利用分子标记选育抗粗缩病的玉米自交系

摘要

本发明公开了一种利用玉米粗缩病抗性位点的分子标记选育抗粗缩病的玉米自交系的方法，即将来自玉米粗缩病抗性自交系的3个位点的分子标记应用于玉米抗粗缩病育种及基因聚合育种。以抗粗缩病和感粗缩病的玉米自交系等为材料，构建分离群体，利用与3个粗缩病抗性基因位点紧密连锁的分子标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268等进行辅助选择，以带有3个或2个抗病基因位点的植株为入选材料进行回交和自交，结合综合性状选择和自交纯合，获得高抗粗缩病的优良玉米自交系。

说明书

技术领域

本发明属玉米育种和植物生物工程领域，具体说，涉及一种利用玉米粗缩病抗性位点的分子标记选育抗粗缩病的玉米自交系的方法。

背景技术

玉米粗缩病的研究进展：

1、玉米粗缩病危害及发病原因

玉米粗缩病(Maize Rough Dwarf Disease，MRDD)是严重危害玉米生产的一种病毒病。玉米粗缩病的症状是在幼叶中脉两侧的细脉间有透明虚线小点，以后透明小点逐渐增多，叶背面的叶脉上产生粗细不一的蜡白色突起，手摸有明显的粗糙感；病株植株矮缩，节间缩短；叶色浓绿；叶片短宽肥厚，僵直挺立，常有皱褶；雌雄穗发育不良，严重者不能结实。

1949年玉米粗缩病首次在意大利被发现，此后在法国等欧洲国家和阿根廷等南美洲国家都有不同程度的发生。1954年首次在我国新疆南部、甘肃西部发现玉米粗缩病。上世纪70年代以来，玉米粗缩病在华北、西北和东北的部分地区引发大面积毁种或绝产，成为玉米生产的重要病害。至今我国已报道发生过玉米粗缩病的省市有13个。根据1996年不完全统计，全国玉米粗缩病发病面积233万hm²，绝收4万hm²，重病区一般病株率40％左右，平均10％～30％。2006年，玉米粗缩病又在山东、河北等省区大面积发生，造成较大损失。

玉米粗缩病毒(maize rough dwarf virus，MRDV)、Mal de Río Cuarto virus(MRCV)和水稻黑条矮缩病毒(rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)是迄今报道的能引起玉米粗缩病的三种病原。其中玉米粗缩病毒和Mal de Río Cuarto virus分别是欧洲和南美洲玉米粗缩病的病原。这三种病毒都属于呼肠孤病毒科斐济病毒属的第二组。三者在病毒粒子形态、寄主范围、传播介体、血清学和基因组电泳和序列等方面都非常相似。它们全部由飞虱传播，侵染植物后都局限于韧皮部。在我国，对于玉米粗缩病病原曾存在争论。1981年龚祖埙用电镜观察到河北省保定玉米粗缩病病原形态和大小类似于60年代华东地区发生的水稻黑条矮缩病毒，完整的病毒直径70-75nm，除去外壳直径65nm。2001年，我国学者根据病毒分离物的基因组序列信息，先后报道了引起中国玉米粗缩病的病原为水稻黑条矮缩病毒而不是玉米粗缩病毒。根据河北保定和武汉玉米粗缩病分离物与浙江水稻黑条矮缩病分离物在同等条件下进行生物学和分子生物学比较鉴定结果，表明其寄主范围及相互关系、主要寄主症状、介体昆虫及传病特性、病原形态都相同，三者基因组片段S7-S10的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为94.0％～99.0％和96.3％～100％，与日本RBSDV的亲缘关系很近，与意大利MRDV的关系稍远。2003年，王朝辉等完成了RBSDV湖北玉米分离物的基因组全序列测定和功能预测分析，进一步证明我国玉米粗缩病和水稻黑条矮缩病病原同为RBSDV。

在我国，RBSDV主要由同翅目昆虫灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)传播。RBSDV不经土壤、种子、花粉、嫁接和枝叶摩擦传播。灰飞虱属温带害虫，在我国分布广泛，以华北冬麦区和长江中下游稻区发生较多，生长发育的最适温度为15～28℃。其发生世代受地理和气候制约，一年发生代数在我国自北向南逐步由3代增至8代。灰飞虱的寄主主要为禾本科植物，最适合寄主是水稻、小麦等。玉米、小米、高粱等为非适生寄主，成虫在其上取食，但很少产卵和孵化。灰飞虱无毒虫在感染了RBSDV的植株上吸汁获毒，获毒所需时间最短1h，多数为24～48h。获毒所需的温度最低为8℃左右。病毒在虫体内的循回期一般为3～35天。适温条件下，循回期随气温升高而缩短，在平均气温24℃时，最短2h即可传毒，48h可充分传毒。灰飞虱无毒虫带毒后能终身传毒，但不能经卵传递到下一代。在“小麦-玉米”种植区，小麦植株上发生的第一代灰飞虱带毒虫是造成玉米粗缩病流行的主要侵染源。其病害循环过程为：春天第一代灰飞虱成虫在越冬寄主上取食获毒，然后向玉米植株迁移，小麦收获期间形成迁飞高峰，迁移高峰后约21天左右出现玉米粗缩病发病高峰。第2、3、4代灰飞虱转迁到麦田和田边杂草，传毒并在麦苗或草丛中越冬。

大面积种植不抗病或抗性差的杂交种是导致玉米粗缩病流行的重要原因。刘志增等对96份玉米自交系及由这些自交系组配的136个杂交组合进行了粗缩病抗性鉴定。结果表明，在鉴定的自交系中大部分表现为感病或中抗，只有6个自交系表现为高抗，未发现免疫类型。在杂交组合中，生产用的杂交种绝大部分表现为中感或高感，如掖单2号、掖单12、掖单13、掖单19和西玉3号等，它们是上世纪90年代玉米粗缩病高发区的主栽品种。

2、玉米粗缩病的抗病性鉴定和抗性的遗传分析

有关玉米粗缩病病情严重度的分级有诸多报道，但标准不尽一致，缺乏统一的病情严重度分级标准和抗病性评价标准，这反映了玉米粗缩病症状的复杂性，在一定程度上造成了抗病基因定位研究的困难。

1986年，陈巽祯等以株高、雌雄穗形状、散粉情况、叶片症状等将玉米粗缩病的病情严重度分为0-4级。1996年，刘志增等依据株高和叶片症状将病株分成0～3级。1998年，张会孔等对256个玉米粗缩病病株进行样本分析，依据单株粒重损失，制定了6级分级标准。2005年，苗洪芹以病害的典型症状为依据，制定了5级分级标准。2006年，路银贵通过对农大108、郑单958和德玉18等3个玉米品种感染玉米粗缩病后株高与单株产量的测定，按病株与健株株高的比值建立了玉米粗缩病严重度分级标准，即检测植株的株高与健株株高的比值分别为1、4/5、2/3、1/2、1/3时，对应的植株病级依次为0、1、2、3、4级，而0-4级植株的产量损失率依次为0、25％、50％、75％和100％。

近年来，一些学者陆续开展了玉米品种抗粗缩病鉴定的工作。这些工作主要是通过田间自然发病进行鉴定，人工接种鉴定也有少量报道。结合粗缩病抗性鉴定的工作，玉米粗缩病抗性的遗传规律研究也同时进行。1995年，郭启唐等通过田间玉米粗缩病抗性鉴定，发现品种及自交系间具有明显的抗性差异。太单早12未发现病株，太9101×太9102病株率为4.7％，晋穗47×D358为9.6％，京单901为11.8％，A343×丹340为17％。观察了185份自交系，其中高抗(发病率小于10％)的材料有9份：冀8、综3、中黄64、GY237等，并发现来自不同种质材料的选系抗病性差异很大，先锋群体后代和亚热带群体后代的选系中抗病系分别为70％和55％，其中高抗材料占30％以上；MRS(美国杂交种)选系材料高抗病系占9.7％，而5003的19份衍生系中仅有1份是抗病的。通过对自交系配制的杂交组合的抗病性分析，得出自交系抗病性对后代具有显著的遗传力。Basso等在四类自然发病区对玉米粗缩病抗性进行了配合力分析，检测到显性效应和加性效应显著制约抗性的表现，自交系的一般配合力效应在遗传因素中占有较大比重。1996年，刘志增等对96份自交系及136份杂交组合进行了抗粗缩病鉴定，结果大部分自交系表现感病或中抗，只有6份材料表现高抗。国外种质的抗病性总体上要优于国内种质。生产用的杂交种抗病品种很少，绝大部分表现中感或高感。杂交种抗病性与双亲抗病性中密切相关，杂交组合的抗病性大部分介于双亲之间，很少有超亲现象出现，并推测玉米粗缩病抗性为数量性状。路银贵等对从美国引进的78份抗玉米粗缩病重组近交系材料和国内选育的69份玉米自交系在河北保定进行了粗缩病抗性自然鉴定。结果表明，在引进的材料中，2份表现高抗，6份表现抗，5份表现为中抗，显示出了较好的粗缩病抗性。在国内的69份自交系中无高抗材料；178、P138、901141、9138、沈137表现抗，齐319、87-1、综3、冀35、获唐和2379表现中抗。试验结果还说明选自美国78599系的自交系抗性表现好。王安乐等利用6个自交系分析了定向轮回选择对玉米抗粗缩病改良的效果，认为玉米抗粗缩病性状为数量性状，且微效多基因的加性效应在性状表达中占较大比重。

对于玉米粗缩病这类病毒性病害，在不同年份和不同地区病害的发生情况有明显不同，进行植株抗病性自然鉴定难度较大。因此，建立玉米粗缩病人工接种鉴定技术很有必要。可靠的人工接种技术可保证玉米粗缩病的病原及抗病性鉴定工作的连续性和重复性。1998年，王安乐等利用网棚控制灰飞虱传毒，对50个玉米自交系进行了粗缩病抗性鉴定，以株高为参数调查各个材料的发病情况，计算抗病指数，得到了较自然发病鉴定稳定、可靠的结果。2005年，邸垫平等通过带毒灰飞虱进行了网箱集团接种。结果表明这种接种方法结合植株移栽可实现规模化大批量的人工接种。

使用抗病品种是防治病毒病的省时省力经济高效的方法，而且避免了农药对环境的污染。因此，从玉米种质资源中筛选和培育高抗玉米粗缩病的自交系和杂交种具有重要的意义。近年来，我国玉米育种者开展了抗源筛选工作，鉴定出了一些高抗玉米粗缩病的自交系，如P20、P138、齐319等。河北农科院的育种者利用来自美国的78599为材料，选育出高抗玉米粗缩病的自交系90110。利用现有的抗病种质资源培育高产抗病自交系和杂交种是我国农业生产上急需解决的问题。而传统育种方法不仅耗时长、需要大量的人力和物力，而且受制于抗病性鉴定困难等因素，收效缓慢。利用分子生物学手段，对抗病基因进行分子标记定位，不仅可以深入地研究粗缩病的抗病遗传规律和抗病机制，为抗病基因的克隆奠定基础，而且可通过分子标记辅助选择大大缩短育种时间，提高育种效率。

3、玉米粗缩病抗病基因定位研究

玉米病害是影响玉米生产的重要因素，近十几年来采用分子标记进行抗病基因标记和定位研究已有大量工作。目前，国外重要的玉米病害的抗病基因或QTL定位研究大多已有报道，如大斑病、小斑病、萎蔫病、灰叶斑病、普通锈病、南方锈病、穗腐病、丝黑穗病、露菌病、玉米矮花叶病、甘蔗花叶病、玉米花叶病、玉米条纹病、玉米黄矮病、玉米斑纹病和高原病毒病。我国学者利用国内的玉米材料已定位了一批抗病基因，如玉米矮花叶病、大斑病、纹枯病、南方锈病和茎腐病等，但有关玉米粗缩病抗病基因的研究国内外还未见报道。

根据对抗病基因定位的报道，可发现一些问题：1)利用不同的杂交组合可能得到不同的定位结果；2)在不同的环境下进行抗病性鉴定可能得到不同的定位结果；3)不同QTL作图群体类型可能会影响QTL定位结果；4)对抗病性的鉴定是影响基因定位的至关重要的因素。玉米植株粗缩病抗性的准确鉴定难度大。申请人实验室建立的玉米粗缩病人工接种鉴定体系和病原的荧光定量RT-PCR检测技术可以准确、可靠地鉴定分离群体中的植株发病与否。

在本实验室中，通过人工接种鉴定和田间自然鉴定两种方法，对由高抗自交系90110和高感自交系掖478杂交得到的F₂群体、BC₁群体和部分重组自交系群体进行了抗病性鉴定，获得了重复性好的鉴定结果，这为抗性基因的定位打下了坚实基础。为了快速地找到与玉米粗缩病抗性基因连锁的分子标记，申请人进行了SSR-BSA分析。15株F2的抗病植株的DNA等量混合组成F2抗池，10株F2的典型感病植株的DNA等量混合组成F2感池；15株BC₁的抗病植株的DNA等量混合组成BC₁抗池，15株BC₁的典型感病植株的DNA等量混合组成BC₁感池。用构建分子标记连锁图谱的SSR标记检测F₂抗池和F₂感池，然后再用在F₂抗池和F₂感池之间表现出多态的SSR标记检测BC₁抗池和感池。对于在BC₁的抗池和感池之间表现出多态性且与F₂抗池和感池之间的多态性相一致的标记，初步确定该标记可能与抗性基因连锁。结果有4个SSR标记在F₂的抗池和感池之间、BC₁的抗池和感池之间均表现出多态性，并且在BC₁的抗池和感池之间的多态与其在F₂的抗池和感池之间的多态相一致。这四个标记为：6号染色体上的umc1656(bin6.02区)，7号染色体上的umc1401(bin7.02区)，8号染色体上的bnlg1823(bin8.07区)和umc1268(bin8.07区)，其中bnlg1823和umc1268是相邻的标记。即将玉米粗缩病抗性位点(基因)Mrdd1定位到了bin6.02区，将Mrdd2位点定位到了bin7.02区，Mrdd3定位到了bin8.07区。由于这4个标记分别位于6、7、8染色体上，进一步分析得出自交系90110中至少可能存在3个玉米粗缩病抗病位点，即Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3。

在以上工作基础上，检测了150个经过抗病性鉴定的F₂单株的基因型。通过比较抗病位点与每一SSR标记之间的共分离比率，将3个抗病基因位点定位到了染色体上。在对Mrdd1位点定位时，21个F₂单株在Mrdd1位点的基因型与植株表型不符(即从该位点的基因型判断植株应为感病型，但植株表现出明显的抗病性，这是由于玉米粗缩病抗性是由多基因决定的，很可能其它位点的抗性基因决定了植株的抗病性)被淘汰，一共129个F₂单株的数据用于Mrdd1位点与其附近标记的共分离分析(表1)。在所选的6号染色体上的5个SSR标记中，umc1656是与Mrdd1位点距离最近的标记，两者之间的共分离比率为98.1％。根据Mrdd1位点和5个SSR标记之间的共分离比率，将Mrdd1位点定位到标记umc1656和bnlg2191之间，在F2分子标记连锁图谱中umc1656和bnlg2191之间的遗传距离为4.5cM。

表1、F₂群体中Mrdd1位点的共分离分析^a

  标记和位点  Mrdd1  Umc1006  umc1083  umc1656  bnlg2191  umc1006  umc1083  umc1656  87.9％  89.6％  98.1％  97.7％  89.2％  91.7％

  bnlg2191  umc1595  97.6％  92.3％  85.1％  80.2％  87.9％  83.5％  95.8％  91.3％  95.7％

^a选取了Mrdd1位点附近的5个SSR标记检测了150个F₂单株，129株F₂单株的数据用于共分离分析。

在定位Mrdd2位点时，24个F₂单株的数据由于它们在Mrdd2位点的基因型与植株表型不符被淘汰，一共126个F₂单株的数据用于Mrdd2位点与其附近标记的共分离分析(表2)。在所选的7号染色体上的4个SSR标记之中，umc1401是与Mrdd2位点距离最近的标记，两者之间的共分离比率为94.5％。根据Mrdd2位点和这4个SSR标记之间的共分离比率，将Mrdd2位点定位到标记umc1401和umc1666之间，在F₂分子标记连锁图谱中umc1401和umc1666之间的遗传距离为11.1cM。

表2、F₂群体中Mrdd2位点的共分离分析^a

  标记和位点  Mrdd2  umc1695  umc1401  umc1666  umc1695  umc1401  umc1666  umc2141  84.6％  94.5％  93.3％  87.7％  89.6％  78.4％  72.2％  88.6％  82.6％  93.8％

^a选取了Mrdd2位点附近的4个SSR标记检测了150个F₂单株，126株F₂单株的数据用于共分离分析。

在定位Mrdd3位点时，24个F₂单株的数据由于它们在Mrdd3位点的基因型与植株表型不符被淘汰。一共126个F₂单株的数据用于Mrdd3位点与其附近标记的共分离分析(表3)。在所选的8号染色体上的5个SSR标记之中，bnlg1823是与Mrdd3位点距离最近的标记，两者之间的共分离比率为97.8％。根据Mrdd3位点和这5个SSR标记之间的共分离比率，将Mrdd3位点定位到标记bnlg1823和umc1268之间，在F₂分子标记连锁图谱中bnlg1823和umc1268之间的遗传距离为5.8cM。

表3、F₂群体中Mrdd3位点的共分离分析^a

  标记和位点  Mrdd3  umc1728  umc2014  bnlg1823  umc1268  umc1728  umc2014  bnlg1823  umc1268  umc1032  78.8％  89.8％  97.8％  94.3％  88.0％  91.0％  81.3％  73.2％  69.3％  90.0％  85.1％  77.3％  93.8％  84.4％  91.1％

^a选取了Mrdd3位点附近的5个SSR标记检测了150个F₂单株，126株F₂单株的数据用于共分离分析。

4、作物分子标记辅助育种研究现状

在作物育种中，最有效的选择方法是直接依据植株的基因型进行选择，分子标记的出现为这种直接选择提供了可能。分子标记辅助选择(MAS)可在早代对目标基因进行准确、稳定的选择从而加速育种进程，提高育种效率。该技术的关键是与重要农艺性状紧密连锁的DNA分子标记的发掘和高通量检测。近年来，各国学者已经鉴定到了水稻、小麦、玉米、棉花、大豆等作物的一系列农艺性状的分子标记，这为MAS奠定了基础。吴为人等、Moreau等、Berloo等和Hospital等分别发表多篇研究论文阐述了MAS的方法和影响因素，这为MAS的实施提供了理论支持。MAS包括对目标基因跟踪即前景选择(foreground seleetion)和对遗传背景的选择(background selection)。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因之间的连锁紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，当要求选择正确率达到90％以上，则标记与目标基因的重组率要小于5％。如果用两侧相邻标记对目标基因进行跟踪选择，可大大提高选择正确率。背景选择可加快遗传背景恢复速度、缩短育种年限和减轻连锁累赘。Tanksley等通过计算机模拟分析得出，采用MAS只需3代即可使杂种恢复到接近轮回亲本的基因型。目前，MAS已在水稻、小麦、玉米等主要作物的育种实践中应用并取得了较大的进展，主要包括基因转移、基因聚合和数量性状MAS。国际水稻研究所利用4个含有不同水稻白叶枯病抗性基因(xa4、xa5、xa13、xa21)近等基因系进行抗性基因的聚合，所产生的抗性基因累积的品系比含有单个抗性基因的品系具有更高的抗性水平和对病原菌更广的抗谱。陈升等以IRBB21为供体材料，利用4个与Xa21紧密连锁的分子标记对‘明恢63’进行分子标记辅助改良，获得了抗白叶枯病‘明恢63’。薛庆中等、黄廷友等、彭应财等、童海军等、曹立勇等、罗彦长等分别通过杂交和回交，结合分子标记辅助选择，将该基因导入不同的水稻亲本中，选育出一批抗白叶枯病的新恢复系和不育系，并进一步配组育成了协优218、中优218、II优8220、国稻1号等抗病杂交稻新组合。另外，在水稻抗虫、抗稻瘟病等方面也取得了一定的进展。以玉米为材料的分子标记辅助选择工作相对较少，但成就斐然。美国学者将玉米与产量有关的一些数量性状基因座位转移到了B73和Mo17等自交系中，由这些自交系组配的杂交种的产量比对照杂交种提高15％以上。张世煌等利用与opaque-2基因紧密连锁的分子标记进行了优质蛋白玉米的分子标记辅助选择，建立起一套经济实用的优质蛋白玉米分子标记辅助育种新体系。大量的理论研究和育种实践证明了分子标记辅助选择是作物育种技术的发展方向。

一般来说，分子标记辅助选择育种对于那些由多基因控制、受环境影响严重的复杂性状的效果比对于单基因控制的受环境因素影响较小的质量性状的选择效果更明显。玉米粗缩病就是一种抗病性鉴定困难的复杂性状，常规育种方法无论是通过田间自然发病鉴定还是通过人工接种鉴定抗病性，在选育抗粗缩病自交系和杂交种中都是费时费力收效不佳。应用分子标记辅助选择有望提高粗缩病抗病育种的效率。目前尚未见到采用分子标记辅助选择培育抗粗缩病玉米自交系的报道。

发明内容

本发明依赖于2项基础研究工作：1)以高感玉米粗缩病的我国玉米骨干自交系掖478为母本，以高抗玉米粗缩病的自交系90110为父本构建作图群体，取其F₂的150个单株构建分子标记连锁图谱。在278个表现多态性的标记中，有271个标记被划分成10个连锁群中。该图谱覆盖玉米基因组(总长)2164.3cM，标记间平均距离为7.98cM，形成了自交系掖478×90110的分子标记连锁框架图，适用于玉米主效基因定位以及QTL的定位分析。在该工作中，为了准确判断玉米植株粗缩病抗性，首先利用网室群体接种法分别研究了玉米的发育时期(叶龄)、接种的虫口密度和接种持续时间对粗缩病人工接种鉴定效果的影响，并利用ELISA和real-time RT-PCR鉴定了病原，分析了不同植株中的病毒含量，建立了稳定的玉米粗缩病人工接种鉴定体系，结合田间自然鉴定结果，对作图群体中F₂单株的抗病性进行了可靠的鉴定。2)以自交系掖478和自交系90110杂交构建的F₂群体和BC₁群体作为定位群体，将抗病位点Mrdd1位点定位在bin6.02的umc1656和bnlg2191之间4.5cM的区域内，将Mrdd2位点定位在bin7.02的umc1401和umc1666之间11.1cM的区域内，将Mrdd3位点定位在bin8.07的bnlg1823和umc1268之间5.8cM的区域内，并用重组自交系群体进行了验证。另外，通过关联分析确定了在“掖478×90110”的群体中抗粗缩病遗传位点来自90110。

本发明植物材料

玉米粗缩病高抗自交系90110、感病自交系掖478、488及其派生的自交系、DH4866、DH9942、掖502、掖515、吉853、郑58等感玉米粗缩病的优良玉米自交系及中间育种材料，和感粗缩病玉米自交系与自交系90110构建的F_2-6植株、F_2-4BC_1-3植株。F_2-6植株表示感粗缩病玉米自交系与高抗自交系90110杂交后自交2～6代的植株，F_2-4BC_1-3植株表示感粗缩病玉米自交系与高抗自交系90110杂交后自交代数为2～4并与感粗缩病自交系(轮回亲本)回交1～3代的植株。在获得杂种F1时，90110和感粗缩病自交系均可作为母本或父本。在进行回交时，感粗缩病自交系可作为父本，也可作为母本。

植株抗病性鉴定

植株抗病性鉴定采用人工接种鉴定和田间自然发病鉴定相结合的策略。人工接种鉴定采用王飞等报道的方法(2006)，即每株15头灰飞虱接种二叶期玉米植株，接种期5天。毒源为田间典型的玉米粗缩病发病植株。每一基因型接种鉴定15株，设3次重复。在植株开花期调查发病情况。自然发病鉴定材料一般在在5月上中旬分两次播种，实验地周围有较多的杂草。在抗病性鉴定中以自交系90110为抗病对照，掖478为感粗缩病对照。在田间自然鉴定中，一般每重复种植各基因型30株。按随机区组排列设置试验区。行长4.0m，种15株，行距75cm，试验区不使用杀虫剂，不清除杂草，水肥管理按常规进行。在开花期调查发病情况。发病率在0～10.0％的株系为抗病材料，发病率在10.1％～100％的自交系为感病自交系。可利用real-time RT-PCR鉴定病原，分析不同植株的病毒含量，确定鉴定结果。病毒含量测定采用荧光定量RT-PCR检测，取植株最上一片全展叶提取RNA，采用TRIZOL试剂盒提取。按照王飞等报道的程序及方法进行反转录和定量RT-PCR检测(王飞等，2006)。

玉米粗缩病抗性位点的SSR标记及其引物序列

6号染色体上的Mrdd1位点的SSR标记取umc1656、bnlg2191和umc1656，7号染色体上的Mrdd2位点的SSR标记取umc1401和umc1666，8号染色体上的Mrdd3的SSR标记取bnlg1823和umc1268。

表4、玉米粗缩病抗性位点检测所用的SSR标记引物序列

  SSR标记  引物序列  umc1656  AGTTTTGACCGCGCAAAAGTTA  GTACGAGCAGGCCATTAACCC  bnlg2191  CAGGTGGTGCAGAGTTTCACAT  AAGGTGGAGGATGACTCCAAGAT

  umc1595  GCTGCTGGTCTACAACCTCTTGTT  CGCTTGAAATGGAAAGGTAGAAAG  umc1401  CTCTGGTCCATCCTCATCGACT  TCTCTTGATCACATATCGATCCCA  umc1666  TTATTGCCCTCCCTGTTCTTGTT  ACCTTGACGCAGCAATCCTC  bnlg1823  TGTGACTCCATACCGCACAT  CTCATCATGTTGTACATGGCG  umc1268  ACGAACAACCTAGCACAGTCCTAAA  CAAGGCGGTTACCAAGTTTACATC

根据MaizeGDB提供的引物序列合成SSR引物(表4)。

分子标记检测

取3叶期或灌浆期植株的适量叶片，用CTAB法提取DNA。

SSR反应体系为：10×PCR缓冲液(不含Mg²⁺)1.0μl，MgCl₂(25mM)0.6μl，引物I(50ng/μl)0.7μl，引物II(50ng/μl)0.7μl，dNTP(10mM each)0.1μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.06μl，DNA模板(20ng/μl)2.5μl，无菌双蒸水4.34μl，合计10μl。

SSR反应条件：PCR反应在Biometra 96孔梯度PCR仪上进行，程序为：预变性95℃，5分钟；变性95℃，30秒；退火65℃，30秒；延伸72℃，1分钟；此后，每个循环退火温度降低1℃(降低至55℃)，共11个循环；接着：变性95℃，30秒；退火55℃，30秒；延伸72℃，1分钟；循环30次；过度延伸72℃，8分钟。

SSR扩增产物经6％的聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺∶甲叉双丙烯酰胺＝19∶1)电泳分离，银染法检测。

从分离群体中选择抗粗缩病个体

对目标基因的选择称为前景选择。前景选择的可靠性主要取决于标记与目标基因间连锁的紧密程度。若只用一个标记对目标基因进行选择，则标记与目标基因的连锁必须非常紧密才能达到较高的正确率。假设某标记座位(M/m)与目标基因座位(Q/q)连锁，重组率为r。在F₂代通过选择标记基因型M/M来获得目标基因型Q/Q的概率(即单株选择的正确率)为：p＝(1-r)²。依据此公式，选择正确率随重组率的增加而迅速下降。若要求选择正确率达到90％以上，则分子标记与目标基因间的重组率应小于或等于5％。若同时用两侧相邻的两个标记对目标基因进行选择，可大大提高选择的正确率。假设有两个标记座位(M1/m1和M2/m2)分别位于目标基因座位(Q/q)的两侧，与目标基因的重组率分别为r1和r2，F1代的基因型为M1QM2/m1qm2。那么，F1产生的标记基因型为M1M2的配子有两种类型，一种包含目标等位基因(M1QM2)，为亲本型，另一种包含非目标等位基因型(M1qM2)，为双交换型。由于双交换发生的概率很低，因此双交换型配子的比例很小。所以，在后代中通过同时跟踪M1和M2来选择目标等位基因Q，正确率必然很高。在单交换间无干扰的情况下，在F2代通过选择标记基因型M1M2/M1M2而获得目标基因型Q/Q的概率为：p＝(1-r₁)²(1-r₂)²/[(1-r₁)(1-r₂)+r₁r₂]。由此公式可知，在两标记间的图距固定的情况下，r₁＝r₂(亦即目标基因正好位于两标记之间的中点)为最坏的情形，这时的选择正确率为最小。在本发明中，Mrdd1两侧的SSR标记umc1656和bnlg2191之间的图距为4.5cM；Mrdd2两侧的umc1401和umc1666之间的图距为11.1cM的区域内；Mrdd3两侧的bnlg1823和umc1268间的图距为5.8cM。用这6个标记分别对Mrdd1、Mrdd2和Mrdd3进行选择，获得抗病的纯合基因型的各自最小的选择正确率约为95.5％，88.9％和94.2％；获得两个抗病位点为纯合基因型的最小的选择正确率分别为84.9％(Mrdd1和Mrdd2)，90.0％(Mrdd1和Mrdd3)和83.7％(Mrdd2和Mrdd3)。在实际情况中，单交换之间一般总是存在相互干扰的，这使得双交换的概率更小，因而双标记选择的正确率要比上述最小理论期望值更高。另外，遗传了任何两个来自90110的抗病位点的重组自交系或植株，在一般发病条件下表现出对玉米粗缩病的抗性。

在本发明中，玉米3个粗缩病抗性位点分别位于6、7、8号染色体上，在分离群体中带有3个或2个抗性位点的个体比例因分离群体的类型而变化，因此，利用分子标记辅助选择培育抗粗缩病玉米自交系的效率也取决于选择的技术路线。根据遗传分离定律，若只想改良某个优良自交系的粗缩病抗性，可选用BC₁F₁群体为起始选择世代，带有3个杂合的抗性位点的个体比例为12.5％，带有2个杂合的抗性位点的个体比例为37.5％。然后连续回交3代，若每代以带有3个杂合的抗性位点的个体为亲本，利用3个抗病位点两侧的6个SSR标记同时检测，则BC₄F₁植株已和轮回亲本基本相同(含轮回亲本遗传物质的96.9％)，然后自交1代，对BC₄F₂植株进行严格的抗病性鉴定，从中选出带有3个粗缩病抗性位点的综合性状优良的高配合力自交系。若除了改良某个优良自交系的粗缩病抗性外，还希望改良该自交系的其它性状，可选用F₂为起始选择世代，F₂群体中带有3个纯合或杂合抗性位点的个体为42％。然后以带有3个抗性位点的个体为亲本，连续回交2～3代，再自交1～2代，获得合乎选育目标的新的优良自交系。在该过程中，BC₁F₂群体中带有3个抗性位点的个体＞12.5％；在BC₃F₂群体中带有3个抗性位点的个体也＞12.5％，入选植株的轮回亲本遗传物质比例平均为87.5％；在BC₄F₂群体中带有3个抗性位点的个体也＞12.5％，入选植株的轮回亲本遗传物质比例平均为93.8％。为了保持轮回亲本的高配合力，对感病自交系和90110的杂交后代一般进行3～4代回交，每代辅以分子标记辅助选择。

由于玉米粗缩病抗性位点有3个，进行分子标记辅助选择时可选用2种程序：1)仅挑选带有3个抗性位点的个体；2)可选择带有2个抗性位点的个体，在植株性状接近轮回亲本时让不同入选材料杂交，从而获得带有3个抗性位点的抗粗缩病材料。

一般说来，通过利用这6个SSR标记进行基因型选择，每代均可以选出高抗粗缩病(带有3个抗性位点)的优良个体，且工作量不大。

基本操作过程：

1)以感粗缩病的玉米优良自交系为轮回亲本，90110为抗性基因供体亲本，杂交并回交或自交，建立分离群体(如BC₁F₁、BC₁F₂、BC₁F₃、BC₂F₂、BC₁F₁×BC₁F₁、BC₁F₁×BC₁F₂等)。

2)种植分离群体的种子，在小苗3叶期时，提取单株叶片DNA为模板，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物进行经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，选出带有3个抗病位点或2个抗病位点的个体予以保留。

3)入选植株长大后根据选育程序进行套袋回交或自交，并根据植株综合性状进行优选。优选出的植株种子播在花盆或田间进行下一代分子标记辅助选择及植株优选。

4)对优选植株的后代继续种植和分子标记辅助选择及植株优选，直到植株性状不再明显分离。然后自交1～2代获得高抗粗缩病的优良自交系。

5)对带有2个抗病位点的入选材料，若其中1个抗病位点不同，可通过相互杂交聚合3个抗病位点。然后从杂交后代中采用分子标记辅助选择获得带有3个抗病位点的个体，再将后者自交1～2代获得高抗粗缩病的优良自交系。

6)对性状基本稳定的株系进行人工接种和田间自然发病鉴定，进行农艺性状的优选和配合力测定，确定高抗玉米粗缩病的优良自交系的应用价值。

若选育的目标自交系除玉米粗缩病抗性性状外其他性状相同于轮回自交系(感病优良自交系)，可从BC₁F₁群体入手，采用连续回交转育策略改良自交系。在每一回交世代中进行分子标记辅助选择。这样，从杂交开始，一般通过5～6个世代就可达到预期目标。

不同杂交组合的遗传背景对分子标记辅助选择效果会产生一定影响，在不同的杂交组合中，即在不同遗传背景下基因的分子标记会出现差异。因此，当组建多个杂交组合时，目标基因的供体均选自交系90110为宜。这样，已寻找到的分子标记一般与目标基因紧密连锁，可适用于入选同样目标基因的不同分离群体。在少数分离群体中，若一些分子标记可用性出现变化，则可利用这些SSR标记附近的分子标记。在本发明中，操作方案的确定以最大限度地保证已有分子标记的可用性为前提。

附图说明

图1感病玉米植株表型。

图2SSR标记umc1656、umc1401、bnlg1823和umc1268的BSA分析。

泳道1-9的样品分别为：90110、掖478、F₁、F₂抗池、F₂感池、90110、掖478、BC₁抗池和BC₁感池。

具体实施方式

实例1：培育抗玉米粗缩病的掖478优异改良系

以掖478或其改良系为受体和轮回亲本，以自交系90110为抗病基因位点的供体，主要通过目标基因的前景选择来获得优异改良系。

程序一：

1)以掖478为母本、90110为父本进行杂交，产生F₁植株。此步骤可在第一年1～4月份于温室或海南完成。

2)F₁植株自交产生F₂种子。此步骤在第一年5～8月份于我国北方完成。

3)F2种子播在花盆中，植株3叶期时提取叶片DNA，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，选出带有3个抗病位点的个体20～30株移栽到大田中。此步骤可在第一年9～10月份于我国北方或海南完成。

4)入选植株抽雄后套袋与掖478回交，并严格进行田间观察记载，收获前根据植株综合性状淘汰劣株。果穗收获后进行考种、优选。一般保留10～15个果穗。此步骤可在第一年10月到第二年1月份于温室或海南完成。

5)选留的不同BC₁F₂种子播在花盆中进行分子标记检测(同F₂代)，然后将入选植株移栽到大田中生长，植株抽雄后套袋与掖478回交产生BC₂F₂种子。严格进行植株及果穗优选。一般保留带有3个抗病位点植株的果穗4～5个，或带有3或2个抗病位点的果穗共10个。若植株类型较多，可选留较多的果穗。此步骤在第二年3～6月份于我国北方完成，苗期植株最好生长于温室，检测后移栽到塑料大棚。

6)将BC₂F₂种子播在花盆中进行分子标记辅助选择(同F₂代)及植株优选。入选植株与掖478套袋回交产生BC₃F₂种子。一般保留带有3个抗病位点植株的果穗4～5个，或带有3或2个抗病位点的果穗共10个。此步骤可在第二年7～10月份于我国北方完成。

7)将BC₃F₂种子播在田间继续进行分子标记辅助选择(同F₂代)，对入选株系进行综合性状的评选，并在植株抽雄后套袋与掖478回交产生BC₄F₂种子。一般保留果穗数与上代相近。此世代株系内植株性状整齐，但株系间可出现明显差异。同时，将入选株系的部分植株与优良自交系杂交(包含与轮回亲本杂交有优异杂种优势的自交系)，制备杂交种子，准备配合力测定。此步骤可在第二年11月到第二年3月份于温室或海南完成。

8)在进行步骤6)或7)时，可对带有2个抗病位点的入选材料进行杂交。用于杂交的入选植株在一个抗病位点不同，彼此性状最好差异不大。通过杂交可将3个抗病位点聚合到一个基因型中，且植株性状改变较小。然后从杂交后代中采用分子标记辅助选择获得带有3个抗病位点的个体。

9)将带有3个抗病位点的植株自交1～2代获得抗病位点纯合的自交系，并对植株进行严格的抗病性鉴定、综合性状评选和配合力测定，选育出合乎育种目标的高抗粗缩病的优良自交系。此步骤在第三年4～9月份于我国北方进行，也可在第四年4～9月份于我国北方重复一次。

在该程序中，通过温室和海南种植进行加代，综合性状选择和配合力测定同常规育种。选育出的自交系高抗粗缩病，可在一些性状上与轮回亲本有差异。

程序二：

1)以掖478为母本、90110为父本杂交产生F₁植株。此步骤可在第一年1～4月份于温室或海南完成。

2)F₁植株与掖478回交产生BC₁F₁种子。此步骤在第一年5～8月份于我国北方完成。

3)BC1F1种子播在花盆中，植株3叶期时提取叶片DNA，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物进行6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，选出带有3个抗病位点个体6株移栽到大田中。此步骤可在第一年9～10月份于我国北方完成。

4)入选植株抽雄后套袋与掖478回交，并严格进行田间观察记载，收获前根据植株综合性状淘汰劣株。果穗收获后进行考种、优选。一般保留果穗3个左右。此步骤可在第一年10月到第二年2月份于温室或海南完成。

5)选出的来自不同果穗的BC₂F₁种子播在花盆中进行分子标记辅助选择(同BC1F1代)，然后将入选植株(约5～8株)移栽到大田中生长，植株抽雄后与掖478回交产生BC₃F₁种子。并进行植株及果穗优选。一般保留带有3个抗病位点植株的果穗3～5个。此步骤在第二年3～6月份于我国北方完成，苗期植株生长最好于温室，然后移栽于塑料大棚。

6)将BC₃F₁种子播在花盆中进行分子标记辅助选择(同BC1F1代)及植株优选。入选植株与掖478回交产生BC₄F₁种子。此世代同一株系的植株性状基本整齐一致，可同期制备配合力测定的种子(选用的自交系和轮回亲本有优异的杂种优势)。一般选留带有3个抗病位点植株的果穗3个。此步骤在第二年6～10月份于我国北方完成。

7)将BC₄F₁种子播在田间继续进行分子标记辅助选择(同BC1F1代)，然后将带有3个抗病位点的植株自交。一般选留果穗数3～5个。此步骤可在第二年11月到第三年3月在温室或海南完成。。

8)将BC₄F₂植株(带有3个抗病位点的植株)再自交1代，获得粗缩病抗性位点纯合的自交系。同期进行配合力测定，并对植株进行严格的抗病性鉴定和综合性状评选，获得合乎育种目标的高抗粗缩病的优良自交系。该自交系基本相同于轮回亲本。

实例2：培育抗玉米粗缩病的掖502的优异改良系

以掖502或其改良系为受体和轮回亲本，以自交系90110为抗病基因位点的供体，主要通过目标基因的前景选择来获得优异改良系。因掖502抗病性较差，进行多性状改良是最好方案。

程序一：

1)以掖502为母本、90110为父本杂交产生F₁植株。此步骤可在第一年1～4月份于温室或海南完成。

2)F₁植株自交产生F₂种子。此步骤在第一年5～8月份于我国北方完成。

3)F2种子播在花盆中，植株3叶期时提取叶片DNA，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，选出带有3个抗病位点的个体30～50株移栽到大田中。此步骤可在第一年9～10月份于我国北方或海南完成。

4)入选植株抽雄后套袋与掖502回交，并严格进行田间观察记载，收获前根据植株综合性状淘汰劣株。果穗收获后进行考种、优选。一般选留果穗20个左右。此步骤可在第一年10月到第二年1月份于温室或海南完成。

5)选留果穗的BC₁F₂种子播在花盆中进行分子标记辅助选择(同F₂代)，然后将入选植株移栽到大田中生长，植株抽雄后与掖502回交产生BC₂F₂种子。并进行植株及果穗优选。一般保留带有3或2个抗病位点的果穗共40个。若植株类型较多，可选留较多的果穗。此步骤在第二年3～6月份于我国北方完成，苗期植株最好生长于温室，然后移栽于塑料大棚。

6)将BC₂F₂种子播在田间进行分子标记辅助选择(同F₂代)。入选植株与掖502回交产生BC₃F₂种子。同时进行植株及果穗优选，一般保留带有3或2个抗病位点的果穗20个。此步骤在第二年7～10月份于我国北方完成。

7)将BC₃F₂种子播在田间继续进行分子标记辅助选择(同F₂代)，对入选株系进行综合性状的评选。此世代同一株系的植株性状较整齐。但株系间可有明显差异。入选植株抽雄后与掖502回交产生BC₄F₂种子。一般保留果穗数与上代相近。同时，将入选株系的部分植株与优良自交系杂交(包含与轮回亲本有优异杂种优势的自交系)，制备杂交种子，准备配合力测定。此步骤可在第二年11月到第二年3月份于温室或海南完成。

8)在进行步骤6)或7)时，可对带有2个抗病位点的入选材料进行杂交。用于杂交的入选植株应在一个抗病位点不同，且彼此间性状差异较小，通过杂交可将3个抗病位点聚合到一个基因型中。然后从杂交后代中采用分子标记辅助选择获得带有3个抗病位点的植株。

9)将带有3个抗病位点的植株自交1～2代得到抗病位点纯合的自交系，并对植株进行严格的抗病性鉴定、综合性状评选和配合力测定，选育出合乎育种目标的高抗粗缩病的优良自交系。此步骤在第三、四年4～9月份于我国北方进行。

程序二：

1)以掖502为母本、90110为父本杂交产生F₁植株。此步骤可在第一年1～4月份于温室或海南完成。

2)F₁植株自交产生F₂种子。此步骤在第一年5～8月份于我国北方完成。

3)F₂植株自交，产生F₃植株。此步骤可在第一年10月到第二年2月于温室或海南完成。

4)F₃种子播在田间，苗期和开花期根据农艺性状进行严格淘汰。植株授粉后提取叶片DNA，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191、umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物进行经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，选出带有3个抗病位点或2个抗病位点的个体50～60株与掖502回交。收获前根据植株综合性状淘汰劣株，然后进行考种，选留果穗30个左右。此步骤可在第二年3～6月份于我国北方完成。

4)选留果穗的BC₁F₃种子播在田间进行分子标记辅助选择(同F₃代)，然后将入选植株移栽到大田中生长，植株抽雄后套袋与掖502回交产生BC₂F₃种子。并进行植株及果穗优选。一般保留带有3个抗病位点植株的果穗8～10个，或带有3或2个抗病位点的果穗共10～15个。若植株类型较多，可选留较多的果穗。此步骤可在第二年7～10月份于我国北方完成。

6)将BC₂F₃种子播在田间进行分子标记辅助选择和植株优选(同F₃代)。入选植株与掖502回交产生BC₃F₃种子。一般保留带有3个抗病位点植株的果穗8～10个，或带有3或2个抗病位点的果穗共10～15个。此步骤在第二年11月到第三年3月份于温室或海南完成。

7)将BC₃F₃种子播在田间继续进行分子标记辅助选择(同F₃代)，对入选株系进行综合性状的评选，并在植株抽雄后与掖502回交产生BC₄F₃种子。一般选留果穗数与上代相近。此世代同一株系的植株性状较整齐，但株系间可有明显差异。同时，将入选株系的部分植株与优良自交系杂交(包含与轮回亲本有优异杂种优势的自交系)，制备杂交种子，准备配合力测定。此步骤可在第三年4～9月份于我国北方完成。

8)在进行步骤6)或7)时，可对带有2个抗病位点的入选材料进行杂交。用于杂交的入选植株应在一个抗病位点不同，彼此间性状差异较小。通过杂交可将3个抗病位点聚合到一个基因型中，然后从杂交后代中采用分子标记辅助选择获得带有3个抗病位点的植株。

9)将带有3个抗病位点的植株自交1代，使抗粗缩病位点部分或全部纯合。此步骤可在第三年11月到第四年2月份于温室或海南完成。

10)将带有3个抗病位点的植株再自交1代获得抗病位点纯合的自交系，并对植株进行严格的抗病性鉴定、综合性状评选和配合力测定，选育出合乎育种目标的高抗粗缩病的优良自交系。此步骤在第四年4～9月份于我国北方进行。

实例3：培育抗玉米粗缩病的优异自交系

以优良自交系DH4866和郑58为受体和轮回亲本，以自交系90110为抗病基因的供体，主要通过目标基因的前景选择来获得具有不同特点的优异改良系。步骤如下：

1)以DH4866和郑58分别为父、母本杂交，产生F₁种子。此步骤可在第一年1～4月份于温室或海南完成。

2)F₁植株自交产生F₂代种子，从F₂植株中择优自交产生F₃代种子，一般控制在30～40果穗。此步骤在第一年5～12月份于我国北方和/或海南完成。

3)F₃植株择优自交产生F₄代种子，收获果穗40～60个。此步骤在第二年1～4月份在温室或海南完成。

4)将F₄代种子播在田间，严格进行田间观察，将植株分为类DH4866型、类郑58型和中间型，选优良植株20～30株分别同90110杂交，产生系列“F_4-n×90110”种子(F_4-n代表n号F₄个体，n可以是1、2、3----X)。此步骤在第二年5～9月份于我国北方完成。

5)将“F_4-n×90110”种子播在田间，类DH4866型和类郑58型的植株后代，分别择优与F_4-n(n值相同，即取特定“F_4-n×90110”组合亲本的F_4-n自交后代为轮回亲本)回交，产生系列BC₁“F_4-n×90110”种子。中间型植株杂交后代自交，产生F₂“F_4-n×90110”种子。每组合回交3穗或自交20穗。此步骤在第二年10月到第三年3月于温室或海南完成。

6)将BC₁“F_4-n×90110”和F₂“F_4-n×90110”种子播在花盆，提取3叶期植株叶片DNA，分别用SSR标记umc1656、bnlg2191 umc1401、umc1666、bnlg1823和umc1268的引物进行PCR扩增，反应产物经6％的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法检测扩增产物的带型，从每一回交群体中选出带有3个抗病位点的个体5～10株、从每一自交群体中选出带有3个抗病位点的个体30～40株，然后移栽到大田生长并淘汰劣株。入选植株与其亲本F₄植株自交后代回交，并在收获前根据植株综合性状淘汰劣株。果穗收获后进行考种、优选。一般每BC₁“F_4-n×90110”或F₂“F_4-n×90110”群体的入选植株回交果穗选留3～5个。此步骤在第三年4～9月份于我国北方完成。

7)选留果穗的种子播在花盆中继续进行分子标记辅助选择(同步骤6)，然后将入选植株移栽到大田中生长，植株抽雄后套袋与轮回亲本回交，并进行植株及果穗优选。一般每BC₂“F_4-n×90110”或BC₁F₂“F_4-n×90110”群体的入选植株后代的回交果穗选留2～5个。若植株类型较多，可选留较多的果穗。此步骤在第三年10月到第四年2月份于温室或海南完成。

8)将上代选留果穗的种子播在田间进行分子标记辅助选择(同步骤6)。入选植株与轮回亲本回交，同时进行植株和果穗优选，一般每BC₃“F_4-n×90110”或BC₂F₂“F_4-n×90110”群体选留带有3或2个抗病位点的果穗共2-5个。此步骤在第四年4～9月份于我国北方完成。

9)将上代选留果穗的种子播在田间继续进行分子标记辅助选择(同步骤6)，对入选株系进行综合性状的评选，并对植株进行严格的抗病性鉴定。入选的带有3个抗粗缩病位点的植株自交结实。一般选留果穗数与上代相近。同时，将入选株系的部分植株与优良自交系杂交(包含与DH4866或郑58有优异杂种优势的自交系)制备种子，准备配合力测定。此世代同一株系的植株性状较整齐。但株系间可差异明显。此步骤可在第四年10月到第五年2月份于海南完成。

10)在进行步骤8)时，可对带有2个抗病位点的入选材料进行杂交。用于杂交的入选植株应在一个抗病位点不同，且彼此性状差异较小。通过杂交将3个抗病位点聚合到一个基因型中，然后从杂交后代中采用分子标记辅助选择获得带有3个抗病位点的个体。

11)将带有3个抗病位点的植株再自交1～2代得到纯合自交系，同时进行配合力测定、抗病性鉴定、综合性状优选，最终选育出合乎育种目标的高抗粗缩病的优良自交系，其中部分自交系具有DH4866或郑58的优异特性且高抗粗缩病。此步骤在第五、六年的4～9月间在我国北方完成。