丹参素在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的应用

摘要

本发明提供了丹参素的药物新用途，具体地提供了丹参素在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的应用。在上述应用中，丹参素口服时使用剂量范围是100mg～2000mg；优选100～1000mg。本发明还提供了以丹参素为活性成分的药物组合物。

说明书

技术领域

本发明涉及丹参素的药物新用途，具体地涉及丹参素在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的应用。

背景技术

丹参素(化学名为β-3，4-二羟苯乳酸)是从丹参中提取获得的，为丹参的有效成分。文献报道丹参素在心脑血管疾病方面具有一定的保护作用【江文德，陈玉华，王迎平，等.丹参素及两种水溶性丹参成分抗心肌缺血和对冠状动脉的研究.上海第一医学院学报，1982，9(1)：13-94.；张力，王孝铭，梁殿权，等.丹参素对大鼠心肌缺血/再灌注致线粒体变化的影响及其作用机理的探讨.中国病理生理杂志，1990，6(6)：420-423.；常英姿，梁殿权，王孝铭，等】。本发明人通过大量的实验研究，发现了丹参素在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的应用。

发明内容：

本发明提供了丹参素在制备治疗或预防慢性肾功能衰竭的药物中的应用。

本发明提供了丹参素在制备治疗或预防肾纤维化的药物中的应用。

本发明提供了以丹参素为活性成分的用于慢性肾功能衰竭和肾纤维化的药物组合物。

本发明所述的丹参素其含量在90％以上，可以以药学常规方法制备而得，优选为：取丹参生药粉碎，加12倍量0.5％的NaOH煎煮两次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，用弱碱性大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3∶1)，用去离子水洗脱3-5柱体积，再用0.4％的NaOH洗脱2个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2-5，用弱极性或非极性大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3∶1)，用去离子水洗脱1-2个柱体积后再洗5个柱体积，收集洗脱液，浓缩，加入适量HCl调pH至酸性，结晶，即得。其中弱碱性大孔树脂、弱极性或非极性大孔树脂优选为AB-B大孔树脂。

本发明提供的药物组合物在用于慢性肾功能衰竭及肾纤维化时，口服时使用剂量范围是100mg～2000mg；优选100～1000mg。

本发明提供的药物组合物可以以片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊、糖浆、软胶囊等形式存在，优选为软胶囊及片剂。本发明提供的各种剂型均可以采用药学常规方法制备而成。

本发明人进行了下列试验来证实治疗或预防慢性肾功能衰竭及肾纤维化的药物中的应用。(下面的实施例用来更详细的说明本发明，但并不意味着本发明仅限于此)。

具体实施实例：

制备例1丹参素的制备

取丹参10kg生药粉碎，加12倍量0.5％的Na0H煎煮两次，每次1.5小时，过滤，合并滤液，用AB-8性大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3∶1)，用去离子水洗脱3-5柱体积，再用0.4％的NaOH洗脱2个柱体积，收集洗脱液，调节pH值为2-5，用AB-8大孔吸附树脂进行吸附(提取液与树脂的体积比3∶1)，用去离子水洗脱1-2个柱体积后再洗5个柱体积，收集洗脱液，浓缩，加入适量HCl调pH至酸性，结晶，得丹参素钠9.356g，纯度为91.5％。

制备例2丹参素片剂的制备

称取100.0g丹参素、170.0g糖粉、80.0g乳糖和46.0g羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加入3％PVP_K30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60℃干燥3小时，18目筛整粒，加入4.0g硬脂酸镁，混合均匀后压1000片，每片约400mg，即得。

制备例3丹参素胶囊的制备

称取50.0g丹参素、85.0g糖粉、40.0g乳糖和23.0g羧甲基淀粉钠充分混合均匀后过100目筛，加入3％PVP_K30水溶液适量制软材，20目筛制粒，60℃干燥3小时，18目筛整粒，加入2.0g硬脂酸镁，灌胶囊，每粒约200mg，即得。

试验例1丹参素对腺嘌呤导致大鼠慢性肾衰及肾纤维化的影响

1.1材料：

普通级Wistar大鼠，雄性，体重150-200g，SD大鼠，山东绿叶天然药物研究开发公司实验动物中心提供，合格号：SYXK(鲁)20030020。

丹参素：山东天然药物研究开发公司现代中药室提供，含量95％，批号：040218；腺嘌呤：常州华通化工公司，批号：040611；甲强龙，比利时法玛西亚普强公司，批号：040706；肌酐和尿素氮试剂盒：北京中生科技公司，批号：050606；

羟脯氨酸试剂盒：南京建成生物公司，批号：050906。

1.2试验方法与结果：大鼠90只，体重150-200g，动物喂养1周，将动物分为9组，即正常组，模型组、甲强龙(12mg/kg)组，丹参素灌胃小剂量(5mg/kg)组，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4，除正常组外，每只大鼠ip腺嘌呤150mg/kg，连续给予2天，停止2天，继续ip腺嘌呤150mg/kg2天，3天后，大鼠眼框取血，血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸，观察造模情况，从第8天开始给药，连续给药14天，从眼眶取血，测定血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸，处死作病理切片，观察肾功能的病理改变。

从表1看出，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组降低大鼠慢性肾衰血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸(与模型组比较，p＜0.05)；甲强龙(12mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4明显降低大鼠慢性肾衰血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸(与模型组比较，p＜0.01)。

病理检查：正常对照组肾组织结构正常，模型组有明显肾组织结晶沉淀物，肾小管破坏，萎缩，管腔变小，其中可见淋巴细胞浸润及局部纤维组织增生，肾小球肿大，肾小球上皮细胞出现空泡变性，内皮细胞下出现大量疏松物质，基底膜增厚，定量分析肾小管面积与肾小球体积，模型组与正常对照组比较有显著性差异。丹参素各组各剂量组随剂量增加损伤程度明显减轻，但仍未恢复至正常水平。

表1丹参素对大鼠慢性肾衰血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸的影响(n＝10)

    组别剂量(mg/kg)血清肌酐(mg/dL)血清尿素氮(mg/dL)羟脯氨酸(μmol/L)  正常组模型组甲强龙组丹参素灌胃小剂量组丹参素灌胃中剂量组丹参素灌胃大剂量组1丹参素灌胃大剂量组2丹参素灌胃大剂量组3丹参素灌胃大剂量组4    -----125102050100200    0.47±0.052.03±0.231.15±0.13^**1.90±0.221.80±0.18^*1.52±0.37^**1.32±0.28^**1.20±0.22^**1.19±0.39^**    10.01±2.5240.57±4.5518.21±3.25^**38.01±3.2435.91±3.60^*30.42±7.36^**26.76±4.19^**22.07±3.45^**21.85±5.88^**    12±333±725±6^**32±530±4^*27±5^**25±6^**23±5^**22±6^**

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较

试验2丹参素对肾切除导致大鼠慢性肾衰的影响

2.1材料

实验动物  普通级Wistar大鼠，雄性，体重150-200g，SD大鼠，山东绿叶天然药物研究开发公司实验动物中心提供，合格号：SYXK(鲁)20030020。

药物  丹参素，山东天然药物研究开发公司现代中药室提供，含量95％，批号：040218；甲强龙，比利时法玛西亚普强公司，批号：040706；羟脯氨酸试剂盒，南京建成生物公司，批号：050906。肌酐和尿素氮试剂盒，北京中生科技公司，批号：050606；

2.2试验方法与结果

大鼠135只，体重150-200g，动物喂养1周，将动物分为9组，即正常组，模型组、甲强龙(12mg/kg)组，丹参素灌胃小剂量(5mg/kg)组，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4，除正常组外，大鼠用5/6肾切除方法制成慢性肾衰模型，第一次手术切除左肾2/3，一周后行第二次手术切除右肾，第二次手术后一周开始给药，给药方式为灌胃给药或腹腔注射给药，给药后4周、8周分别大鼠眼框取血，测定血清肌酐和尿素氮，给药后4周处死5只，试验结束处死10只，作病理切片，观察肾功能的病理改变。

从表2、表3结果可以看出，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组降低大鼠慢性肾衰血清肌酐、尿素氮、羟脯氨酸(与模型组比较，p＜0.05)；甲强龙(12mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4明显降低大鼠慢性肾衰血清肌酐和尿素氮(与模型组比较，p＜0.01)；丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3降低大鼠慢性肾衰血清肌酐和尿素氮与丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4比较，无显著性差异。

病理改变：给药第4周模型组光镜下见肾小球有不同程度代偿性肥大，系膜细胞增生，系膜基质增多，肾小球毛细血管襻呈分叶状，部分肾小球囊腔消失，毛细血管管壁增厚，肾小管肿胀、扩张，管腔内有蛋白沉积，部分小管萎缩，间质有炎性细胞浸润，各给药组亦见上述改变，但病变程度较轻，随剂量增大，病变程度减轻；给药第8周模型组光镜下见系膜细胞增生，基质明显增多，毛细血管管壁塌陷，毛细血管节段性硬化，硬化区多在血管壁附近硬化的肾小球内可见均质圆形PAS染色深红色的沉积物，个别肾小球有局灶球囊粘连，局灶新月体形成，间质可见炎细胞浸润，纤维组织增生，各组肾小球硬化程度不等，随剂量增大，病变程度减轻。

表2丹参素对大鼠肾切除慢性肾衰给药4周血清肌酐和尿素氮的影响(n＝10)

    组别剂量(mg/kg)血清肌酐(mg/dL)血清尿素氮(mg/dL)    正常组模型组甲强龙组丹参素灌胃小剂量组丹参素灌胃中剂量组丹参素灌胃大剂量组1丹参素灌胃大剂量组2丹参素灌胃大剂量组3丹参素灌胃大剂量组4    -----125102050100200    0.49±0.051.72±0.190.83±0.13^**1.62±0.181.53±0.15^*1.29±0.31^**1.12±0.24^**1.02±0.19^**1.01±0.33^**    9.03±2.5222.54±2.5315.21±3.25^**21.12±2.4019.95±2.20^*16.90±4.09^**14.63±3.25^**13.39±2.45^**12.85±3.88^**

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较

表3丹参素对大鼠肾切除慢性肾衰给药8周血清肌酐和尿素氮的影响

    组别剂量(mg/kg)血清肌酐(mg/dL)血清尿素氮(mg/dL)    正常组模型组甲强龙组丹参素灌胃小剂量组丹参素灌胃中剂量组丹参素灌胃大剂量组1丹参素灌胃大剂量组2丹参素灌胃大剂量组3丹参素灌胃大剂量组4    ----125102050100200    0.69±0.082.35±0.261.25±0.17^**2.19±0.222.06±0.21^*1.75±0.37^**1.51±0.32^**1.39±0.26^**1.37±0.44^**    9.02±2.3228.95±3.2518.21±4.25^**27.15±3.0925.65±2.57^*21.73±5.26^**19.25±3.19^**15.07±3.45^**14.85±3.88^**

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较

试验3丹参素对单侧输尿管结扎大鼠肾间质纤维化的影响

3.1材料

实验动物  普通级Wistar大鼠，雄性，体重150-200g，SD大鼠，山东绿叶天然药物研究开发公司实验动物中心提供，合格号：SYXK(鲁)20030020。

药物  丹参素，山东天然药物研究开发公司现代中药室提供，含量95％，批号：040218；苯那普利，北京诺华制药有限公司生产，批号：040306；羟脯氨酸试剂盒，南京建成生物公司，批号：050906。

3.2试验方法与结果

大鼠90只，体重150-200g，动物喂养1周，各大鼠以10％水合氯醛3.0mL/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠右侧卧位固定于手术台上，剪毛后用碘酒、75％酒精消毒手术区，行左侧腹切口，逐层切开皮肤、肌肉及腹壁各层，暴露并分离左侧输尿管，假手术组仅切开腹腔并游离左侧输尿管，但不结扎和剪断，其他各组大鼠用4-0丝线结扎两道，上一道结扎点位于左肾下极水平，然后在两道结扎点间剪断输尿管，逐层缝合，将动物分为9组，即假手术组，模型组、苯那普利(10mg/kg)组，丹参素灌胃小剂量(5mg/kg)组，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4，术后各组开始给药，21天后10％水合氯醛麻醉后处死各组动物，生理盐水反复灌洗后留取左侧肾脏，肾组织经4％的多聚甲醛缓冲液固定。切取适量肾组织，按羟脯氨酸试剂盒测定说明测定羟脯氨酸。

从表4结果可以看出，丹参素灌胃中剂量(10mg/kg)组降低单侧输尿管结扎大鼠肾羟脯氨酸含量(与模型组比较，p＜0.05)；苯那普利(10mg/kg)组，丹参素灌胃大剂量(20mg/kg)组1，丹参素灌胃大剂量(50mg/kg)组2，丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3，丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4明显降低单侧输尿管结扎大鼠肾羟脯氨酸含量(与模型组比较，p＜0.01)；丹参素灌胃大剂量(100mg/kg)组3降低单侧输尿管结扎大鼠肾羟脯氨酸含量与丹参素灌胃大剂量(200mg/kg)组4比较，无显著性差异。

常规病理学检查①肉眼检查：假手术组肾脏颜色鲜红，表面光滑，包膜光泽，无粘连。其他各组肾脏体积增大，颜色苍白，表面呈颗粒状，类似人体大白肾，少数区域肾包膜粘连。②光镜检查：假手术组肾单位结构清晰，肾小球囊无扩张或缩小，肾小管上皮细胞无明显变性及坏死，管腔内无脱落上皮细胞或管型，间质中无血管扩张或炎细胞浸润。模型对照组大片肾小管坏死，肾间质纤维细胞增生，肾小管扩张，内有大量棕黄色折光物质或坏死脱落的上皮细胞，肾小球数目减少，部分肾小球纤维化并与包曼氏囊壁粘连，囊腔消失。给药各组病变与模型对照组类似，但均有不同程度的形态学改善，尤以丹参素灌胃大剂量各组显著，与模型对照组比较有明显差异。

表4丹参素对单侧输尿管结扎大鼠肾羟脯氨酸含量的影响

    组别  剂量(mg/kg) 羟脯氨酸(μg/g)  假手术组模型组苯那普利组丹参素灌胃小剂量组丹参素灌胃中剂量组丹参素灌胃大剂量组1丹参素灌胃大剂量组2丹参素灌胃大剂量组3丹参素灌胃大剂量组4    -----105102050100200    301±59765±158490±132701±162610±118^*572±98^**552±87^**531±94^**525±121^**

^*，p＜0.05，^**，p＜0.01，与模型组比较