化合物1－(4－氯苯胺基)－4－(4－甲基吡啶基)－2,3－二氮杂萘的应用

摘要

本发明涉及下式的化合物1－(4－氯苯胺基)－4－(4－甲基吡啶基)－2，3－二氮杂萘在制备预防肿瘤疾病发生的药物的用途：所说的药物是含有1－(4－氯苯胺基)－4－(4－甲基吡啶基)－2，3－二氮杂萘、用于经肠胃道或肠胃道之外给药方式施用的药物制剂。该化合物对肿瘤的出现和形成具有至少被延迟或者避免的作用，采用含该化合物药物进行预防的肿瘤患者与未进行预防的患者相比具有更高的存活率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘的应用。

技术背景

血管发生涉及由内皮细胞前体或成血管细胞重新形成血管。胚胎中的第一个血管结构是通过血管发生形成的。血管生成涉及从现存的血管发展毛细血管，并且是器官例如脑和肾形成血管的主要机制。虽然血管发生局限于胚胎发育，但是血管生成可在成人中发生，例如在妊娠、女性周期或伤口愈合期间发生。

在胚胎发育和某些血管生成依赖性疾病中，血管生成和血管发生的主要调质是血管内皮生长因子(VEGF)。VEGF代表一族由可变RNA剪接产生、并以同源二聚体形式存在的促细胞分裂原同种型。VEGF可以高亲和力地结合酪氨酸激酶受体。VEGF与酪氨酸激酶结合形成配体-受体后，其在血管内皮细胞的增殖，以及血管的形成和生长(分别称作血管发生和血管生成)中起重要作用。

在体内，VEGF在血管发生中起着关键作用，并诱导血管生成和血管渗透。失控的VEGF表达导致特征是异常血管生成和/或高渗透构成的多种疾病。因此，控制VEGF介导的信号传导级联将提供有用的控制异常血管和/或高渗透过程的方法。

血管生成被认为是超过1～2mm的肿瘤生长的绝对必备条件，每个肿瘤的继续生长都要依赖血管提供氧和营养物质。血管生成的特征是血管内皮生长因子(VEGF)的活性过强。VRGF结合高亲和性跨膜酪氨酸激酶受体启动信号传导，从而启动新生血管生成的调控环节。已显示肿瘤生长对VEGF受体拮抗剂的抗血管生成作用敏感。所以，新血管生成是肿瘤生长的基础，抑制新血管生成的能力具有预防肿瘤发生的作用。

因此，实体瘤可以通过酪氨酸激酶抑制剂进行有效预防，因为这些肿瘤的发生都依赖于血管生成，以形成支持其生长所必需的血管。这些实体瘤包括组织性淋巴瘤、脑、生殖泌尿道、淋巴系统、胃、喉和肺部的癌症，包括肺腺癌和小细胞肺癌。其他的例子包括科观察到Raf-激活的致癌基因(如K-ras、erb-B)的过度表达或激活的癌症。这样的癌症包括胰腺癌和乳腺癌。

然而，遗憾的是，事实上一旦肿瘤已经出现，血管抑制剂能够抑制新的血管形成，但是却不能将已经形成的肿瘤血管和已经长大的肿瘤组织杀死，因此采取提前应用血管生成抑制剂，预防肿瘤疾病发生更具有现实意义。

发明内容

本发明的技术任务是提供化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘的新的医药用途。

发明概述

本发明是基于令人惊奇地发现1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘具有显著抑制VEGF的作用，该发现意味着该化合物可有价值的用于预防与血管生成/或血管渗透性增加有关的病症，特别在防止肿瘤的发生方面。所以，本发明涉及的化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘的真正价值在于预防肿瘤的发生方面，因为在目前临床尚无真正能够有效阻断肿瘤细胞增殖的前提下，利用有效的机制从源头防止肿瘤的发生和形成是唯一能够改善患者的生存质量和降低高昂医疗费用的途径。

发明详述

本发明的技术方案如下：

下式的化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘在制备预防肿瘤疾病发生的药物的用途。

本发明中术语“预防”意指肿瘤的出现和形成至少被延迟或者避免，采用含有上述化合物药物进行预防的肿瘤患者与未进行预防的患者相比具有更高的存活率。

本发明中术语“肿瘤疾病”意指瘤性增殖性病症，例如实体瘤疾病。此处所用术语“实体瘤疾病”尤其指乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、结肠癌和通常的胃肠道癌、肺癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、头颈癌或脑瘤。

本发明中，术语“药物”指含有质量百分比10％-100％、优选20％-60％(wt)的1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘，用于经肠胃道或肠胃道之外给药方式施用的药物制剂，该药物制剂是单位形式的药物制剂，除含有该化合物外可以包括药学中常用的载体，稀释剂和/或其它助剂。应当理解：每个剂量形式的各个剂量中包含的组分的单位含量本身并不构成有效量，因为必需的有效量可以通过施用多个剂量单位来达到。

1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘作为制备药用物质的用途，应为药物剂型的需求而与有机酸结合成盐从而达到人体生理更易接受的形式，是应该包含在本专利保护范围中的。

有关1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘的制备属于现有技术，具体可参见CN1876649。

所有实体瘤的发病都经过新生血管生成的阶段，故本发明化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘在小鼠S180肉瘤模型上表现出的活性，对其他类型的肿瘤具有代表性。

具体的，当预先给小鼠口服给予1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘，使得体内血药浓度维持在一定水平，然后为小鼠接种肿瘤细胞S180，由于本发明化合物的良好的抑制血管生成作用，从而使得接种的肿瘤细胞不能在小鼠体内增殖形成病灶或者使肿瘤的发生率明显降低，统计学显示具有显著性差异(P＜0.05)。

具体的，在斑马鱼抑制血管生成模型的实验中，我们也观察到了由于给予本发明药物而导致斑马鱼胚胎不能形成节间血管，这也证明了在抑制肿瘤发生过程中的新生血管的生成方面，本发明化合物是一个可靠的有效药物。

同时，幸运的是本发明化合物1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘在动物实验中表现出了低毒安全的效果。因为这是目前现有的化疗药所不能避免的一个缺陷，对于化疗过程中出现的恶心呕吐、消瘦、神经抑制作用等早已为人所知。这对于具有肿瘤家族遗传史、或需要进行特别防护进行肿瘤疾病的预防，需要长期或者周期性服药的患者来说，是一个可喜的益处。

附图说明

图1是1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘(BSSD-1)对人类脐静脉内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用关系图，其中，纵坐标是吸光度，表示各孔活细胞的数量。横纵坐标是药物浓度，表示BSSD-1的剂量。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进一步说明，但是实施例将不以任何形式限制本发明。

实施例1：1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘对人类血管内皮细胞增殖的抑制作用

将人类脐静脉内皮细胞(HUVEC，购自Cascade Biologics公司，Cot：C-003-5C)置于含10％胎牛血清(FBS)的Medium 200(购自Cascade Biologics公司)中培养(37℃、5％CO₂、95％湿度)，取第四代细胞按密度4000/250μL接种与96孔培养板中，设定对照组、各个浓度梯度的用药组及空白组，每组均做3个复孔。待细胞生长密度达80％，分别加入5μl的1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘(DMSO溶解)，使得终浓度分别为1000μM、100μM、10μM、5μM、1μM，对照组加入5μL的DMSO，继续培养48小时，加入5mg/ml的四唑溴盐(MTT)20μl，37℃继续孵育4小时，中止培养，弃上清，每孔加入150μl的DMSO，轻轻震荡，1小时后在490nm处用微板读数仪测定各孔吸光度值，以吸光度表示各孔活细胞的数量。结果如图1显示。结果显示，1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘对人类脐静脉内皮细胞的增殖呈剂量依赖性抑制作用，其半数抑制量为50μM。

实施例2：1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘(BSSD-1)具有抑制或延缓肿瘤发生的作用

通过设计预先给药方案，使得药物在小鼠体内达到一定的血药浓度，从而抑制了肿瘤细胞在小鼠体内的着床、增殖，从而反映药物的预防作用。具体方案如下：

昆明种小鼠，预先给药3d，腹腔注射给药，然后皮下接种S₁₈₀肉瘤细胞株，同时继续给药，持续10d，观察肿瘤形成小鼠快慢及大小。同时设置未进行预先给药的组别进行对照比较。结果表明BSSD-1显著延缓了肿瘤的发生的时间，并且显著减慢了肿瘤生长速度，部分动物则并未发生肿瘤；而未进行预先给药的组中的所有小鼠均发生了肿瘤。见表1。

表1 BSSD-1对小鼠S₁₈₀肉瘤生成的预防作用

 剂量mg/kg形成肿瘤只数肿瘤发生率％  瘤重g空白对照12/12100  2.30±0.83BSSD-1 3010/1283  1.75±0.63 505/12*42  0.45±0.44* 1003/12*25  0.03±0.21*未进行预先给药组 3012/12100  2.01±0.39 5012/12100  1.62±0.75 10012/12100  0.33±0.35*

*p＜0.05，与对照相比

提前预防给药的小鼠在实验过程中体重与正常小鼠比较无显著性差异，饮食，引水正常，皮毛光泽无异常，说明该化合物毒性低，安全性好。

实施例3：斑马鱼试验

实验采用血管荧光转基因斑马鱼TG(VEGFR2：GFP)，试验前1日，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，次日6～8时获得受精卵。对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28℃下控光培养。将1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2，3-二氮杂萘(BSSD-1)分别配成100μg/ml、10μg/ml、1μg/ml、0.1μg/ml浓度的样品，分别加到96孔培养板中，每个浓度8孔，然后取胚胎32枚，分别加入到已经加入药物的孔中，另取胚胎8枚，作为空白对照，然后，放入28℃光照培养箱中，将胚胎与药物共同孵育，72h后观察仔鱼的节间血管数目，计算抑制率，见表2。从结果可以看出，该化合物在0.1μg/ml时已经能够显著抑制斑马鱼节间新生血管的生成，当浓度达到1~100μg/ml时能够全部抑制斑马鱼节间血管的生成，显示了极好的预防效果，与对照相比均有极其显著性差异。

表2 BSSD-1对斑马鱼胚胎血管生成的预防作用

剂量μg/ml抑制率％血管数(条)空白对照-027.38±1.13BSSD-10.133.5618.19±4.86*11000*101000*1001000*

*p＜0.01，与对照相比