一种基于天然植物活性成分生物转化的饲料添加剂的制备方法

摘要

本发明涉及一种基于天然植物活性成分生物转化的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，用天然植物发酵技术制备饲料添加剂，其方法为：将黑曲霉和枯草芽孢杆菌接分别培养，将黑曲霉对蒲公英的液体或固体发酵后制得到粉末状成品，将枯草芽孢杆菌对蒲公英的液体或固体发酵后制得到粉末状成品，将枯草芽孢杆菌对黄芪的液体或固体发酵后制得到粉末状成品，将三种干粉加甘草粉混合，目筛，得混合干粉成品，即为天然植物药物饲料添加剂。本发明的优点是能对天然植物药物进行转化后提高总黄酮、总绿原酸的含量，降低天然植物药物的毒副作用，在配合饲料中不添加抗生素、镇静剂和激素等有害添加剂前提下，加入本发明产品，猪、鸡增重提高5－10％左右，饲料转化率提高5－8％。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于天然植物活性成分生物转化的饲料添加剂的制备方法，属于饲料添加剂技术领域。

背景技术

天然植物饲料添加剂产品的研究开发虽已取得了一定的进展，且在一定范围内对畜禽疾病的控制取得了较好的效果，但还存在许多亟待解决的问题，如产品添加量大，有效成分不明，作用机理不清，作用效果不稳定，剂型单一缺乏毒理安全方面的研究，原料和产品的质量控制标准不完备等，导致新的天然植物添加剂研究与开发力度不大，上市新产品较少。这些问题的存在使目前市场上的天然植物饲料添加剂不符合“微量、高效”这一饲料添加剂的基本功能原则，难以实现产业化。

天然植物提取技术的现代化至关重要，如不能有效地提取中药中的药效成分，则无论如何好的配方也不能发挥治疗作用。目前国内某些企业已经遗弃了传统中药生产中落后的方法，把先进的化工单元操作和现代分析手段应用于中药提取，并把天然植物制成先进的剂型，合理有效地添加到饲料中，使之易于吸收，见效快。这些先进的提取工艺技术主要有吸附色谱技术、连续逆流萃取技术、超临界萃取技术、冷冻干燥技术、微囊化包合技术等，目前发酵技术用于天然植物药物生产仅局限于简单的炮制加工和一些菌类药物的发酵，但如何发挥天然植物生物转化技术尚在研究初期阶段。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于天然植物活性成分生物转化的饲料添加剂的制备方法。

为实现以上目的，本发明的技术方案是提供一种基于天然植物活性成分生物转化的饲料添加剂的制备方法，其特征在于，用天然植物发酵技术制备饲料添加剂，其方法为：

第一步.菌种的保藏和生产

(1)取黑曲霉和枯草芽孢杆菌分别在4℃下保藏；

(2)将黑曲霉接种于种子扩大培养基中，放入35℃-40℃的恒温培养箱中培养2-3天，再接入种子优化发酵培养基后置于35℃-40℃的恒温摇床培养箱中培养2-3天，每300ml三角瓶装量50ml液体培养基，得到培养好的枯草芽孢杆菌；

(3)将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基中，放入35℃-40℃的恒温培养箱中培养2-3天，再接入种子优化发酵培养基后置于35℃-40℃的恒温摇床培养箱中培养2-3天，每300ml三角瓶装量50ml液体培养基，，得到培养好的枯草芽孢杆菌种；

第二步.黑曲霉对蒲公英的液体或固体发酵

蒲公英液体发酵：

A.蒲公英水提液的制备：使用一吨提取罐，以1∶2-4的比例加入蒲公英和水煮沸50分钟-70分钟，将蒲公英残渣过滤掉，使用中药专用减压浓缩罐减压浓缩，则获得蒲公英的粗提液；

B.黑曲霉对蒲公英粗提液的发酵：将黑曲霉菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及蒲公英水提液55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵2-4天，经过醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

或对蒲公英固体发酵：

A.蒲公英的制备：用超微粉碎机将蒲公英粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用；

B.黑曲霉对蒲公英固体的发酵：将黑曲霉菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及蒲公英55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵4天-6天，水提、醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

第三步.枯草芽孢杆菌对蒲公英的液体或固体发酵

蒲公英的液体发酵：

A.蒲公英水提液的制备：使用一吨提取罐，以1∶2-4的比例加入蒲公英和水煮沸50分钟-70分钟，将蒲公英残渣过滤掉，减压浓缩，则获得蒲公英的粗提液；

B.枯草芽孢杆菌对蒲公英粗提液的发酵：将枯草芽孢杆菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及蒲公英水提液55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35℃-40℃下发酵2-4天，经醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

或对蒲公英固体发酵：

A.蒲公英的制备：用超微粉碎机将蒲公英粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用；

B.枯草芽孢杆菌对蒲公英固体的发酵：将枯草芽孢杆菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及蒲公英55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35℃-40℃下发酵4-6天，经水提、醇沉、减压、干燥、粉碎得到粉末状的成品；

第四步.枯草芽孢杆菌对黄芪的液体或固体发酵

黄芪的液体发酵：

A.黄芪水提液的制备：使用一吨提取罐，以1∶2-4的比例加入黄芪和水煮沸50分钟-70分钟，将黄芪残渣过滤掉，减压浓缩，则获得黄芪的粗提液；

B.枯草芽孢杆菌对黄芪粗提液的发酵

将枯草芽孢杆菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及黄芪水提液55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35℃-40℃下发酵2-4天，经醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

或对黄芪固体发酵：

A.黄芪的制备

用超微粉碎机将黄芪粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用；

B.枯草芽孢杆菌对黄芪固体发酵

将枯草芽孢杆菌剂15％-25％加以2∶0.5-1.5∶0.5-1.5比例的碳源、氮源、无机盐15％-25％及黄芪55％-65％均匀混合后置入通风罐内，35℃-40℃下发酵4天-6天，经水提、醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

第五步.制备天然植物药物饲料添加剂

将步骤二的干粉25％-35％、步骤三的干粉25％-35％、步骤四的干粉25％-35％、甘草粉5％-15％混合，过80目筛，得混合干粉成品，即本饲料添加剂成品。

所述的枯草芽孢杆菌种子优化发酵培养基为蔗糖2％-4％，蛋白胨0.5％-1.5％，酵母膏0.3％-0.6％，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.3％-0.6％，硫酸铵((NH₄)₂SO₄)0.2％-0.4％，碳酸钙(CaCO₃)0.1％-0.3％、蒸馏水93％-95％，pH值为6.5-7.5。

所述的黑曲霉的种子优化发酵培养基为葡萄糖5％-7％，豆饼0.5％-1.5％，硫酸铵0.4％-0.6％，氯化钙0.2％-0.4％，蒸馏水91.5％-93.5％，PH值为4～6.5。

所述的碳源为葡萄糖、氨基乙酸、蔗糖、玉米粉等；所述的氮源为尿素、硫酸铵、蛋白胨等；所述的无机盐为碳酸钙、磷酸二氢钾、硫酸镁。

本发明利用天然植物发酵技术制备饲料添加剂，微生物具有氧化、酯化、甲基化、羟基化、还原化等多种能力，天然植物发酵经生物转化后，其有效成分能被充分分离、提取，使其更具有生物活性，并含有大量的活性酶，服用后能被机体组织细胞迅速吸收，达到祛病、健体、增强免疫调节的功能，更好地发挥天然植物这一天然药物的药效作用，从而降低用药成本，提高功效。

本发明的优点是：

1.本发明在配合饲料中不添加抗生素、镇静剂和激素等有害添加剂前提下，加入本发明，猪、鸡增重提高5-10％左右，饲料转化率提高5-8％；

2.发酵为探索、改进天然植物药物制药工艺提供了新的技术

以天然植物药物为培养基或在培养基中添加适量天然植物药物，能对天然植物药物进行转化后提高黄酮、绿原酸的含量，降低天然植物药物的毒副作用或提高其药效，其原理为利用酶强大的分解转化能力，不仅可对培养基中中药的纤维、糖类和蛋白等物质加以利用，而且在代谢过程中可以对天然植物药物中的一些成分进行转化，从而提高黄酮、绿原酸的比例及效价，天然植物药物中的成分亦能促进药用真菌的生长或活性产物的产生，这样可生产出包含多种活性成分且药效较简单，组方配伍更佳的新型发酵制剂；

3.发酵技术有利于中药有效成分的提取与分析

将发酵技术运用于天然植物药物的提取，不仅使天然植物药物提取率得到提高，有效成分得到纯化，而且还可以通过采用一些羟化酶等特殊酶对中药的有效成分做一些结构改造，由于微生物生长主要消耗的是动植物的蛋白质、糖等常规物质，对有效成分有浓缩作用；

4.发酵技术有利于改善天然植物药物药理和毒理作用

用发酵法生产的天然植物药物与未发酵的天然植物药物相比，其有效成分在药理、毒理等方面的作用发生了改变，经微生物的分解作用使原来不易消化吸收的物质变得易于吸收；

5.发酵技术用于天然植物药物炮制

现代发酵工程证实微生物具有酯化，氧化，乙酰化，还原化，甲基化，羟基化和羰基化等多种能力，因此利用微生物来发酵炮制天然植物药物实质上是一种酶催化天然植物药物有效成分改性的生物转化反应，微生物由于自身存在丰富的酶系而有着在温和条件下分解转化物质的能力，通过微生物与天然植物药物共发酵来进行天然植物药物炮制可以比一般的物理化学手段更大幅度地改变药性，提高药效，降低毒副作用，扩大适应症。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明采用黑曲霉和枯草芽孢杆菌由农业部菌种保存中心提供。

实施例1：通过不同微生物对蒲公英、黄芪粗提液进行生物转化生产饲料添加剂。

取黑曲霉和枯草芽孢杆菌分别在4℃下保藏；

步骤一：黑曲霉对蒲公英粗提液的生物转化

本实例主要是提高蒲公英有效成分总黄酮的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)黑曲霉种子及发酵培养基的制备

将黑曲霉接种于种子扩大培养基中，放入35℃-40℃的恒温培养箱中培养2-3天，再接入种子优化发酵培养基后置于35℃-40℃的恒温摇床培养箱中培养2-3天，每300ml三角瓶装量50ml液体培养基，得到培养好的枯草芽孢杆菌；

黑曲霉的种子扩大培养基为种子培养基：玉米粉3％、麸皮2％、硫酸铵0.15％、磷酸二氢钾0.2％、硫酸镁0.05％、蒸馏水94.6％，pH为6.0。

黑曲霉的种子优化发酵培养基为葡萄糖(蔗糖)6％、豆饼(酵母膏或尿素)1％、硫酸铵0.5％、氯化钙0.3％、蒸馏水92.2％，PH为4～6.5。

(2)蒲公英水提液的制备

取一吨提取罐，则称取200千克蒲公英，加入500千克水煮沸60分钟，将蒲公英残渣过滤掉，减压浓缩，则获得蒲公英的粗提液；

(3)黑曲霉对蒲公英粗提液的发酵

将黑曲霉菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及蒲公英水提液60％均匀混合后置入通风罐内，40℃下发酵3天，经醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品；

步骤二：枯草芽孢杆菌对蒲公英粗提液的生物转化

本实例主要是提高蒲公英有效成分总绿原酸的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)枯草芽孢杆菌种子及发酵培养基的制备

将枯草芽孢杆菌接种于斜面培养基中，放入35℃-40℃的恒温培养箱中培养2-3天，再接入种子优化发酵培养基后置于35℃-40℃的恒温摇床培养箱中培养2-3天，每300ml三角瓶装量50ml液体培养基，得到培养好的枯草芽孢杆菌种；

枯草芽孢杆菌斜面培养基成分为牛肉膏0.5g、蛋白胨1.0g、氯化钠0.5g、水100ml、琼脂2g，pH自然，于0.1mpa蒸汽灭菌30min。

枯草芽孢杆菌种子优化发酵培养基为：蔗糖3％、蛋白胨1％、酵母膏0.5％、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.45％，硫酸铵((NH₄)₂SO₄)0.25％、碳酸钙0.2％，蒸馏水94.6％，pH7.0。

(2)蒲公英水提液的制备

取一吨提取罐，则称取200千克蒲公英，加入500l水煮沸60分钟，将蒲公英残渣过滤掉，减压浓缩，则获得蒲公英的粗提液。

(3)枯草芽孢杆菌对蒲公英粗提液的发酵

将枯草芽孢杆菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及蒲公英水提液60％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵3天，醇沉，减压，干燥，粉碎后得到粉末状的成品。

步骤三：枯草芽孢杆菌对黄芪粗提液的生物转化

本实例主要是提高黄芪有效成分总黄酮的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)黄芪水提液的制备

取一吨提取罐，则称取200千克黄芪，加入500l水煮沸60分钟，将蒲公英残渣过滤掉，减压浓缩，则获得黄芪的粗提液。

(2)枯草芽孢杆菌对黄芪粗提液的发酵

将枯草芽孢杆菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及黄芪水提液60％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵3天，醇沉，减压，干燥，粉碎后得到粉末状的成品。

步骤四：生物转化生产饲料添加剂成品制作

将步骤一的干粉30％、步骤二的干粉30％、步骤三的干粉30％、甘草粉10％混合，过80目筛，得混合干粉成品，即本饲料添加剂成品。

在使用时，根据不同畜禽按不同比例与饲料均匀拌和后喂养：畜禽类动物按3‰比例；水产类动物按2‰比例。

用于饲料制粒时，将本产品制粒专用型按1-3‰的比例加入饲料或预混料中进行制粒。

实施例2：通过不同微生物对蒲公英、黄芪固体发酵生产饲料添加剂

步骤一：黑曲霉对蒲公英固体发酵

本实例主要是提高蒲公英有效成分总黄酮的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)黑曲霉种子及种子优化发酵培养基的制备与实施例1相同；

(2)蒲公英的制备

用超微粉碎机将蒲公英粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用。

(3)黑曲霉对蒲公英固体的发酵

将黑曲霉菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及蒲公英60％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵5天，水提，醇沉，减压，干燥，粉碎，得到粉末状的成品。

步骤二：枯草芽孢杆菌对蒲公英固体发酵

本实例主要是提高蒲公英有效成分总绿原酸的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)枯草芽孢杆菌种子及种子优化发酵培养基的制备与实施例1相同；

(2)蒲公英的制备

用超微粉碎机将蒲公英粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用。

(3)枯草芽孢杆菌对蒲公英粗提液的发酵

将枯草芽孢杆菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及蒲公英60％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵5天，水提、醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品。

步骤三：枯草芽孢杆菌对黄芪固体发酵

本实例主要是提高黄芪有效成分总黄酮的含量，以提高畜禽的免疫力，促进动物生长。

(1)黄芪的制备

用超微粉碎机将黄芪粉碎至80目，再用35％水浸泡，备用。

(2)枯草芽孢杆菌对黄芪固体发酵

将枯草芽孢杆菌剂20％加以2∶1∶1比例的氨基乙酸、尿素、无机盐20％及黄芪60％均匀混合后置入通风罐内，35-40℃下发酵5天，水提、醇沉、减压、干燥、粉碎后得到粉末状的成品。

步骤四：生物转化生产饲料添加剂成品制作

将步骤一的干粉30％、步骤二的干粉30％、步骤三的干粉30％、甘草粉10％一起混合，过80目筛，得混合干粉成品，即本饲料添加剂成品。

在使用时，根据不同畜禽按不同比例与饲料均匀拌和后喂养：畜禽类动物按3‰比例；水产类动物按2‰比例。

用于饲料制粒时，将本产品制粒专用型按1-3‰的比例加入饲料或预混料中进行制粒。

指标测定

供试品溶液的制备及总黄酮含量的测定：

a.对照品溶液的配制：精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品10mg，置100mL容量瓶中，精密吸取10mL 0.85乙醇溶解，加蒸馏水稀释至刻度(1mL＝0.1mg芦丁)。

b.供试品溶液的配制：精密称取本产品40g，加入1000mL水，熬制黄芪由黄色变为白色后，加入70％乙醇，旋转蒸发30min，得到中药浓缩液，备用.

c.标准曲线  精密量取芦丁标准液0.0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，分别置10mL容量瓶中，按顺序分别加5％亚硝酸钠溶液0.4mL摇匀，放置6min。加10％氯化铝溶液0.4mL，摇匀，放置6min。再加4％氢氧化钠溶液4mL，并加蒸馏水稀释至刻度，摇匀，放置15min。以标准溶液中0.0mL的标准液做空白，于波长510nm处测定各吸光度，绘制标准曲线得回归方程。

供试品溶液的制备及绿原酸含量的测定：

a.对照品溶液的配制：精密称取在120℃干燥至恒重的绿原酸对照品10mg，置100mL容量瓶中，精密吸取10mL 0.85乙醇溶解，加蒸馏水稀释至刻度(1mL＝0.1mg绿原酸)。

b.绿原酸标准曲线的绘制：根据所配置的已知浓度剃度的绿原酸标准溶液，在35℃与三氯化铁发生特殊的显色反应，在755nm条件下用可见光分管光度计测定吸光度值之后，绘制标准曲线。

c.供试品溶液的配制：将10g本产品加入水中，煮沸30min，并不断加水补充，并定容测体积。取蒲公英的提取液，醇沉后，取8ml液体，在35℃的水浴锅中加入0.8ml的FeCl₃溶液，震荡摇匀后，静置60min，以755nm为检测波长，用可见光分光光度计测定提取液的吸光度值。根据绿原酸标准曲线得到本产品中绿原酸含量。

饲料添加剂参数的对比表

表1  不同方法制备饲料添加剂绿原酸和总黄铜的参数

    制备方法    绿原酸(％)    总黄酮(％)传统提取方法    1.5    4.0固体发酵后提取方法    2.3    6.5液体发酵提取方法    2.9    7.8