从赤霉酸发酵液中提取赤霉酸GA4+7的方法

摘要

本发明涉及一种从赤霉酸发酵液中提取赤霉酸GA4+7的工艺，其特点是：将赤霉酸A4+7发酵滤液调pH值4.5～4.8，利用原有的滤饼层重新过滤，充分去除滤液中的蛋白、重金属、金属离子，回调pH6.5～6.8，浓缩18－20倍，调pH4.2，乙酸乙酯萃取，高速离心机离心，有机溶液经单锅浓缩，加入正丁醇稀释后再加入N.N甲基苄胺沉淀，通过酒精、水相评析，直接分离出纯度90％以上的GA4+7，且比例A4∶A7＝2∶1。本发明通过调节pH值利用发酵液的滤饼层重新过滤，减少有机萃取过程中的软化现象，使有机相和水相充分分离，充分去除杂质，不需脱色，直接生产出纯度较离的白色GA4+7结晶粉，收率比传统工艺提高了10～15％，降低了生产成本。

说明书

技术领域：

本发明涉及一种从微生物发酵液中直接提取GA4+7的工艺。

背景技术：

目前已从自然界中发现82种赤霉酸，按顺序排列为GA1、GA2、GA3、GA4......GA82，这些赤霉酸主要来自于微生物和植物。活性最高的赤霉酸种类，如GA3、GA4、GA7等都可以从微生物发酵中发现。微生物还具有生长迅速、制备容易、产量高等优点，所以目前赤霉酸产品都来自微生物发现。微生物中几乎都以藤包赤霉菌作为生产菌。该菌的多数菌株都产生多种赤霉酸，如GA3、GA4、GA7、GA9等，GA3是最早开发应用的赤霉酸，它对植物的茎、叶、生长促进作用活性最强，GA4、GA7对植物果实细胞的伸长作用比较明显，目前主要在西红柿、葡萄、苹果等植物使用较为普遍，苹果上尤为突出。而且以GA4∶GA7＝2∶1效果最为理想。使用GA4+7时，不能同时使用GA3，否则会引起植物根茎、叶生长过快，引起落花落果，不但不能增产，而且造成减产。另一方面GA4和GA7在促进植物单性结实的效果方面GA4大于GA7，但以以GA4∶GA7＝2∶1效果最佳，此外，GA4+7目前发酵的单位不高，提出取收率偏低(约40％)，使GA4+7的价格偏，推广使用的成本比较昂贵。因此，为了达到经济适用，使用合适的工艺，提高提取收率一步分离出GA4∶GA7＝2∶1的高纯度(90％以上)产品势在必行。

GA3分离提取工艺，据目前所知，有三个专利，一是82年的日本专利59106478，二是64年英国专利1174924，三是中国专利号951022407，前者的工艺要点是先经一般地赤霉酸萃取，蒸出大部分乙酸乙酯，加入正丙酮，再加N-苄基甲胺得GA4+7N-苄基甲胺盐沉淀，分离出GA3、GA4+7胺盐，用甲酸溶解，加酸加水使GA4+7结晶析出，日本工艺是在发酵液滤液调PH4.2-5.5，乙酸乙酯萃取得GA4+7有机相，然后脱色浓缩，再在乙酸乙酯、乙乙酯醚中结晶，萃陛过GA4+7的滤液调PH2，乙酸乙酯萃取、脱色浓缩。中国工艺，发酵液滤液在PH7.0-6.8条件浓缩，调PH6。0使GA4沉淀，分离溶液调PH4。5，使GA7沉淀，分离滤液调PH2。2，用乙酸乙酯萃取GA3。日本工艺一般发酵液萃取，乙酸乙酯用量较大，而且需要脱色工序，分离出的GA4+7比例不一定。英国工艺缺点分离出的纯度不高，需反复萃取，较为繁杂，中国工艺发酵滤液中不调PH值杂质太多，分离出的GA4+7含量不高，需要脱色工序，以上三个专利共同缺点收率偏低，工序复杂。生产成本较高。

发明内容

本发明的目的是提出一种提出供一种从微生物发酵赤霉酸混合物中直接提取高纯度的GA4+GA7，且比例为GA4∶GA7＝2∶1的生产方法。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

(1)先将赤霉酸A4+7发酵液PH值调为4.0-5.0，经板框压滤器过滤；过滤液回调PH值为6.0-7.5条件下浓缩15-20倍，调浓缩液PH值为3.5-4.5，在浓缩液中加入乙酸乙酯进行萃取、搅拌、分离；

(2)将上述分离的有机相轻液经单锅浓缩至深色粘稠状，蒸出乙酸乙酯，加入正丁醇稀释剂，加入N.N二甲基苄胺沉淀、过滤，调PH2.5-3.5相解离，直接析出纯度90％以上，比例GA4∶GA7＝2∶1的GA4+7成品。

所述的方法，其特征在于：先将赤霉酸A4+7发酵液先经板框压滤器压滤，压滤液PH值调为4.0-5.0，充分搅匀后，再重新进板框压滤器，利用原有滤饼层过滤；再用PH值为6.0-7.8的水冲洗原滤饼层，将经清洗收集到的滤液与上述所得到的滤液进行混和；经混和后的滤液回调PH值为6.0-7.5，用薄膜真空浓缩器进行负压浓缩15-20倍；用稀硫酸调浓缩液PH值为4.0-4.2，在浓缩液中1∶1加入乙酸乙酯进行二次萃取，搅拌10-15钟，使赤霉酸A4+7充分溶化在乙酸乙酯溶剂中，通过高速离心机进行分离，由于水与乙酸乙酯的比重不同，水的比重较高较先甩出去，乙酸乙酯的比重较轻次后甩出去；将回收的乙酸乙酯有机相轻液经单锅负压浓缩蒸出乙酸乙酯后，放入稀释剂正丁醇稀释后，加入N.N二甲基苄胺沉淀，经过滤后再加入酒精、水回调PH值为2.5-3.5相解离，直接析出纯度为90％的GA4+7成品，且GA4+7成品比例A4∶A7＝2∶1。

所述方法，其特征在于：将经二次萃取收集的水排放至环保站处理；将后道工序中产生的滤液经收集，回收到前道浓缩液工序。

本发明与现有技术相比，具有下列优点和积极效果：

①发酵滤液经调PH值利用原滤饼层进行重新过滤，可去除95％以上的蛋白及Ca2+、Mg2+离子，滤液澄清度提高有利于浓缩萃取；

②因发酵滤液PH值重新过滤，很大程度降低了浓缩液中的杂质及蛋白含量，萃取液质量提高，不需使用活性炭脱色；

③采用本工艺，收率比传统工艺提高了10～15％。

附图说明：

图1为本发明的工艺流程图。

具体实施方式：

下面结合附图详细描述本发明：

实施例1

(一)：取赤霉素A4+7菌种经发酵培养的赤霉素A4+7发酵液20吨，实测PH值为5.95，发酵单位为872μ/ml；经板框压滤器压出滤液16吨，PH值为5.90，滤液外观呈浅灰色；

(二)：将上述滤液用草酸调PH值为4.0-5.0，然后充分搅拌15分钟，再重新进板框压滤器，利用原有滤饼层过滤，过滤后的滤液呈浅黄色透明体，这次经板框压滤器压出滤液16.5吨；

(三)：用10吨PH值为6.5-7.5的水冲洗原滤饼层，将经清洗收集到的滤液与上述第二步所取得的滤液进行混和；

(四)将第三步的混和液用纯碱调节PH值至6.5-7.0，用薄膜真空浓缩器进行负压浓缩，得到1.45吨浓缩液；

(五)：用稀硫酸调浓缩液PH值为4.0-4.2，在浓缩液中1∶1加入乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-15钟，使赤霉酸A4+7充分溶化在乙酸乙酯溶剂中，通过高速离心机进行分离，由于水与乙酸乙酯的比重不同，水的比重较高较先甩出去，乙酸乙酯的比重较轻次后甩出去，因此，将其分别进行回收。再将回收的水再1∶1加入乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-15钟，再通过高速离心机进行分离，将分离所得的乙酸乙酯轻液回收，将分离收集的水排放至环保处理站；

(六)：将经萃取分离所得的乙酸乙酯轻液，输送给单锅蒸馏，采用0.5-1kg负压，乙酸乙酯轻液中的乙酸乙酯在高温下呈汽体蒸发，并将所蒸发的乙酸乙酯回收用于下个批次生产，单锅蒸馏使乙酸乙酯轻液中的GA4+7料液浓缩至深色粘稠状；

(七)：在深色粘稠状料液里加入3-5倍的稀释剂正丁醇，再加入沉淀剂N.N二甲基苄胺调PH值为6.5-7.5，充分搅拌15-20分钟，静置3小时以上进行抽滤，将抽滤得到的GA4+7N.N二甲基苄胺盐，通过烘箱在70℃下经10-12小时烘干；

(八)：在烘干的GA4+7N.N二甲基苄胺盐中加入乙醇、水，其GA4+7N.N二甲基苄胺盐与乙醇、水配比为：1∶10∶3，然后用盐酸调PH值为2.5-3.5，经充分搅拌，此时，其液体变清，继续加水让GA4+7完全析出，抽滤得GA4+7晶体，滤液回第四步。GA4+7晶体在60℃的烘房中烘干10小时左右，得到91.2％的GA4+7成品15.7kg，且GA4+7成品比例A4∶A7＝2∶1。

实施例2

(一)：取赤霉素A4+7菌种经发酵培养的赤霉素A4+7发酵液18.5吨，实测PH值为6.12，发酵单位为860μ/ml；经板框压滤器压出滤液14.8吨，PH值为6.11，滤液外观呈浅灰色；

(二)：将上述滤液用草酸调PH值为4.0-5.0，然后充分搅拌15分钟，再重新进板框压滤器，利用原有滤饼层过滤，过滤后的滤液呈浅黄色透明体，这次经板框压滤器压出滤液15吨；

(三)：用9吨PH值为6.5-7.5的水冲洗原滤饼层，将经清洗收集到的滤液与上述第二步所取得的滤液进行混和；

(四)：将第三步的混和液用纯碱调节PH值至6.5-7.0，用薄膜真空浓缩器进行负压浓缩，得到1.15吨浓缩液；

(五)：用稀硫酸调浓缩液PH值为4.0-4.2，在浓缩液中1∶1加入乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-15钟，使赤霉酸A4+7充分溶化在乙酸乙酯溶剂中，通过高速离心机进行分离，由于水与乙酸乙酯的比重不同，水的比重较高较先甩出去，乙酸乙酯的比重较轻次后甩出去，因此，将其分别进行回收。再将回收的水再1∶1加入乙酸乙酯进行萃取，搅拌10-15钟，再通过高速离心机进行分离，将分离所得的乙酸乙酯轻液回收，将分离收集的水排放至环保处理站；

(六)：将经萃取分离所得的乙酸乙酯轻液，输送给单锅蒸馏，采用0.5-1kg负压，乙酸乙酯轻液中的乙酸乙酯在高温下呈汽体蒸发，并将所蒸发的乙酸乙酯回收用于下个批次生产，单锅蒸馏使乙酸乙酯轻液中的GA4+7料液浓缩至深色粘稠状；

(七)：在深色粘稠状料液里加入3-5倍的稀释剂正丁醇，再加入沉淀剂N.N二甲基苄胺调PH值为6.5-7.5，充分搅拌15-20分钟，静置3小时以上进行抽滤，将抽滤得到的GA4+7N.N二甲基苄胺盐，通过烘箱在70℃下经10-12小时烘干；

(八)：在烘干的GA4+7N.N二甲基苄胺盐中加入乙醇、水，其GA4+7N.N二甲基苄胺盐与乙醇、水配比为：1∶10∶3，然后用盐酸调PH值为2.5-3.5，经充分搅拌，此时，其液体变清，继续加水让GA4+7完全析出，抽滤得GA4+7晶体，滤液回第四步。GA4+7晶体在60℃的烘房中烘干10小时左右，得到91.2％的GA4+7成品14.35kg，且GA4+7成品比例A4∶A7＝2∶1。