初生仔猪腹泻病的大肠杆菌基因工程疫苗K88－K99－LT及其构建方法

摘要

初生仔猪腹泻病的大肠杆菌基因工程疫苗K88－K99－LT及其构建方法，属于畜牧兽医技术领域。将扩增出的K88的主要亚单位基因faeG片段、K99的主要亚单位基因fanC片段、LT的主要亚单位基因ltb片段，按faeG－fanC－ltb方式定向串联于原核表达载体pGEX－6P－1，经转化宿主菌BL21后，进行IPTG诱导表达，并经SDS－PAGE和Western－blot证明目的基因确已表达，该疫苗可有效预防初生仔猪腹泻，安全性和免疫原性可靠。

说明书

技术领域

本发明涉及初生仔猪腹泻病大肠杆菌疫苗的研制，属于畜牧兽医技术领域。

背景技术

由特定血清型产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)引起的初生仔猪腹泻(Neonatal diarrhea)是导致初生仔猪死亡的一种重要传染病。初生仔猪腹泻多表现为突然发病，拉黄色水样粪便，迅速脱水和电解质失衡。发病猪可在几小时内死亡，有的仔猪没有出现腹泻就已经死亡。特定血清型的大肠杆菌是引起初生仔猪腹泻的主要病原，其主要产生F4(K88)、F5(K99)、F6(987P)和F41四类黏附素，同时可产生耐热肠毒素(heat-stable enterotoxin，ST)或/和不耐热肠毒素(heat-labile enterotoxin，LT)。鉴于K88、K99、987P、F41四类粘附素在致初生仔猪腹泻大肠杆菌的高出现率及ST、LT间较高的相关性，可以认定上述六种抗原是致初生仔猪腹泻ETEC的主要致病因子。

在初生仔猪腹泻防治方面，目前，国内常用的预防初生仔猪腹泻的大肠杆菌基因工程疫苗是K88-K99二价苗，而流行病学调查的结果显示K88、K99、987P、F41、ST、LT是目前引起我国初生仔猪腹泻ETEC的主要毒力因子或保护性抗原，因此，要有效控制我国由ETEC引起的初生仔猪腹泻，应注重对上述全部6种毒力因子的基因工程疫苗的研制。临床上，可供选择的另外一种预防初生仔猪腹泻的大肠杆菌疫苗是菌体灭活苗，菌体灭活苗需加多个菌株，即便达到有限效果，每个菌株均需达一定浓度，几个菌株加在一起势必造成疫苗中细菌总浓度较高，不可避免地产生副作用，免疫效果有限。因此研制免疫保护效果好、副作用低的基因工程疫苗为大势所趋。国内外尚无将上述六种保护性抗原基因中的三种串联表达的基因工程疫苗产品。

发明内容

本发明的目的是提供一种可预防初生仔猪腹泻的基因工程疫苗K88-K99-LT。

本发明由K88的主要亚单位基因faeG片段、K99的主要亚单位基因fanC片段、LT的主要亚单位基因ltb片段和原核表达载体pGEX-6P-1串联组成。

经过一系列免疫保护试验，证明本发明对于预防初生仔猪腹泻，是一种高效的初生仔猪腹泻大肠杆菌基因工程疫苗，其安全性和免疫原性可靠。

本发明的第二个目的还在于发明一种上述基因工程疫苗K88-K99-LT的构建方法：

将扩增出的K88的主要亚单位基因faeG片段、K99的主要亚单位基因fanC片段、LT的主要亚单位基因ltb片段，按K88-K99-LT方式定向串联于原核表达载体pGEX-6P-1。

另，用于扩增K88的主要亚单位基因faeG片段的引物是：

P1：GTGGATCCTGGATGACTGGT

BamH I

P2：GTAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACG

HindIII

用于扩增K99的主要亚单位基因fanC片段的引物是：

P3：AAGCTTAATACAGGTACTATTAACTTCAATG

HindIII

P4：GTCGACCATATAAGTGACTAAGAAGGAT

Sal I

用于扩增LT的主要亚单位基因ltb片段的引物是：

P5：GTCGACGCTCCCCAGACTATTACAGAAC

Sal I

P6：CTCGAGCTACCGTTAGTCATACTTTTTGCT

Xho I

本发明依据已公开的faeG(K88)、fanC(K99)、ltb(LT)亚单位的基因序列，设计含特异酶切位点的引物；以致初生仔猪腹泻大肠杆菌的质粒或基因组DNA为模板，采用PCR法扩增出上述保护性抗原基因；将上述基因定向串联于表达性质粒pGEX-6P-1，经转化宿主菌BL21后，进行IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE和Western-blot证明目的基因确已表达；再将表达上述3种保护性抗原基因的重组菌BL21(pFFLTB)免疫小鼠，评价其免疫原性及安全性。

本发明通过构建表达大肠杆菌免疫保护性抗原K88、K99、LT基因的重组菌，并对小鼠进行腹腔免疫，结果显示经重组菌免疫后的小鼠血清中，产生了分别针对K88、K99抗原特异性的IgG，相应的抗体水平从免疫后7天开始逐步升高，在第二次免疫后21天左右达到了较高的水平，并且在攻毒后对小鼠提供了较好的保护，针对K88、K99的标准菌株C83907、C83709的免疫保护率分别达83.3％、66.6％。

附图说明

图1为本发明的构建模式图。

图2为GST-FaeG-FanC-LTB联合表达产物的SDS-PAGE分析结果图。

图3为GST-FaeG-FanC-LTB的Western-blot分析结果图。

图4为小鼠免疫后血清中针对K88抗原特异性IgG检测结果线图。

图5为小鼠免疫后血清中针对K99抗原特异性IgG检测结果线图。

具体实施方式

一、生物材料：

1、保护性抗原序列

上述3种保护性抗原的主要亚单位的基因序列来自于国际互联网的GenBank中，其中：

①faeG(K88)在GenBank中的登录号为M29375，登录时间为1993-4-26。

②fanC(K99)在GenBank中的登录号为M35282，登录时间为1993-4-26。

③ltb(LT)在GenBank中的登录号为M17873，登录时间为1996-4-16。

2、表达质粒

表达质粒为pGEX-6P-1，购自Amersham Pharmacia公司。

3、菌种的来源

含保护性抗原基因的重组质粒，是在BL21宿主细菌中表达的。BL21宿主菌也是商品化宿主菌，也购自Amersham Pharmacia公司。

二、构建过程：

1、保护性目的片段的获得

依据国际互联网的GenBank中这些亚单位的基因序列设计出含特异性酶切位点3对引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，如表1。

表1重组菌K88-K99-LTB的引物

  基因引物    引物序列(5′端-3′端)  长度  (bp)  faeG  (K88)    fanC   (K99)     ltb   (LT)      P1   P2   P3    P4    P5    P6   GTGGATCCTGGATGACTGGTBamH IGTAAGCTTGTAATAAGTTATTGCTACGHind IIIAAGCTTAATACAGGTACTATTAACTTCAATG Hind IIIGTCGACCATATAAGTGACTAAGAAGGAT Sal IGTCGACGCTCCCCAGACTATTACAGAAC Sal ICTCGAGCTACCGTTAGTCATACTTTTTGCT Xho I     20     27     31      28      28      30   

模板DNA的制备按全菌裂解法进行。以上述细菌为模板，通过PCR反应获得需要的3个目的基因片段，faeG、fanC、ltb大小分别为780bp、500bp、320bp，随后将之连接到pGEM-T easy载体，分别命名为pfaeG、pfanC、pltb，通过酶切鉴定及序列测定，测序工作由上海联合基因公司完成，证明获得的是正确的片段。

2、重组表达载体pFFLTB(pGEX-6P-1-faeG-fanC-ltb)的构建

用限制性内切酶BamH I、HindIII将faeG从载体pfaeG切下，因载体pGEX-6P-1的酶切位点冲突，故中间引入克隆载体pBlueScript-SK，将载体pBlueScript-SK以相同的酶切体系进行酶切纯化回收，将两种酶切回收片段以适当的摩尔比进行连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，经酶切分析和鉴定，筛选出pBlueScript-SK-faeG阳性重组质粒。

按照上述方法，用限制性内切酶HindIII、SalI对质粒pfanC和pBlueScript-SK-faeG酶切，分别回收酶切片段，进行连接转化，筛选出pBlueScript-SK-faeG-fanC的阳性重组质粒。

按照上述方法，用限制性内切酶Sal I、Xho I对质粒pltb和pBlueScript-SK-faeG-fanC酶切，分别回收酶切片段，进行连接转化，筛选pBlueScript-SK-faeG-fanC-ltb(pFFLTB)的阳性重组质粒。

用限制性内切酶BamH I、Xho I将faeG-fanC-ltb串联片段从阳性重组质粒pFFLTB切下，将质粒载体pGEX-6P-1以相同的酶切体系进行酶切纯化回收，将两种酶切回收片段以适当的摩尔比进行连接，转化感受态大肠杆菌BL21，经酶切分析和鉴定，筛选出pGEX-6P-1-faeG-fanC-ltb的阳性重组质粒，含该质粒的重组菌命名BL21(pFFLTB)，即基因工程苗K88-K99-LT。

重组表达质粒构建模式见图1。

三、基因工程菌K88-K99-LT表达产物的SDS-PAGE、Western-blot鉴定

酶切鉴定正确的重组质粒pFFLTB转化宿主菌BL21后，进行IPTG诱导表达，并经SDS-PAGE(详见图2)和Western-blot(详见图3)证明目的基因确已表达。重组质粒pFFLTB转化菌经IPTG诱导后，在约80kD处出现一特异性蛋白条带，与预期的融合蛋白大小一致。

图2中：

1、未经诱导的pFFLTB重组质粒转化菌

2、pFFLTB重组质粒转化菌经0.6mmol/L IPTG诱导后的融合蛋白表达产物

3、pFFLTB重组质粒转化菌经1.0mmol/L IPTG诱导后的融合蛋白表达产物

4、蛋白质分子量标准

5、pGEX-6P-1质粒转化菌经IPTG诱导后GST的表达产物

图3中：

1、蛋白质分子量标准

2、样品为重组菌K88-K99-LT经IPTG诱导后的裂解产物，一抗为K88菌毛的抗血清

3、样品为重组菌K88-K99-LT经IPTG诱导后的裂解产物，一抗为K99菌毛的多抗血清。

四、基因工程菌K88-K99-LT的免疫效果

本发明通过构建表达大肠杆菌免疫保护性抗原K88、K99、LT基因的重组菌BL21(pFFLTB)，分别制备成油乳剂疫苗对小鼠进行腹腔免疫，结果显示经重组菌免疫后的小鼠血清中，产生了分别针对K88、K99抗原特异性的IgG，相应的抗体水平从免疫后7天开始逐步升高，在第二次免疫后21天左右达到了较高的水平，说明重组菌能够同时诱导产生高水平的针对2种菌毛保护性抗原的抗体，并且在攻毒后对小鼠提供了较好的保护，针对K88、K99的标准菌株C83907、C83709的免疫保护率分别达83.3％、66.6％。其对小鼠免疫保护试验的分组情况及免疫效果详见表2，针对K88抗体变化情况见表3和图4，针对K99抗体变化情况见表4和图5。

表2基因工程苗K88-K99-LT免疫试验分组情况及免疫保护结果

  组  别  免疫  途径  免疫剂量  (CFU/只)  免疫  日龄  攻毒材料  攻毒剂量  (CFU/只)  攻毒  日龄  保护率  1  2  3  4  5  6  7  K88-K99-LT  灭活苗免疫组  K88-K99-LT  灭活苗免疫组  6P-1灭活苗组  6P-1灭活苗组  C83907灭活苗  免疫组  C83709灭活苗  免疫组  空白对照组  1×10⁹  1×10⁹  1×10⁹  1×10⁹  4×10⁸  4×10⁸  /  /  35，49  35，49  35，49  35，49  35，49  35，49  /  /  C83907细菌  C83709细菌  C83907细菌  C83709细菌  C83907细菌  C83709细菌  C83907细菌  C83709细菌  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  4×10⁸  63  63  63  63  63  63  63  63  83.3％  (5/6)  66.6％  (4/6)  16.7％  (1/6)  16.7％  (1/6)  100％  (6/6)  100％  (6/6)  0  0

免疫保护率＝(攻毒对照组死亡率－疫苗免疫组死亡率)/攻毒对照组死亡率×100％

表3小鼠免疫基因工程苗K88-K99-LT后血清中针对K88抗原特异性IgG检测结果

  试验组  小鼠  只数  小鼠免疫后血清中针对K88抗原特异性IgG检测值  免疫前  一免后7天  一免后14天  二免后7天  二免后14天  K88-K99-LT  灭活苗  免疫组  C83907菌灭  活苗免疫组  非免疫对照  组  6   6  6  0.037±  0.019^a   0.063±  0.107^b  0.048±  0.021^a  0.186±0.093^a   0.851±0.424^b  0.048±0.021^a  0.398±0.223^a   1.201±0.556^b  0.067±0.018^c  1.129±0.227^a   1.446±0.028^b  0.185±0.072^c  1.268±0.155^a   1.420±0.043^a  0.173±0.082^b

抗体IgG检测值＝平均抗体检测值±标准差，a、b、c有显著性差异(P＜0.05)；显著性检验是不同疫苗免疫组以及健康对照组小鼠在免疫后相同时刻血清中抗体水平之间的比较。

表4小鼠免疫基因工程苗K88-K99-LT后血清中针对K99抗原特异性IgG检测结果

  试验组  小鼠  只数  小鼠免疫后血清中针对K99抗原特异性IgG检测值  免疫前  一免后7天  一免后14天  二免后7天  二免后14天  K88-K99-LT  灭活苗  免疫组  C83709菌灭  活苗免疫组  非免疫对照  组  6   6  6  0.037±  0.19^a   0.063±  0.011^b  0.039±  0.006^a  0.397±0.150^a   0.896±0.532^b  0.148±0.134^c  0.497±0.225^a   1.076±0.463^b  0.137±0.146^a  1.083±0.306^a   1.206±0.051^a  0.555±0.281^b  1.272±0.068^a   1.382±0.011^a  0.439±0.406^b

上述数据直观地说明了本发明涉及的重组菌能够同时诱导产生高水平的针对两种保护性抗原的抗体，在攻毒后对小鼠提供了较好的保护。

本发明克隆并表达致初生仔猪腹泻大肠杆菌免疫保护性抗原K88、K99、LT基因，从而研制出相应的基因工程疫苗重组菌K88-K99-LT。经过一系列免疫保护试验，证明研制的预防初生仔猪腹泻的大肠杆菌基因工程疫苗的高效性。

<110>扬州大学

<120>初生仔猪腹泻病的大肠杆菌基因工程疫苗K88-K99-LT及其构建方法

<160>6

<210>1

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据K88的主要亚单位基因faeG片段设计

<400>1

gtggatcctg gatgactggt

<210>2

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据K88的主要亚单位基因faeG片段设计

<400>2

gtaagcttgt aataagttat tgctacg

<210>3

<211>31

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据K99的主要亚单位基因fanC片段设计

<400>3

aagcttaata caggtactat taacttcaat g

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据K99的主要亚单位基因fanC片段设计

<400>4

gtcgaccata taagtgacta agaaggat

<210>5

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据LT的主要亚单位基因ltb片段设计

<400>5

gtcgacgctc cccagactat tacagaac

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据LT的主要亚单位基因1tb片段设计

<400>6

ctcgagctac cgttagtcat actttttgct