养18天。每4天换液1次，终止培养后，经磷酸缓冲液洗一次，PLP固定液固定15分钟后，先后进行ALP细胞化学染色和甲基蓝染色，空气干燥后拍照。

组织形态学的分析：通过使用Northern Eclipse图像分析软件在ALP染色切片上作了ALP阳性面积的测定；在TRAP染色切片上作了破骨细胞定量分析，在胶原染色切片上作了小梁骨容量的定量分析；在ALP细胞化学染色和甲基蓝染色培养皿上分别作了ALP阳性细胞面积和总细胞的面积的定量分析。

RT-PCR：使用Trizol(购自美国invitrogen公司)从肱骨中提取RNA，并使用QIAGEN一步法RT-PCR试剂盒检测了核因子κB受体活化因子配体(RANKL)、护骨素(OPG)、ALP、I型胶原(α1(I)Procollagen)和骨钙素(OCN)在骨组织的表达。PCR引物和条件见表1。RT-PCR操作步骤是本领域普通技术人员公知的技术。

表1.用于本研究的RT-PCR的引物和它们的序列、退火温度、扩增子的长度(bp)及其循环数

名称    正义/  引物序列    退火  扩增子的循环数

反义链温度(℃)  长度(bp) RANKL  OPG  ALP  α1(I) Procollagen  OCN  GAPDH正义反义正义反义正义反义正义 反义正义反义正义反义  CACACCTCACCATCAATGCTGC  GAAGGGTTGGACACCTGAATGC  TCCTGGCACCTACCTAAAACAGCA  CTACACTCTCGGCATTCACTTTGG  CTTGCTGGTGGAAGGAGGCAGG  CACGTCTTCTCCACCGTGGGTC  TCTCCACTCTTCTAGTTCCT   TTGGGTCATTTCCACATGC  CAAGTCCCACACAGCAGCTT  AAAGCCGAGCTGCCAGAGTT  CATGGAGAAGGCTGGGGCTC  CACTGACACGTTGGCAGTGG  55   55   68   60    60   60    813     719     393     269      370     414    35     35     30     30      35     30

实验数据

1、高钙低磷对血清和尿钙、磷水平及血清1，25(OH)₂D₃和PTH水平的影响：与正常钙磷饮食相比，高钙低磷饮食并不显著升高血清钙磷水平(图1a和图1b)，但增加尿钙的排泄，显著降低血清1，25(OH)₂D₃和PTH水平(图1c和图1d)。

2、高钙低磷对骨容量的影响：为了观察高钙低磷对骨容量的影响，我们利用微-CT和总胶原染色的石蜡切片经图像分析定量检查骨容量的改变。与正常饮食相比，无论微-CT检查(图2a)还是通过组织学检查(图2b)，都显示高钙低磷饮食显著增加胫骨、股骨和椎体的小梁骨容量(图2c)。

3、高钙低磷对骨吸收指数的影响：为了明确高钙低磷对骨容量的影响是否与骨吸收指数的改变有关，我们通过TRAP组化染色，图像定量分析破骨细胞数量和平均大小，利用RT-PCR检测了RANKL和OPG基因表达水平，观察了骨吸收指数的改变。结果显示高钙低磷组TRAP阳性的破骨细胞数和平均大小较正常饮食组均显著下降(图3a，b和c)高钙低磷不但升高RANKL基因表达水平，也升高OPG基因表达水平(图3a)，且OPG的升高较RANKL的升高更加明显，从而引起RANKL/OPG比例下降，抑制破骨细胞的形成和活性，继而抑制了骨吸收，降低了骨的新陈代谢，这些结果证明高钙低磷饮食可通过抑制骨吸收而增加骨量。

4、高钙低磷对骨形成指数的影响：为了明确高钙低磷对骨容量的影响是否与骨形成指数有关，我们通过运用钙黄绿素双标记和ALP组织化学和图像分析及RT-PCR检查成骨细胞特异基因ALP，I型胶原和骨钙素表达水平，观察骨形成指数的改变。结果显示高钙低磷组MAR和ALP阳性的成骨细胞较正常饮食组均显著升高(图4a，b和c)，与形态学观察结果一致，高钙低磷同时也上调ALP、I型胶原和骨钙素基因表达水平。

为了进一步明确成骨细胞形成的增加是否与从骨髓征收成骨细胞前体的增加有关，我们运用Ex vivo骨髓细胞培养技术，ALP细胞化学染色，甲基蓝染色和图像分析对高钙低磷对成骨细胞征收进行观察。结果显示：高钙低磷不仅增加了CFU-f(成纤维细胞总集落)(图5c和d)，也增加了CFU-f_AP(ALP阳性的成纤维细胞集落)(图5e和f)。

这些结果说明高钙低磷饮食通过促进骨髓成骨细胞前体的征收、分化、增加成骨细胞骨形成而增加骨小梁容量，再次证明高钙低磷饮食可通过刺激成骨细胞形成而使骨形成率增加。

效果实施例2：高钙低磷饮食对正常和PTH缺乏小鼠骨形成的影响

甲状旁腺素(PTH)杂合子亲代小鼠雌雄配对，分别喂以正常饮食(含1％钙，0.67％磷)或高钙低磷饮食(含2.0％钙，0.4％磷)至子代小鼠断奶(3周龄)，分别取正常饮食母鼠哺乳或高钙低磷母鼠哺乳的野生型(WT)和PTH纯合子(PTH^-/-)子代小鼠各6只，通过吸入麻醉后，取胫骨经PLP固定，通过X线摄影和微-CT扫描后三维重建分析(SkyScan软件，Antwezp，Belgium)3周龄子代小鼠的骨密度和骨容量。

野生型(WT)和PTH纯合子子代小鼠是由PTH杂合子亲代小鼠交配产生的，由PTH杂合子亲代小鼠交配产尘的小鼠有三种类型，分别为野生型(WT)、PTH纯合子和PTH杂合子子代小鼠。其中野生型(WT)和PTH杂合子子代小鼠PTH正常，PTH纯合子子代小鼠PTH缺乏。PTH缺乏时，3周龄小鼠骨容量和骨密度均降低，表现为低钙高磷血症。给予高钙低磷饮食不仅纠正低钙高磷血症，而且使骨容量和骨密度增高。

实验数据：

X-线摄影和微-CT分析发现，无论由正常饮食还是由高钙低磷饮食母鼠哺乳的PTH纯合子仔鼠的骨密度和骨容量都比野生型仔鼠低。然而由高钙低磷饮食母鼠哺乳的WT和PTH纯合子仔鼠鼠的骨密度和骨容量比正常饮食哺乳的仔鼠明显增加(图6)。这一结果说明怀孕及哺乳期给予高钙低磷饮食能够促进儿童骨骼的发育。

效果实施例3：高钙低磷饮食对卵巢切除小鼠骨量的影响

12只4周龄雌性小鼠施行双侧卵巢切除术后，随机分为两组。一组喂以正常饮食(含1％钙，0.67％磷)，另一组喂以高钙低磷饮食(含2％钙，0.4％磷)至12周龄。经吸入麻醉后，取股骨经PLP液固定，通过X线摄影和微-CT扫描后三维重建和骨小梁容量分析(Skyscan，Antwezp，Belgium)。

实验数据：

X线摄影发现，高钙低磷饮食组的骨密度明显高于正常饮食组(图7a)。微-CT三维重建和骨小梁容量分析结果显示，高钙低磷饮食组的骨容量明显高于正常饮食组(图7b和c)。

制备实施例1

以10万ml计，配方为碳酸钙4.99kg、磷酸二氢钾1.143kg、辅料：蔗糖5kg，蜂蜜5kg，调味剂适量，其余为净化水。其方法主要是：将各原辅料加水溶解，混合均匀并稀释，调整pH值7～8，灌装灭菌。

制备实施例2

取碳酸钙4.99kg，磷酸二氢钾1.143kg，果糖10kg，玉米淀粉83.867kg，常规工艺制备成片剂。

制备实施例3

取碳酸钙4.99kg，磷酸二氢钾1.143kg，果糖8.867kg，玉米淀粉85kg，常规工艺制备成胶囊剂。

制备实施例4

取碳酸钙3.2kg，磷酸二氢钾1.143kg，果糖20.65kg，大米米粉75kg，维生素D40000IU，常规工艺制备成颗粒剂。

                   序  列  表

<110>苗登顺

<120>一种钙磷合剂及其应用

<160>12

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠RANKL正义链引物序列

<400>1

cacacctcac catcaatgct gc   22

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠RANKL反义链引物序列

<400>2

gaagggttgg acacctgaat gc   22

<210>3

<211>24

<212>DNA

<213>C57/6J小鼠OPG正义链引物序列

<400>3

tcctggcacc tacctaaaac agca 24

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠OPG反义链引物序列

<400>4

ctacactctc ggcattcact ttgg 24

<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠ALP正义链引物序列

<400>5

cttgctggtg gaaggaggca gg   22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠ALP反义链引物序列

<400>6

cacgtcttct ccaccgtggg tc   22

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠α1(I)Procollagen正义链引物序列

<400>7

tctccactct tctagttcct      20

<210>8

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠α1(I)Procollagen反义链引物序列

<400>8

ttgggtcatt tccacatgc       19

<210>9

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠OCN正义链引物序列

<400>9

caagtcccac acagcagctt      20

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠OCN反义链引物序列

<400>10

aaagccgagc tgccagagtt   20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠GAPDH正义链引物序列

<400>11

catggagaag gctggggctc   20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>C57/6J小鼠GAPDH反义链引物序列

<400>12

cactgacacg ttggcagtgg   20