防治温室蔬菜青枯病的菌株XY21

摘要

一种防治温室蔬菜细菌性青枯病的生防菌株XY21，属于农作物防病治病技术领域。XY21经鉴定为为沙雷氏菌属(Serratia sp.)，菌种保藏号为CGMCC NO.2059。XY21菌株在番茄根围表现出良好的定殖能力，浸种处理14天后该菌在植株根围定殖量为5.05×10

说明书

一、技术领域

本发明涉及防治温室蔬菜青枯病的单一菌株，属于农作物防病治病技术领域，专用于蔬菜青枯病的无公害防治。

二、技术背景

细菌性青枯病是一种重要植物土传病害，在热带，亚热带和温带地区普遍发生，为害严重。我国主要农作物马铃薯、番茄、烟草等均受该菌为害，造成不同程度的损失。目前我国保护地蔬菜的种植面积不断扩大，由于保护地内温湿条件适宜青枯病菌的生长，再加上青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)寄主十分广泛，能侵染大部分茄科蔬菜，故而在保护地内容易造成连作，使得青枯病逐年加重。同时该病菌在土壤中存活时间长达数年。以上种种原因之下的后果就是迄今为止，青枯病的防治仍然是一个世界难题。

首先，目前对蔬菜青枯病的药剂防治中没有有效的化学农药。即使有，使用化学农药不仅会产生农药残留，而且随着化学农药的逐年使用也会出现青枯菌的抗药性问题。随着经济的发展，人们生活水平的提高，人们越来越注重食品安全问题，绿色蔬菜、有机农产品等也越来越受人青睐。社会对安全、健康食品的需求促进了利用无公害方法来控制有害生物的研究。

无公害蔬菜早已成为世界蔬菜生产的主流。我国无公害蔬菜的研究和生产始于1982年，该年召开全国生物防治会议，江苏省率先提出用生物防治代替化学农药防治。1983年，在全国植保总站的大力支持下，全国23个省、市开展了无公害蔬菜的研究、示范与推广工作。通过几年的研究实践，探索出一套综合防治病虫害、减少农药污染的无公害蔬菜生产术，也开发了一些生物杀菌剂，如农用链霉素、井岗霉素，前者可以配成200mg/L液灌根防治蔬菜软腐病、青枯病，后者配成1000-1500倍液防治蔬菜炭疽病、霜霉病。

迄今为止，无致病力青枯菌、芽孢杆菌、假单胞杆菌、链霉菌、转基因植物等生防因子是防治植物细菌性青枯病中研究应用较多的。但是因为青枯菌株的组成类群十分复杂，而用于青枯生防的其他微生物一般筛自各种土壤，且以典型或单一青枯菌株为指示菌，故而筛选目的性不强，筛出的拮抗微生物也有一定局限性，导致在实际应用中尚未出现对不同青枯病菌均能防治成功的生防制剂。现有技术中按照本实验室的菌体保藏液专利(公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)方法，菌体可室温保存2～3年。

三、发明内容

技术问题针对温室青枯病没有较高防效的生防菌株制剂现状，提供开发一种防治蔬菜青枯病的单一菌株及其菌剂，专用于防治茄科蔬菜青枯病，菌株的防效高，并且有增产功能。

技术方案

防治温室蔬菜青枯病的菌株XY21，为沙雷氏菌属(Serratia sp.)，于2007年05月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNO.2059。XY21在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，湿润，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G^-，可分泌产蛋白酶。

用防治温室蔬菜青枯病的菌株XY21制备生防菌剂的方法为：

将上述温室蔬菜青枯病的菌株XY21在PDA培养液30℃ 180rpm振荡培养20～24h，然后6000rpm离心10min，取XY21湿菌与菌体保藏液(专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838)，按质量体积比为1∶40配成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹²cfu/ml。其应用方法为，XY21菌株制剂在作物移栽前喷雾使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。

有益效果

本发明与现有蔬菜青枯病防治技术相比，其优点和积极效果表现在：本发明是专门针对蔬菜青枯病开发的生防菌株，因而在防治蔬菜青枯病方面与目前其他广谱生物杀菌剂相比防治效果显著提高。由于是生物菌株制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于蔬菜的无公害生产，农民可以不用或减少其他防治青枯病化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于蔬菜的出口。同时，XY21菌株制剂还有增产功能，可为农民增加收入。

XY21菌株用湿菌与本实验室的菌体保藏液(属本实验室已授权专利，专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838，公开日：2002年7月17日)按1∶40(g/ml)配成菌剂，可室温保存2～3年。

XY21菌株制剂可以在温室移栽前，喷在有有机肥的田块，然后随肥料在整地过程中埋到土里，也可以在栽苗时灌根使用。栽苗后，菌株通过多种生防机制起作用，从而达到防治青枯病的效果。

试验表明，在温室中使用XY21菌株制剂对青枯病菌不同菌株均有防治效果，从48～70％不等；田间施用XY21菌株制剂防效分别为64.84％和79.80％，病田各自增产31.8％和45.8％；另外，XY21菌株在番茄根围表现出良好的定殖能力，浸种处理14天后该菌在植株定殖量为10⁷cfu/g根围土样。

四附图说明

图1温室试验中XY21菌剂处理14天后对番茄青枯病的防治效果

图2XY21菌剂处理60天后对田间番茄青枯病的防治效果(福建龙岩，2005)

五具体实施方式

1菌株的鉴定

一种防治温室蔬菜青枯病(Phytophthora capsici)生防菌株XY21，专用于防治辣椒、番茄、茄子等温室蔬菜青枯病。发明人从XY21菌株的平板拮抗活性、产纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶活性和产嗜铁素测定进行了研究，并对其进行了温室和大田防效研究，发现XY21菌株制剂有很好的防病增产效果，有较大的潜力开发成商业化的活菌生防制剂。

XY21菌株为沙雷氏菌属(Serratia sp.)；分离自镇江森林土，XY21在LB培养基上10h产生单菌落，培养24h菌落乳白色，质地均一，圆形，湿润，中间隆起，表面光滑，菌体为短直杆状，G^-，该菌株还可分泌产生蛋白酶。

2温室防效实验

XY21菌悬液制备：平板活化XY21菌株，挑单菌落接种到5ml的LB培养液(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％NaCl，pH7.2)，30℃，180rmp振荡20h，转接到500ml的LB培养液中，30℃，180rmp振荡24h。将摇好的菌体悬浮液6000g离心10min，收集菌体，用无菌水配制10⁹cfu/ml拮抗菌悬浮液。

病原菌制备：病原菌青枯菌株JS1050726、JS1050821、GX13050728、UW356均购自中国农业科学院植保所细菌研究室，取保存于-70℃超低温冰箱中的菌种划线培养于YGPA平板培养基(YGPA：10g glucose，5g Bactopeptone，5g yeast extracts，18g Bacto agar，pH7.2)上，28℃培养48小时。挑取单一菌落于YGP液体培养基中振荡培养20小时(180rpm，28℃)，扩大培养，10000g，4℃离心10min，用灭菌蒸馏水重悬浮至所需浓度，待用。

准备番茄幼苗：种子经催芽48h，基质育苗，25℃16/8h光周期，苗长到3～4片真叶(30d左右)移栽。

将番茄幼苗移栽入装满基质的盆钵(直径70mm，高90mm)中，每钵三株，置于16/8h光周期温室，两天后XY21菌剂灌根，每钵20ml，灌根两天后接病原菌，在幼苗茎基部接种20ml青枯菌悬浮液(10⁸cfu/ml)。对照浇20ml无菌水。接XY21菌剂30d后统计病情，病情分级0-4级：0级无症状；1级1％-25％叶片枯萎；2级整个植株的26-50％的叶片枯萎；3级整个植株的50-75％叶片枯萎；4级整株死亡。每个处理20株苗，4个重复。

苗期盆栽试验结果表明(表1，图1)，只接种青枯菌各对照组的发病率为68.7％-92.0％不等，XY21菌剂处理的发病率为25.8％-38.4％，XY21的防治效果达到48.4％-70.3％。

表1  生防菌XY21制剂施用后14天对番茄青枯病的盆栽防效

JS1050726 JS1050821 GX13050728  UW356XY21发病率(％)对照发病率(％)XY21防效(％)38.474.548.4 27.3 92.0 70.3 30.5 68.7 55.6  30.2  85.9  64.8

注：1.防效(％)＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数*100

3、温室定殖实验

利福平(Rif⁵⁰)突变体的制备(赵健，2004，福建农业大学硕士论文)：活化细菌，挑单菌落于5ml LB培养液中摇菌过夜培养；吸取100μl菌液涂布于含有50μg/ml的Rifampicin(利福平)的LB平板上，30℃培养1-2天；挑取LB平板上的单菌落，纯化，80％的甘油保存；分别做野生型菌株和突变菌株的BOX-PCR(PCR扩增反应采用25μL体系，包括：1×Stoffel Buffer(Applied Biosystems，Foster，USA)；50mmol·L^-1KCl)5μL，3.75mmol·L^-1MgCl₂，0.2mmol·L^-1dNTP，5％[wt/vol]DMSO，0.2μmmol·L^-1引物BOXAlR(5′-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC TGA CG-3′)(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)50 pmol，2.5units(10U/μl)Taq酶(Stoffel fragment，Applied Biosystems)，1μl(约10ng)模板DNA。循环程序为：95℃预变性7.min；94℃1min，53℃1min，65℃8min，共35个循环；最后65℃延伸16min。采用1.2％SEAKEM琼脂糖，取10μl的扩增产物，在100V电压下电泳4h。EB染胶，紫外下检测)，确认菌株。

浸种处理：种子表面消毒(70％乙醇，浸泡1min；5.25％的NaClO，浸泡10-15min)无菌水清洗，自然风干；菌体制备：活化突变菌株，于LB+Rif⁵⁰的培养液中摇菌过夜。8000rpm，10min离心，收集菌体。用无菌水悬浮，使菌量达到10⁹cfu/ml。涂平板确定浓度；种子浸于菌液中20min，对照处理的种子浸于无菌水中20min，自然风干；种子带菌率检测：随机挑选浸种处理和对照处理的种子各3粒，每粒种子置于1ml无菌水中，涂平板确定种子带菌率；播种于装满基质的盆钵(直径70mm，高90mm)中，每钵三株，置于16/8h光周期温室，生长。

采样处理：播种后14天取番茄根围样品，置于0.85％的NaCl中，振荡2h，稀释，涂于含放线菌酮cycloheximide(100μg/ml)、利福平(50μg/ml)、氯霉素chloramphenicol(10μg/ml)的LB平板上，30℃培养1-2天，计数；将回收的菌株、突变菌株做BOX-PCR，检测。

定殖实验结果表明，经XY21菌液浸种处理的种子带菌量为每粒种子1.7×10⁸cfu，播种后14天该菌在番茄根围的定殖量为5.05×10⁷cfu/g土样。

4、田间实际应用实验

XY21菌剂制备：将XY21菌株在PDA培养液30℃ 180rpm振荡培养20～24h，然后6000rpm离心10min，取XY21湿菌与菌体保藏液(专利号ZL02112559.7，公开专利号CN1358838)，按质量体积比为1∶40配成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×10⁹～1×10¹²cfu/ml。所用PDA培养液配制方法为：

用200克土豆削皮后切成小块放到水里煮，沸腾后至少煮20分钟以上，接着用四层医用纱布过滤，滤液加20克普通蔗糖，定容至1000毫升，pH值调至7.2-7.4，然后121℃灭菌20分钟。

用上述方法所得的菌剂在2004、2005年在福建龙岩、江苏淮安进行田间青枯病防效试验示范。在作物移栽前喷雾(菌液浓度1×10¹⁰cfu/ml，3L/亩)使用，也可以做成堆肥使用，或稀释后在移栽时灌根使用。田间实验表明(表2、表3，图2)，作物移栽前喷雾使用，番茄苗移栽后75d，XY21菌剂的平均发病率为6.92％，6.2％，防效为64.84％，79.80％，增产率分别为：31.80％和45.80％。淮安田间实验发现，XY21菌剂的增产率显著高于农用链霉素处理。

表2生防菌XY21菌剂对番茄青枯病的田间生防效果(福建龙岩，2004)

处理施药剂量发病率(％) 防效(％)  平均产量  (Kg/小区)  增产率(％)对照72％农用链霉素XY21---1.2Kg/亩3L/亩27.01a10.08b6.92c  ---  55.97b  64.84ab  98.99b  120.65a  130.48a  ---  22.9  31.8

注：同列数据后标不同小写字母者表示在5％水平上差异显著。

表3生防菌XY21菌剂对田间番茄青枯病的防病及增产效果(江苏淮安，2005)

处理 施药剂量  发病率  (％)   防效(％)  平均产量  (Kg/小区) 增产率(％)对照72％农用链霉素XY21 --- 1.2Kg/亩 3L/亩  30.7a  13.1b  6.2c   ---   57.33b   79.80a   90.88b   106.12a   132.50a  ---  16.77b  45.80a

注：同列数据后标不同小写字母者表示在5％水平上差异显著(P＜0.05)。

病原菌青枯菌株JS1050726、JS1050821、GX13050728、UW356同时侵害茄科辣椒、茄子等形成青枯病，由此可推断，该菌剂同样适用于防治辣椒、茄子青枯病。