法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2022-06-28
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/09 专利号:ZL2007101306743 申请日:20070716 授权公告日:20130410
专利权的终止
2013-04-10
授权
授权
2010-06-16
实质审查的生效 IPC(主分类):C12N15/09 申请日:20070716
实质审查的生效
2008-01-23
公开
公开
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地涉及在酵母中表达和生产吸血蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂α2(DSPA α2)重组蛋白的方法，其中包括使用密码子得到优化的DSPAα2基因、特定的酵母菌发酵培养生长条件以提高其生物产量以及在DSPAα2基因的5’端前添加6组氨酸标签编码序列以方便DSPAα2重组蛋白的快速纯化。
背景技术
所谓血栓(thrombus)就是人体内的某些主要器官(例如心脏、大脑、肢体和肺部等)或其他部位血管腔内血液中的一些有形成分(血小板、纤维蛋白、红细胞等)互相粘连在一起时形成了一个局部的和较稳定的“机械性”的栓子，可阻挡和延缓血液的顺利通过，它与正常的生理性止血有所不同，是止血机制过度激活的一种病理性结果。
血栓对人体的危害是很大的，主要表现在以下几个方面：(1)阻塞动脉血管：在血栓尚未完全阻塞血管腔时，可引起局部器官缺血而造成萎缩，如完全阻塞或引起必需的供血量不足而又缺乏有效的侧支循环时，可引起局部器官的缺血性坏死。例如，脑动脉血栓可能会引起脑梗死，心脏冠状动脉血栓可能会引起心肌梗死，而血栓闭塞性脉管炎则会引起患肢坏疽等。静脉血栓形成后，若未能建立有效的侧支循环，则引起局部淤血、水肿、出血，甚至坏死，如肠系膜静脉血栓可导致出血性梗死。(2)栓塞：在血栓未与血管壁牢固粘着之前，血栓的整体或部分可以脱落，形成栓子，随血流运行，在到达远侧端时，会引起栓塞。如栓子内含细菌，可引起栓塞组织的败血性梗死或栓塞性脓肿。(3)心瓣膜变形：心瓣膜血栓机化，可引起瓣膜粘连，造成瓣膜狭窄，如在机化过程中纤维组织增生而后瘢痕收缩，可造成瓣膜关闭不全，见于风湿性心内膜炎和亚急性细菌性心内膜炎。(4)微循环的广泛性微血栓形成，即DIC：可引起全身性广泛出血和休克。由此可见血栓对人体是十分危险的，如不及时治疗，就可能致死或致残。因此，开发具有预防和治疗各种血栓性疾病的新一代的蛋白类溶栓新药，对保护人类健康是非常有意义的。
要开发溶栓新药，首先就需要了解什么是“纤溶系统”或“纤维蛋白溶解系统”。它是人或哺乳动物体内一种具有多种生理功能的蛋白水解系统，其主要作用是防止血管腔内纤维蛋白的过度形成，因此，纤溶系统不仅与血栓的形成和溶解有密切关系，同时也是许多蛋白类溶栓新药开发的基础。
纤维蛋白溶解系统可使人体内所产生的局部或一过性的纤维蛋白凝块随时得到溶解(即降解血管壁上沉积的纤维蛋白)，从而防止血栓形成；此外，它还具有保证腺体排泌道的通畅、清除伤口或炎症局部纤维蛋白凝块以促进伤口愈合的功能。不仅如此，纤溶系统还与细胞移行、生长及胚胎发生有关，在恶性肿瘤的发展和转移过程中也显示出很重要的地位。
纤溶系统主要由纤溶酶原、纤溶酶原激活剂、纤溶酶原激活剂抑制物以及纤溶酶灭活物等四个部分所组成，其中最基本和核心的成分是纤溶酶原，最初它是没有任何纤溶活性的，但在体内、外激活剂的作用下，可以转变成为能够溶解纤维蛋白的纤溶酶，而纤溶酶原激活剂抑制物以及纤溶酶灭活物则起到相反的作用，它们主要对纤溶系统的过度激活起调节作用。
吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)是一种生活在南北美洲以牲畜和其他大型哺乳动物的血液为食的生物，它的唾液有防止其它动物血液凝固的特殊作用。最初，人们从吸血蝙蝠的唾液中分离到一些能够溶解血栓的蛋白类物质，但后来更深入的研究却发现它就是蝙蝠唾液纤溶酶原激活剂(Salivary PlasminogenActivivator，DSPA)。蝙蝠唾液的这种溶栓作用是自然选择的结果，这使得吸血蝙蝠更适于取食动物的新鲜血液。蝙蝠DSPA在氨基酸序列方面与人纤溶酶原激活剂(t-PA)约有85％的同源性，因此，在静脉滴注到人体后会显示出极低的免疫原性[1]。特别值得提出的是，与其它蛋白类溶栓药物不同，蝙蝠DSPA对纤维蛋白有高度选择性，在没有纤维蛋白存在的情况下，它仅维持很低的生物活性；但当有纤维蛋白出现时，它能迅速与之结合并将活性急速提高数万倍。正是因为有这种特性，使其在溶解血栓时不至于引起因整个纤溶系统的过度激活而造成纤维蛋白、纤维蛋白原的大量消耗以及凝血因子降解，并进而导致不规则出血的风险。所以从各个方面来看，吸血蝙蝠DSPA都符合人们对新型溶栓蛋白类药物的期望。DSPAα2可激活人纤溶酶原，使其转变为有活性的纤溶酶，由此进一步造成纤维蛋白的快速水解，故该重组蛋白在今后非常有希望被开发成为一种能治疗各种急性血栓类疾病的蛋白类药物。
1991年，Kratzschmar等人[2]首次从吸血蝙蝠中分离到编码四种不同DSPA的cDNA，分别命名为DSPAα1、DSPAα2、DSPAβ和DSPAγ。序列同源性比较发现，这四种蝙蝠DSPA分别是由不同的基因所编码的，即并不是由同一个基因转录后编缉和加工而来。DSPAα1和DSPAα2序列最长，都编码一条多肽链，它们的成熟蛋白(含441个氨基酸残基)包括四个功能域，分别为一个指区(Finger)、一个表皮生长因子区(EGF)、一个Kringle区(K)和一个丝氨酸蛋白酶区(P)。DSPAβ和DSPAγ编码的蛋白都比较小，成熟蛋白仅含有395和358个氨基酸残基；此外，DSPAβ编码的蛋白缺乏Finger区，DSPAγ编码的蛋白缺乏Finger和EGF两个区。Bringmann等人在研究时发现，蝙蝠DSPA对纤维蛋白高度敏感，与人t-PA相比，DSPA缺乏纤溶酶敏感性剪切位点[3]。人t-PA最初是以单链酶原形式存在，经在活性位点剪切后才能转变为有活性的双链形式，而蝙蝠DSPA自始至终都是以单链形式存在，并不需要其它蛋白酶切割。当有纤维蛋白多聚体存在时，DSPAα1或DSPAα2的生物活性迅速增加，比无纤维蛋白时要高出102,100倍，而人t-PA却只增高550倍[4]。此外，经研究还证实，Finger区对蝙蝠DSPA与纤维蛋白的结合非常重要。DSPA家族中缺乏Finger区的DSPAβ和DSPAγ对纤维蛋白结合不够紧密，而且受纤维蛋白刺激程度也较小。
DSPAα1因在蝙蝠唾液中含量和活性最高而受到很多学者的关注，因此针对它的研究也比较多，如Petri等人曾在CHO细胞中表达了重组DSPAα1，表达量达到60mg/L；同时利用杆状病毒在昆虫细胞中表达，表达量达到10mg/L[5]。Schiermeyer等人在烟草中也表达了这种蛋白，其表达量最高达到每克叶片材料中含有38μg重组蛋白[6]。对活性高且特异性也很强的DSPAα2的研究目前还很少，只有早期Kratzschmar等人在BHK细胞中表达了上述四种不同形式的DSPA纤溶酶激活剂，但遗憾的是，在这个表达体系中重组蛋白的表达量都不高[7]。
DSPA虽然是一种前景十分诱人的溶栓剂，但由于它存在于一种并不常见且危险的吸血蝙蝠中，靠人工提取显然是不现实的。要得到廉价和有效的蝙蝠DSPA溶栓类药物，建立基因工程的大规模生产平台十分必要的。
基因工程研究领域的最新进展使利用一些酵母细胞作为生物反应器而高效表达外源基因成为可能，特别值得提出的是巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统。迄今为止，人们利用该表达系统已成功表达的外源蛋白基因超过了300种[8]，其中包括了来自细菌、真菌、原核生物、植物、动物和人类等广泛来源的基因。作为生物反应器，其优越性还在于：(1)酵母为单细胞生物，遗传背景、生理特征较为清楚。其生长营养要求简单，细胞密度高，易于操作，而且发酵技术较为成熟、工艺简单、成本低廉；(2)在蛋白质诱导表达过程中以甲醇为唯一碳源，无抗药性标记、培养过程中不分泌有毒物质，毒性较细菌小，具有良好的安全性；(3)利用甲醇诱导乙醇氧化酶启动子(AOX1)进行重组蛋白质的表达，无论是在胞内还是分泌到胞外均有可能实现高效表达，且使用分泌型表达时本底表达很少，产物易于纯化；(4)酵母为真核生物，可进行很多典型的高等真核生物蛋白翻译后加工和修饰，如糖基化、脂酰化、磷酸化以及蛋白裂解、折叠、二硫键的形成等[9～11]。
在本发明之前，还没有人按照酵母所偏爱的密码子对编码蝙蝠DSPAα2的基因进行过优化以便其能更稳定和更高效地在酵母体内表达，由此大大增加重组DSPAα2蛋白的生物产量；也没有人在DSPAα2基因的5’端前添加6组氨酸标签编码序列以便在下游加工过程中有助于该重组蛋白快速纯化；也未对重组酵母的发酵培养条件进行过优化，从而为大规模、工业化发酵生产这种药用重组蛋白奠定基础，而该重组蛋白在经过部分或完全纯化后有可能用于治疗人类的各种急性血栓类疾病。
发明内容
(一)要解决的技术问题
本发明的目的之一是要证实编码DSPAα2的基因在不改变氨基酸序列的前提下，若全部编码序列在按照酵母所偏爱的密码子进行优化后，基因新序列不仅可以在酵母中表达和生产，而且其表达效率要比未经过密码子优化的DSPAα2的基因有较大的提高，从而使分泌到体外的重组DSPAα2蛋白的生物量也大大增加，按照一个优先的实施方案，密码子优化后的DSPAα2的基因要能够在毕赤酵母中高效表达和生产，而所产生的DSPAα2重组蛋白可以分泌到胞外并具有象天然蛋白一样的生物活性。
本发明的目的之二是要给DSPAα2添加一个标签结构，由此为该重组蛋白的下游加工带来极大的方便并能显著够降低生产成本。按照一个优先的实施方案，一个6组氨酸标签结构的编码序列被添加在密码子优化后的DSPAα2的基因的5’端，它不仅不会影响DSPAα2基因在毕赤酵母中的高效表达和生产，而且所产生的DSPAα2重组蛋白还可以分泌到胞外，此外，带有的6组氨酸标签结构在没有切掉的情况下并不影响它的生物学活性。
本发明的目的之三是提供最适的重组酵母培养生长和诱导表达条件，按照一个优先的实施方案，特别提供了有关重组毕赤酵母的最适培养生长和诱导表达条件，由此使该重组酵母的生长量和重组蛋白DSPAα2蛋白的分泌量都尽可能地达到最大化，以便为这种重组酵母的大规模工业化生产、低成本发酵和纯化奠定基础。
(二)技术方案
本发明利用酵母表达系统生产DSPAα2，而该重组蛋白具有与天然蛋白一样的生物活性，即能够激活纤溶酶原，将其转变为有活性的纤溶酶并迅速地溶解纤维蛋白。按照一个优先的实施方案，就是本发明提供了极大地提高DSPAα2重组蛋白在毕赤酵母中表达效率的方法、提供DSPAα2重组蛋白快速纯化的方法以及提供重组酵母的高密度发酵的方法和条件。
本发明利用酵母表达系统生产DSPAα2重组蛋白，如果将其经过部分或完全纯化后有可能用于治疗各种急性心脑血栓性疾病。例如，将纯化后的DSPAα2重组蛋白以一定的剂量静脉滴注或灌注到患急性心梗或脑梗阻患者体内，就有可能使病人的症状迅速得到缓解。
本发明所指的DSPAα2重组蛋白是在酵母中表达和生产的，首先是编码DSPAα2的基因被完全人工合成出来，其中包括密码子优化过的或未经过优化的基因序列，而且在基因的5’端都含有6组氨酸标签编码序列结构，然后，它们被分别插入到一个带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上。在该质粒载体上，还含有一个诱导性启动子，该启动子位于DSPAα2和6组氨酸标签编码序列的上游，它操纵DSPAα2基因在酵母细胞中的表达。该质粒载体经线性化后，可通过电融合法或LiCl法转化酵母细胞，进而稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母在发酵培养过程中经过诱导后，表达的DSPAα2重组蛋白在信号肽的引导下得以分泌到培养基中。
本发明提供了极大地提高DSPAα2重组蛋白在酵母细胞中生物产量的方法，按照一个优先的实施方案，本发明提供了极大地提高了DSPAα2重组蛋白在毕赤酵母细胞中生物产量的方法，而该重组蛋白已知在天然状态下具有激活纤溶酶原的作用；或者更确切说，本发明的DSPAα2重组蛋白与源自吸血蝙蝠唾液或其它常规表达系统产生的该DSPAα2重组蛋白一样，作为溶栓剂可广泛地应用在医药领域。
本发明的重组蛋白可以是DSPAα2天然蛋白的全部。然而，在某些具体实施方案中，所表达的DSPAα2重组蛋白也可能只是该天然蛋白的一部分。有时，DSPAα2重组蛋白可与另外一个具有不同生物学功能的蛋白基因如大肠杆菌热敏毒素B亚基在同一个酵母细胞内同时分别表达或拼接在一起形成融合蛋白共同表达，目的是为了方便提纯或提高其生物活性。蛋白的融合可以通过蛋白翻译后加工、共价结合的方式，或者通过DNA重组技术使基因在翻译表达前就相互拼接在一起，而这两种技术是本领域专家早已熟知的技术。
在酵母细胞中，DSPAα2蛋白基因表达效率的高低，直接关系到以后该重组蛋白的提取加工利用及所生产相关产品成本的高低，按照一个优先实施的方案，为提高DSPAα2重组蛋白在酵母细胞中的表达量，编码DSPAα2重组蛋白的基因可以按照酵母所偏爱的密码子先进行优化，以便使该外源基因在酵母细胞中更稳定，在转录成mRNA和翻译成蛋白时效率更高。此外，为了快速纯化DSPAα2重组蛋白，也可与其它蛋白进行融合表达，按照一个优先的实施方案，在DSPAα2基因的5’端添加6组氨酸编码序列，正是由于这种改变，使该DSPAα2重组蛋白更易于通过亲和层析得到高度的纯化，进而使该重组蛋白能更可广泛地应用于医药领域。
对本发明所使用的方法和其它相关事项极为重要的是一些质粒载体的构建，它们在获得本发明所指的酵母细胞及其表达重组产物的加工应用中起重要作用。用于转化酵母细胞的质粒载体由密码子优化后的、编码DSPAα2的基因或其衍生物的DNA序列和操纵该基因或DNA序列在所说的酵母细胞中表达的一个诱导性启动子组成。在某些具体实施方案中，质粒载体还包括一个选择性或标记基因，主要用于重组酵母细胞的筛选和检测。在某些具体实施方案中，本发明的诱导性启动子是醇氧化酶基因启动子(AOX1)。正如上面所述，按照某些具体的实施方案，本发明的质粒载体用于转化毕赤酵母，它所编码的外源蛋白是DSPAα2，更进一步说，质粒载体所编码的DSPAα2重组蛋白能够激活纤溶酶原，在形成纤溶酶后可快速地溶解纤维蛋白。或者更确切说，本发明的DSPAα2重组蛋白与源自吸血蝙蝠唾液或其它常规表达系统产生的该DSPAα2蛋白一样，作为溶栓剂可广泛地应用在医药领域。
本发明也提供了酵母细胞的转化和重组酵母细胞的筛选方法，它包括以下步骤：(1)DSPAα2基因的人工合成、其中涉及到按照酵母所偏爱的密码子对该基因密码子进行优化以及在其5’端添加6组氨酸编码序列；(2)构建一个质粒表达载体，其中含有编码DSPAα2重组蛋白的基因或其衍生物的基因(包括基因密码子被优化、改变或与其他基因相互融合等)，而且该基因或其衍生物被置于一个诱导性启动子的操纵之下；(3)通过电融合法或LiCl法，用上述质粒表达载体DNA转化酵母细胞；(4)挑选转化的酵母细胞单菌落，逐一分别接种到MM和MD固体平板培养基上，那些在MD培养基上生长正常但在MM平板上生长极其缓慢或完全不生长的酵母单菌落就是含有外源基因的重组子。
按照一个具体的实施方案，本发明提供了经过优化的重组毕赤酵母培养生长条件及DSPAα2重组蛋白的快速纯化方法，它包括了以下四个阶段：(1)菌体培养，在经过22-24小时的培养后，酵母菌体湿重将达到95-100g/L左右；(2)饲喂碳源，在培养4小时后，酵母菌体的湿重将到达190-200g/L左右；(3)诱导表达，加入甲醇，诱导酵母细胞高效表达DSPAα2重组蛋白并将其分泌到培养基中；(4)蛋白纯化，发酵液经过离心、取上清液、硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析等步骤，DSPAα2重组蛋白的纯度可达99％以上。
本发明在详细介绍酵母表达系统时仅提到了毕赤酵母表达系统，然而，正如本领域专家所早已熟知的酵母表达系统那样，许多种酵母表达系统都可以利用本发明提供的方法进行转化、表达和生产。因此，所有这些酵母表达系统都应包括在本发明的权利要求范围之内。
就象下面实例中所要详细描述的那样，本发明描述的酵母转化方法中所用的质粒表达载体是一个整合性质粒表达系统，按照一个优先的实施方案，本发明所使用的质粒表达载体是pPIC9K。
本发明包括以下几个组成部分：(1)DSPAα2基因的人工合成，其中分别包括密码子优化过的或未经过优化的基因编码序列。就密码子优化而言，是根据酵母所偏爱的密码子、人工合成编码DSPAα2全基因的DNA核苷酸序列，其中在合成过程中，同时在该基因5’端添加了6组氨酸编码序列。上述产物被直接插入到PCF-T中间质粒的T位点内，经蓝白系统选择，可获得含有外源插入片段的细菌克隆(重组子)，序列分析所获基因的正确性和完整性；(2)利用DNA重组技术构建酵母质粒表达载体。它们分别含有未经密码子优化和改造的DSPAα2蛋白基因(作为对照)以及密码子经过优化和改造后的DSPAα2蛋白基因或其衍生物(包括与其他基因片段的相互融合等)；(3)高表达酵母重组子的筛选。经过电融合法或LiCl法，将上述重组后酵母质粒表达载体分别导入酵母受体细胞，在RDB固体平板培养基上挑选转化的酵母细胞单菌落，逐一分别接种到MM和MD固体平板培养基上，那些在MD培养基上生长正常但在MM平板上生长极其缓慢或完全不生长的酵母单菌落就是含有外源基因的重组子。为了筛选到高表达重组酵母菌株，将获得的酵母重组子逐一接种在诱导表达培养基中进行诱导表达，在相同的培养条件下，对其诱导表达产物进行纤维蛋白溶解活性鉴定，从中可挑选出表达效率最高的重组酵母菌株；(4)提供重组酵母最适生长培养和诱导表达条件。重组酵母的高密度发酵分为菌体培养、碳源饲喂和诱导表达三个阶段，在每个阶段均给予最适的培养时间和环境条件。发酵液分别经过离心、硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析等步骤后，可得到纯度达99％以上的DSPAα2重组蛋白。
选择DSPAα2基因在酵母中表达和生产是因为该蛋白能够激活纤溶酶原生成纤溶酶并进而溶解纤维蛋白，因此，该蛋白作为溶栓剂有可能被可广泛地应用在医药领域。尽管DSPAα2具有诱人的应用前景，但是它的规模化和工业化生产问题一直没有得到很好地解决，而选择毕赤酵母表达系统是因为它是目前最常用的一个外源重组蛋白表达系统。
(三)有益效果
采用本发明所述的方法，有效提高了DSPAα2重组蛋白的表达量，并且简化了重组蛋白的纯化工艺，适于工业化规模生产DSPAα2重组蛋白。
附图说明
为了详细描述本发明的某些优先实施方案，并以相应的绘图作参考：
图1 DSPAα2基因密码子优化和改造前后对比，N代表密码子优化和改造前的基因序列；M代表密码子优化和改造后的基因序列；
图2 密码子经过优化DSPAα2基因的克隆及其酵母表达载体的构建；
图3 密码子未经优化DSPAα2基因的克隆及其酵母表达载体的构建；
图4 利用纤维蛋白平板法检测源自不同重组毕赤酵母菌株的DSPAα2重组蛋白表达情况：CK+：t-PA(购自中国药品鉴定所，工作浓度为10IU/mL)(阳性对照)；CK-1：经pPIC9K质粒转化的酵母重组子诱导表达产物(阴性对照之一)处理；CK-2：经BMMY培养液处理(阴性对照之一)；1～7：经密码子未经优化的DSPAα2基因转化的重组酵母菌株的诱导表达产物处理；8～17：经密码子优化和改变后DSPAα2基因转化的重组酵母菌株的诱导表达产物处理；
图5SDS-PAGE检测PP-DSPAα2M酵母重组子(含密码子优化后的DSPAα2基因)在不同诱导表达培养时间DSPAα2重组蛋白的表达情况：1～6：分别为培养24、48、72、96、120和144小时的情况。7：为pPIC9K质粒转化的酵母重组子诱导表达情况(阴性对照，培养144小时)。8：为标准分子量marker(Amersham Biosicences产品)；
图6SDS-PAGE检测PP-DSPAα2M高密度发酵诱导表达产物及通过离心收集发酵上清液、硫酸铵沉淀和镍柱亲和层析后的DSPAα2重组蛋白：1为标准蛋白分子量marker(Amersham Biosicences产品)；2为和PP-DSPAα2M高密度发酵后诱导表达产物(诱导表达96小时)；3为纯化后的DSPAα2重组蛋白。
具体实施方式
下面以毕赤酵母表达DSPAα2为例，描述一些优先的实施方案，但本发明的应用不仅限于此。本发明的进一步描述只是一些特别的优先实施方案，是按照专利申请要求以及为了解释和说明本专利的内容。很显然，在不背离本发明的精神和范围之内，可在此基础上，做进一步的改进和变化。
实施例1：
1.密码子优化后的蝙蝠DSPAα2基因的人工合成
尽管蝙蝠和酵母都属于真核生物，但它们在基因密码子偏好方面仍然存在着一定的差异，这种差异有可能会影响到DSPAα2基因及转录产物在酵母中的稳定性和表达效率。为提高DSPAα2的生物产量，根据业已公布的吸血蝙蝠唾液DSPAα2的基因序列(见GenBank，登录号为M63988)，在不改变该蛋白氨基酸序列的前提下(见序列表的1)，按照酵母所偏爱的密码子[12]，人工设计和合成了新的吸血蝙蝠DSPAα2成熟蛋白的DNA编码序列，与此同时，为了便于以后酵母质粒表达载体的构建及DSPAα2重组蛋白的纯化，在人工合成该DSPAα2编码序列的过程中，在该基因5’端第一个密码子GCT前添加了限制性酶切位点SnaBI(TACGTA)和6组氨酸标签结构编码序列CACCACCACCACCACCAC(见序列表中的2)；在该基因的3’端终止密码子TAA后增加了限制性酶切位点NotI(GCGGCCGC)(上述基因拼接和合成工作均由上海博亚生物技术公司代为完成)。密码子优化后的DSPAα2成熟蛋白基因与改造前相比，改变了其中的251个核苷酸碱基，总共涉及到216个密码子，而G+C含量由原来的53.8％变为46.9％，基因改造前后对比见图1。
2.密码子优化后的DSPAα2基因的克隆
将上述人工合成的密码子优化后的蝙蝠DSPAα2基因DNA片段直接插入和连接到PCF-T质粒中的T位点内(购自TransGenic公司，操作见产品说明书)，按照该公司所提供的方法，通过蓝白系统筛选，得到含有密码子优化后的DSPAα2基因的细菌克隆pCFDSPAα2M(见图2)，然后，通过核苷酸序列分析，确定编码DSPAα2M的基因是正确和完整的(见序列表中的2)(DNA测序由上海博亚生物技术公司代为完成)。
3.酵母表达载体p9KDSPAα2M的构建
在人工合成密码子优化后的DSPAα2基因时，因为在其5’端和3’端序列中分别引入了SnaBI和NotI限制性酶切位点，所以pCFDSPAα2M质粒DNA经SnaBI和NotI双酶切后，可将密码子优化和改造后的DSPAα2M基因切割下来，通过琼脂糖凝胶电泳，进而可分离获得该DNA片段，随后再将其定向插入到质粒pPIC9K的相应位点内(SnaBI和NotI双酶切)，便构建成酵母诱导性表达质粒载体p9KDSPAα2M(见图2)。
质粒pPIC9K购自美国Invitrogen公司，它是一个高效的酵母诱导性表达载体，在甲醇的诱导下，可高效表达外源基因。因为在该表达载体多酶切位点前含有α-因子信号肽编码序列，在与外源蛋白基因融合表达后，可引导外源重组蛋白向酵母胞外分泌。在分泌到胞外的过程中，该信号肽序列可以被酵母Kex2或Ste13基因表达产物完全地切割下来，从而完全不会影响到DSPAα2重组蛋白的生物活性。
实施例2：
1.密码子未优化的蝙蝠DSPAα2基因的人工合成
根据业已公布的吸血蝙蝠唾液DSPAα2的基因编码序列(见GenBank，M63988)，人工合成了DSPAα2成熟蛋白的DNA编码序列。为了便于以后酵母质粒表达载体的构建及DSPAα2重组蛋白的纯化，在人工合成DSPAα2成熟蛋白DNA编码序列的同时，在该基因的5’端第一个密码子GCA前添加了限制性酶切位点SnaBI(TACGTA)和6组氨酸标签结构编码序列CACCACCACCACCACCAC(见序列表中的3)；在该基因的3’端终止密码子TAA后增加了限制性酶切位点NotI(GCGGCCGC)(上述基因拼接和合成工作均由上海博亚生物技术公司代为完成)。
2.密码子未优化的蝙蝠DSPAα2基因的克隆
将上述人工合成的密码子未优化的蝙蝠DSPAα2基因DNA片段直接插入和连接到PCF-T质粒中的T位点内，通过蓝白系统筛选，得到含有密码子未优化DSPAα2基因的细菌克隆pCFDSPAα2(见图3)，然后，通过核苷酸序列分析，确定编码DSPAα2的基因是正确和完整的(见序列表中的3)(DNA测序由上海博亚生物技术公司代为完成)。
3.酵母表达载体p9KDSPAα2的构建
在人工合成密码子未优化的DSPAα2基因时，因为在其5’端和3’端序列中分别引入了SnaBI和NotI限制性酶切位点，所以pCFDSPAα2质粒DNA经SnaBI和NotI双酶切后，可将密码子未优化的DSPAα2基因切割下来，通过琼脂糖凝胶电泳，进而可分离获得该DNA片段，随后将其插入到质粒pPIC9K中(SnaBI和NotI双酶切)，便构建成酵母诱导性表达质粒载体p9KDSPAα2(见图3)。
实施例3：
1.p9KDSPAα2和p9KDSPAα2M质粒DNA的制备
首先用碱裂解法[13]从大肠杆菌细胞DH5α(购自美国GIBCO公司)中分别提取出p9KDSPAα2和p9KDSPAα2M质粒DNA，然后用1-2倍过量的限制性内切酶SalI分别酶切上述质粒DNA，使之完全线性化，可利用琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。然后用酚和氯仿分别抽提上述酶切产物，乙醇沉淀，经冷冻干燥后，将沉淀重新溶解在无菌的去离子水中，-20℃冰箱中保存备用。
2.酵母细胞的转化
挑取毕赤酵母菌株GS115(购自美国Invitrogen公司)单菌落，接种于5mLYPD培养基(1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，2％葡萄糖)中，30℃振荡培养过夜，从中取出0.5mL培养液，接种于500mL YPD培养基中，30℃振荡培养至OD600nm光吸收值为1.4-1.5左右，4000rpm4℃下离心2分钟收集酵母细胞。将沉淀的酵母细胞重新悬浮在500mL冰浴的无菌水中，然后4000rpm4℃下离心2分钟再次收集酵母细胞。重复一次上述洗涤过程。用25mL冰浴的1mol/L山梨醇重新悬浮沉淀的酵母细胞，如上离心收集酵母细胞，再以0.5mL冰浴的1mol/L山梨醇重新悬浮沉淀的酵母细胞，从中取出80uL酵母感受态细胞，分别与上述制备的线性化质粒载体DNA(4-5ug)充分混合，然后转移到冰浴后的0.2cm无菌电击杯中。利用电击仪MicropulserTM(BioRad公司产品)将线性化的质粒DNA导入酵母感受态细胞中，所使用的电击参数为0.8kv，11.5uF。电击完成后，立即向电击杯中加入0.8mL冰浴的1mol/L山梨醇溶液，充分混匀后，将该菌液以每板200uL的体积涂布到RDB[1.34％Yeast Nitrogen Base With AmmoniumSulfate without amino acids(YNB)(Sigma公司产品)，1mol/L山梨醇，1％葡萄糖，0.00004％Biotin，0.005％谷氨酸，0.005％甲硫氨酸，0.005％赖氨酸，0.005％亮氨酸，0.005％异亮氨酸，1.5％琼脂]固体平板培养基上，平板倒置并置于30℃培养箱中培养至转化重组子出现。
用无菌牙签挑取RDB固体平板培养基上新长出的酵母单菌落(重组子)，分别点种MM(1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇，1.5％琼脂)平板和MD(1.34％YNB，0.00004％Biotin，2％葡萄糖，1.5％琼脂)固体平板培养基；30℃培养2天，在MM和MD上生长一致的，其表型为Mut+。在MD上生长正常，在MM上生长缓慢或不长的，表型为Muts。
3.高表达酵母菌株的筛选
挑取在MD平板上生长正常、但在MM平板上生长缓慢的转化子，接种于5mL BMGY[1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，1％甘油(V/V)]液体培养基中(该培养基以甘油为碳源)，30℃摇床培养2天，4000rpm离心2min，去上清；用1mL BMMY[1％酵母提取物，2％胰蛋白胨，100mmol/L磷酸钾缓冲液(pH7.0)，1.34％YNB，0.00004％Biotin，0.5％甲醇]液体培养基重新悬浮菌体(该培养基以甲醇作为外源蛋白基因表达诱导物)，30℃诱导培养4天；10000rpm 4℃下离心5min，收集合有可能含有DSPAα2重组蛋白的上清液。该上清液可直接用于纤溶活性的测定。
DSPAα2重组蛋白纤溶活性的测定采用纤维平板法，而纤维蛋白平板的制作基本参照Fish等人的方法进行[14]。称取0.75g琼脂糖于50mL PBS(8g NaCl，0.2gKH2PO4，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKCl，加蒸馏水至1L，pH7.4)中，加热熔化，待其冷确至55℃～60℃，加入21mL含50μg纤维蛋白原(Sigma公司产品)的PBS和150μL 200U/mL的凝血酶(Sigma公司产品，含纤溶酶原)溶液，混匀后迅速倒入三块灭菌平皿中，待冷却后用打孔器在纤维平板上打孔。每孔中加入100μL酵母发酵上清液，同时以标准品t-PA(购自中国药品检定所)为阳性对照。平板置于37℃培养箱，12h后观察结果。
以转pPIC9K空质粒表达载体的毕赤酵母甲醇诱导培养物作为阴性对照，结果发现，经p9KDSPAα2M质粒DNA转化所获得的一些重组酵母菌株其甲醇诱导培养上清液确实能够在纤维平板上形成透明圈，即酵母所表达DSPAα2重组蛋白能够激活纤溶酶原，可将其转变为纤溶酶并进而使纤维蛋白降解。由此可得出结论，在酵母中所表达的DSPAα2重组蛋白是具有生物活性的。
但特别值得指出的是，重组酵母菌株中若含有密码子未优化的DSPAα2基因(经p9KDSPAα2质粒DNA转化所获得的重组酵母菌株)，其甲醇诱导培养上清液在纤维平板上均不能形成透明圈(见图4)，这可能是由于DSPAα2重组蛋白表达量过低所致。上述结果表明这两种重组酵母在分泌DSPAα2重组蛋白的数量上是有显著差异的，这意味着基因密码子在经过优化和改造后确实可以极大地提高DSPAα2基因在酵母细胞中的表达效率以及分泌到胞外的生物产量(提高的倍数因含未改造基因的酵母重组子外源蛋白表达量过低，故无法测定提高的具体倍数)。单由pPIC9K质粒转化的酵母菌株其甲醇诱导培养物也不能够形成透明圈(阴性对照)。另外，有些含有密码子优化后的DSPAα2基因的重组酵母菌株也不能够形成透明圈，这可能与所导入的DSPAα2基因未能表达有关。
将能够形成透明圈的酵母重组子挑选出来，并将其命名为PP-DSPAα2M(含有密码子优化后DSPAα2基因)。
实施例4：
1.种子液的制备
从RDB固体平板上挑PP-DSPAα2M酵母单菌落，接种于10mL YPD液体培养基中，30℃振荡培养过夜，以10％的接种量转接于100mL YPD液体培养基中，30℃振荡培养24小时，再以10％的接种量转接于1L BMGY培养基中，30℃振荡培养24小时，然后将其作为种子液。
2.重组酵母在20L发酵罐中的高密度发酵
本发酵过程可以分为以下三个阶段：1)菌体培养阶段：在20L发酵罐(上海宝兴生物设备工程有限公司产品)中盛放了10L基础发酵培养基[10×BasalSalts(2.67％磷酸，0.093％硫酸钙，1.82％硫酸钾，1.49％硫酸镁，0.413％氢氧化钾)+4％甘油]，在接种前先加入28％的氨水使该培养基的pH值维持在7.5左右(氨水同时也可作为酵母菌体生长的氮源)，再按下述比例，在每升基础发酵培养基中加入4.37mL微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜，0.008％碘化钠，0.3％硫酸锰，0.02％钼酸钠，0.002％硼酸，0.05％氯化钴，2％氯化锌，6.5％硫酸亚铁，0.025％生物素，0.5％硫酸)。按10％的比例接种此前制备好的种子液，30℃通气搅拌培养24小时左右。在该阶段进行过程中，随着菌体的生长，培养基中的溶氧量将由100％逐渐降低，当培养基中的碳源消耗完后，溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体的湿重将达90-95g/L。2)饲喂碳源阶段：通过蠕动泵流加补料液，补料液为50％的甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量为18.15mL/hr/L。30℃通气搅拌培养4小时左右，在此阶段调整通气量使溶氧量始终大于20％，此时菌体湿重将达180-190g/L左右。3)诱导表达阶段：流加甲醇(含有12mL/LPTM1)，使甲醇的浓度始终维持在0.3％左右，溶氧量始终大于20％，30℃通气搅拌培养144小时，每隔24小时取数毫升发酵液经5000rpm4℃下离心10分钟，取30uL发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测，发现有肉眼可观察到的一条蛋白带，分子量约为47KD左右，与推测中的DSPAα2重组蛋白的分子量相吻合。此外，从电泳图中发现，在诱导培养96小时后，DSPAα2重组蛋白的表达量达到最高峰(见图5)。
3.重组蛋白的纯化
待一个发酵周期全部结束之后，留取500mL发酵液作为种子液(接种量为5％)直接进行下一轮的发酵过程。类似的操作累计进行3轮，在每轮发酵过程中，均对菌体的生长量和DSPAα2重组蛋白的表达量进行了测定。另外，在每轮发酵过程完全结束后，还取少许菌液涂布在YPD固体平板培养基上，并从中任意挑取10个酵母单菌落，并完全按照蔡传奇等人的方法[15]，快速提取其基因组DNA并对其进行PCR检测，结果发现，菌体的生物量，生长速度及DSPAα2重组蛋白的表达量在各轮发酵过程中基本保持稳定，另外，PCR的检测结果也证实PP-DSPAα2M具有良好的遗传稳定性(见表1)。
表1.PP-DSPAα2M菌株的遗传稳定性和外源蛋白表达稳定性的测定
在一个发酵周期结束之后，除留下500mL发酵液作为种子液外，其余的发酵液经5000rpm 4℃下离心10分钟，留取上清。在其中分别加入固体硫酸铵至饱和度达80％，在室温下搅拌1个小时，然后5000rpm在室温下离心20分钟，收集沉淀，将沉淀重新悬浮在10ml 100mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，并转移至透析袋中，然后在4℃下针对1L的100mM Tris-HCl(pH8.0)缓冲液进行透析，以除去剩余的硫酸铵，在24小时的透析时间内更换三次外透析液。在透析结束后，自透析袋中吸出被透析物，然后按照ProBondTM Purification System试剂盒(Invitrogen公司)中说明书所提供的方法逐步进行纯化。对收集到的蛋白洗脱液进行SDS-PAGE分析和凝胶成像仪检测，结果显示得到了与目的蛋白分子量一致的单一条带，其蛋白纯度可达99％以上(见图6)。再次利用纤维蛋白平板法测定其活性，与纯化前相比，比活性提高了2.3倍。
利用Lowry法(蛋白测定试剂盒购自Sigma公司，货号为P5656)测定纯化后DSPAα2重组蛋白的含量(具体方法见试剂盒说明书)，约为25mg/L(三次高密度发酵的平均值)。
参考文献
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<160>3
<210>1
<211>441
<212>PRT
<213>吸血蝙蝠(Desmodus rotundus)
<400>1
Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gln Met Ile Tyr Gln
1 5 10 15
Gln Gln Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg Val Glu
20 25 30
His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gln Cys His Thr Val Pro Val
35 40 45
Lys Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gln
50 55 60
Ala Ala Ser Phe Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Lys Gly Tyr Thr
65 70 75 80
Gly Lys Gln Cys Glu Val Asp Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gln
85 90 95
Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ser Glu Ser Gly Ala Gln
100 105 110
Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr Tyr Asn Gly
115 120 125
Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
130 135 140
Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala
145 150 155 160
Ser Lys Phe Ile Leu Glu Phe Cvs Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala
165 170 175
Thr Cys Gly Leu Arg Lys Tyr Lys Glu Pro Gln Leu His Ser Thr Gly
180 185 190
Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe
195 200 205
Ala Gln Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile
210 215 220
Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gln Glu
225 230 235 240
Arg Tyr Pro Pro Gln His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg
245 250 255
Val Lys Pro Gly Lys Glu Glu Gln Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile
260 265 270
Val His Glu Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu
275 280 285
Leu Gln Leu Lys Ser Gly Ser Pro Gln Cys Ala Gln Glu Ser Asp Ser
290 295 300
Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu Gln Leu Pro Asp Trp
305 310 315 320
Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser Ser Pro
325 330 335
Phe Tyr Ser Glu Gln Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser
340 345 350
Ser Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Asn Asn
355 360 365
Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Val
370 375 380
His Asp Ala Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn
385 390 395 400
Asp Asn His Met Thr Leu leu Gly Ile Ile Ser Trp Gly Val Gly Cys
405 410 415
Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu
420 425 430
Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro
435 440
<210>2
<211>1358
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1350)
<400>2
TAC GTA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GCT TAC GGT GTC GCT TGT AGA GAC GAG AAG ACC 57
Tyr Val His His His His His His Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr
1 5 10 15
CAA ATG ATC TAC CAA CAA CAA GAG TCC TGG TTG AGA CCA GAG GTC AGA TCC AAG AGA 114
Gln Met Ile Tyr Gln Gln Gln Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg
20 25 30 35
GTT GAG CAC TGT AGA TGT GAC AGA GGT TTG GCT CAA TGT CAC ACC GTT CCA GTC AAG 171
Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gln Cys His Thr Val Pro Val Lys
40 45 50 55
TCC TGT TCT GAG TTG AGA TGT TTC AAC GGT GGT ACT TGT TGG CAA GCT GCT TCC TTC 228
Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gln Ala Ala Ser Phe
60 65 70 75
TCC GAC TTC GTC TGT CAA TGT CCA AAG GGT TAC ACT GGT AAG CAA TGT GAA GTT GAC 285
Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gln Cys Glu Val Asp
80 85 90 95
ACC CAC GCT ACC TGT TAC AAG GAC CAA GGT GTC ACC TAC AGA GGT ACT TGG TCC ACT 342
Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gln Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr
100 105 110
TCC GAA TCC GGT GCT CAA TGT ATC AAC TGG AAC TCC AAC TTG TTG ACC AGA AGA ACC 399
Ser Glu Ser Gly Ala Gln Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr
115 120 125 130
TAC AAC GGT AGG AGA TCC GAC GCT ATC ACT TTG GGT TTG GGT AAC CAC AAC TAC TGT 456
Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
135 140 145 150
AGA AAC CCA GAC AAC AAC TCC AAG CCA TGG TGT TAC GTC ATC AAG GCT TCC AAG TTC 513
Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe
155 160 165 170
ATC TTG GAG TTC TGT TCC GTT CCA GTC TGT TCC AAG GCT ACC TGT GGT TTG AGA AAG 570
Ile Leu Glu Phe Cys Ser Val Pro Val Cys Ser Lys Ala Thr Cys Gly Leu Arg Lys
175 180 185 190
TAC AAG GAG CCA CAA TTG CAC TCT ACT GGT GGT TTG TTC ACT GAC ATC ACC TCT CAC 627
Tyr Lys Glu Pro Gln Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His
195 200 205
CCA TGG CAA GCT GCT ATC TTC GCT CAA AAC AGA AGA TCC TCC GGT GAA AGA TTC TTG 684
Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Gln Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu
210 215 220 225
TGT GGT GGT ATC TTG ATC TCT TCC TGT TGG GTC TTG ACT GCT GCT CAC TGT TTC CAA 741
Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gln
230 235 240 245
GAG AGA TAC CCA CCA CAA CAC TTG AGA GTT GTT TTG GGT AGA ACT TAC AGA GTT AAG 798
Glu Arg Tyr Pro Pro Gln His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys
250 255 260 265
CCA GGT AAG GAA GAG CAA ACT TTC GAA GTC GAA AAG TGT ATC GTC CAC GAG GAA TTC 855
Pro Gly Lys Glu Glu Gln Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe
270 275 280 285
GAC GAC GAC ACT TAC AAC AAC GAC ATT GCT TTG TTG CAA TTG AAG TCC GGT TCC CCA 912
Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Gly Ser Pro
290 295 300
CAA TGT GCT CAA GAG TCT GAC TCT GTC AGA GCT ATC TGT TTG CCA GAA GCT AAC TTG 969
Gln Cys Ala Gln Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu
305 310 315 320
CAA TTG CCA GAC TGG ACT GAA TGT GAG TTG TCT GGT TAC GGT AAG CAC AAG TCC TCT 1026
Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser
325 330 335 340
TCT CCA TTC TAC TCT GAG CAA TTG AAG GAA GGT CAC GTC AGA TTG TAC CCA TCC TCC 1083
Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gln Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser
345 350 355 360
AGA TGT ACT TCC AAG TTC TTG TTC AAC AAG ACC GTC ACT AAC AAC ATG TTG TGT GCT 1140
Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Asn Asn Met Leu Cys Ala
365 370 375 380
GGT GAC ACT AGA TCC GGT GAA ATC TAT CCA AAC GTT CAC GAC GCT TGT CAA GGT GAC 1197
Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
385 390 395
TCC GGT GGT CCA TTG GTT TGT ATG AAC GAC AAC CAC ATG ACT TTG TTG GGT ATC ATC 1254
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu leu Gly Ile Ile
400 405 410 415
TCT TGG GGT GTT GGT TGT GGT GAG AAG GAC ATC CCA GGT GTT TAC ACC AAG GTT ACT 1311
Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
420 425 430 435
AAC TAC TTG GGT TGG ATC AGA GAC AAC ATG AGA CCA TAA GCG GCC GC 1358
Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro *
440 445
<210>3
<211>1358
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1350)
<400>3
TAC GTA CAC CAC CAC CAC CAC CAC GCA TAT GGT GTG GCC TGC AGA GAT GAG AAG ACC 57
Tyr Val His His His His His His Ala Tyr Gly Val Ala Cys Arg Asp Glu Lys Thr
1 5 10 15
CAG ATG ATC TAC CAG CAA CAA GAG TCC TGG CTC CGC CCC GAG GTC AGA AGC AAG AGG 114
Gln Met Ile Tyr Gln Gln Gln Glu Ser Trp Leu Arg Pro Glu Val Arg Ser Lys Arg
20 25 30 35
GTG GAG CAC TGC AGG TGC GAT AGA GGA CTC GCC CAG TGT CAC ACC GTG CCA GTC AAG 171
Val Glu His Cys Arg Cys Asp Arg Gly Leu Ala Gln Cys His Thr Val Pro Val Lys
40 45 50 55
AGT TGC AGT GAG CTC AGG TGC TTC AAT GGG GGG ACA TGC TGG CAG GCA GCA TCT TTC 228
Ser Cys Ser Glu Leu Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Trp Gln Ala Ala Ser Phe
60 65 70 75
TCC GAT TTC GTC TGT CAG TGC CCA AAG GGA TAT ACA GGG AAG CAG TGT GAA GTG GAT 285
Ser Asp Phe Val Cys Gln Cys Pro Lys Gly Tyr Thr Gly Lys Gln Cys Glu Val Asp
80 85 90 95
ACC CAC GCC ACC TGC TAC AAG GAT CAG GGT GTC ACC TAC AGG GGC ACA TGG AGC ACA 342
Thr His Ala Thr Cys Tyr Lys Asp Gln Gly Val Thr Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr
100 105 110
TCC GAA AGT GGG GCA CAG TGT ATC AAC TGG AAC AGC AAC CTC CTG ACC AGG AGG ACC 399
Ser Glu Ser Gly Ala Gln Cys Ile Asn Trp Asn Ser Asn Leu Leu Thr Arg Arg Thr
115 120 125 130
TAC AAT GGG AGG AGG TCC GAT GCC ATC ACA CTG GGC CTC GGG AAT CAC AAT TAC TGC 456
Tyr Asn Gly Arg Arg Ser Asp Ala Ile Thr Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys
135 140 145 150
AGA AAC CCA GAT AAC AAC TCC AAG CCA TGG TGC TAT GTC ATC AAG GCA AGC AAG TTC 513
Arg Asn Pro Asp Asn Asn Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Val Ile Lys Ala Ser Lys Phe
155 160 165 170
ATC CTC GAG TTC TGT AGC GTG CCA GTC TGC TCC AAG GCC ACC TGT GGC CTG AGA AAG 570
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175 180 185 190
TAC AAG GAG CCA CAG CTC CAC AGT ACA GGA GGA CTC TTC ACA GAT ATC ACC TCT CAC 627
Tyr Lys Glu Pro Gln Leu His Ser Thr Gly Gly Leu Phe Thr Asp Ile Thr Ser His
195 200 205
CCA TGG CAG GCA GCC ATC TTC GCC CAG AAC AGA AGG TCC TCC GGA GAA AGG TTC CTC 684
Pro Trp Gln Ala Ala Ile Phe Ala Gln Asn Arg Arg Ser Ser Gly Glu Arg Phe Leu
210 215 220 225
TGT GGG GGG ATC TTG ATC AGT TCC TGC TGG GTC CTG ACT GCA GCC CAC TGC TTC CAG 741
Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe Gln
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GAG AGG TAT CCA CCC CAG CAT CTC AGG GTG GTT TTG GGC AGA ACA TAC AGG GTG AAG 798
Glu Arg Tyr Pro Pro Gln His Leu Arg Val Val Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Lys
250 255 260 265
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Pro Gly Lys Glu Glu Gln Thr Phe Glu Val Glu Lys Cys Ile Val His Glu Glu Phe
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GAT GAT GAT ACT TAC AAC AAT GAT ATT GCA CTG CTG CAG CTG AAA TCC GGC TCC CCA 912
Asp Asp Asp Thr Tyr Asn Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gln Leu Lys Ser Gly Ser Pro
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Gln Cys Ala Gln Glu Ser Asp Ser Val Arg Ala Ile Cys Leu Pro Glu Ala Asn Leu
305 310 315 320
CAG CTG CCC GAC TGG ACA GAA TGT GAG CTG TCT GGC TAC GGC AAG CAT AAG TCC TCT 1026
Gln Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Lys Ser Ser
325 330 335 340
TCT CCT TTC TAT TCT GAG CAG CTG AAG GAA GGG CAT GTC AGG CTG TAC CCC TCC AGC 1083
Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Gln Leu Lys Glu Gly His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser
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CGC TGC ACA TCC AAG TTT CTG TTT AAC AAA ACC GTC ACA AAC AAC ATG CTG TGT GCA 1140
Arg Cys Thr Ser Lys Phe Leu Phe Asn Lys Thr Val Thr Asn Asn Met Leu Cys Ala
365 370 375 380
GGA GAC ACA AGG AGC GGA GAG ATC TAT CCA AAT GTG CAC GAT GCC TGC CAG GGT GAC 1197
Gly Asp Thr Arg Ser Gly Glu Ile Tyr Pro Asn Val His Asp Ala Cys Gln Gly Asp
385 390 395
TCC GGA GGC CCC TTG GTG TGT ATG AAT GAC AAC CAC ATG ACT TTG CTC GGC ATC ATC 1254
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Met Asn Asp Asn His Met Thr Leu leu Gly Ile Ile
400 405 410 415
AGT TGG GGT GTT GGC TGT GGG GAG AAA GAC ATT CCA GGT GTG TAC ACC AAG GTT ACT 1311
Ser Trp Gly Val Gly Cys Gly Glu Lys Asp Ile Pro Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr
420 425 430 435
AAT TAC CTC GGC TGG ATT AGA GAC AAC ATG CGC CCA TAA GCG GCC GC 1358
Asn Tyr Leu Gly Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro *
440 445
机译： 吸血蝙蝠唾液中的纤溶酶原激活剂
机译： 一种在吸血蝙蝠的唾液中制备纤溶酶原激活剂的方法
机译： 吸血蝙蝠唾液的糖基化或糖基化Pla纤溶酶原激活剂的制备方法
