重组犬α型干扰素的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组犬α型干扰素的制备方法，系将特异性引物PCR扩增犬α型干扰素的目的基因，与表达载体PET-28a进行连接，转化大肠杆菌，使其高效表达犬α型干扰素，经高度纯化后除菌、分装和冻干等工艺制成重组犬α型干扰素冻干粉针剂。本发明制备工艺简单，易于工业化生产，经冻干后易运送和保藏。产品质量可靠。重组犬α型注射犬机体后，具有疗效好、安全可靠和无毒副作用等特点。可用于治疗犬细小病毒病、病毒性腹泻等疾病，是一种广谱抗病毒制剂。

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组犬α型干扰素，是一种治疗犬病毒性腹泻、流行性感冒等病毒性疾病的重组犬α型干扰素的制备方法。

背景技术

犬病毒性疾病是当前严重制约犬养殖业健康发展的主要传染病。全年均有发生，如犬细小病毒病、急性病毒性胃肠炎等。这些动物一旦感染发病，则有起病急，临床症状严重，极易传播扩散，以及病死率和死亡率均较高的特点，给养殖业造成巨大经济损失；更为重要的是，宠物犬与人类密切接触，某些人畜共患病还给人类健康带来潜在威胁。但传统的治疗方案临床上有时难以奏效，尤其针对病毒病办法不多，有可能引起人类新发传染病。人类普遍缺乏对新发传染病的免疫力，且对新发传染病的早期发现及诊断均较为困难，最为重要的是缺乏特异性的预防和治疗方法。同时，新发传染病的发生、发现具有很大的不确定性。因此，积极预防和治疗犬病毒病一直是人类最为关注的问题。干扰素(interferon，IFN)是一类具有广谱抗病毒、抗肿瘤和具有免疫调节作用的蛋白质。现已知，α型干扰素在机体内发挥广谱、高效抗病毒作用机制是抑制病毒蛋白质的合成，并有选择性地作用于受感染细胞，而对正常宿主细胞无作用或作用微弱。

现有资料表明：目前国内外生产犬白细胞干扰素的技术工艺条件要求较高，形成产品时成本高且价格较贵，不适合我国国情。因此很难得到广泛的应用。而采用基因工程技术生产重组犬α型干扰素尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组犬α型干扰素的制备方法，是将犬α型干扰素基因重组质粒转化大肠杆菌，使其高效表达犬α型干扰素，经高度纯化后除菌、分装和冻干等工艺制成，是一种广谱抗病毒制剂，主治犬病毒性腹泻、细小病毒病、呼吸道感染等疾病。

本发明技术方案如下：

重组犬α型干扰素的制备方法，是依次进行以下步骤：

(1)、构建克隆载体：

目的基因为：atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgc tcagctgcca ctccctgtgctgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggt cctgacgctc ctgggacagatgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgcc ttccccaagg aactgtttgatggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc cacgtgatga cccagaaggt cttccacctcttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg aacatgaccc tcctggggga attgtgctcg gggctctctgagcagctgga tgacctggat gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggcc gagacccccc tcatgcatgaagactccacc ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaag acaggaacca cagcccgtgtgcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgac catcttgcaa gaaagagtaaggaggaggaa atga

特异性引物：上游：AAT TTG CCA CCT GCC CGA CA

            下游：GAT CTT TCC TCC TCC TGA TTC TTT C

克隆载体：pMD18-T simple vector

(2)、构建表达载体：

表达载体：PET-28a

(3)、重组蛋白的表达：

挑取载体构建成功的重组表达菌进行扩增、放大培养，并加入诱导剂诱导表达；

(4)、鉴定重组蛋白；

(5)、纯化重组蛋白，得到粗制品干扰素。

所述的方法，其特征在于：

(1)、构建克隆载体：用特异性引物PCR扩增犬α型干扰素的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector，转化JM109大肠杆菌，涂LB平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定；根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序；

(2)、构建表达载体：选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与表达载体PET-28a进行连接，并转化至B1-21(DH-5α)大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB平板培养过夜；取卡那霉素LB平板生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功；

(3)、重组蛋白的表达：挑取载体构建成功的重组表达菌于含卡那霉素的LB培养基中少量扩增后，置含卡那霉素的LB培养基中放大培养，加入异丙基硫代半乳糖苷IPTG诱导表达。

所述的方法，其特征在于：

鉴定重组蛋白：将目的基因的重组质粒PET/IFN转化大肠杆菌BL21(DH-5α)，经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示，与空菌相比，在33KD左右有一条浓染的新增蛋白条带；经Western blotting鉴定，能与抗α型IFN参考血清发生强阳性反应。

所述的方法，其特征在于所述的LB培养基中含卡那霉素100μg/ml，重组表达菌大量扩增培养3h后，至细菌到达对数生长期，细菌在550-600nm OD值为0.3左右，方加入诱导剂IPTG，IPTG终浓度200μg/ml。

所述的方法，其特征在于纯化重组蛋白是指用超声破碎重组蛋白后，用强变性剂溶解包涵体，用复性液复性重组蛋白过夜，得到可溶性重组蛋白，AKTA^TM explorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白或盐析法粗纯蛋白质、硫氰酸钾法精纯蛋白。

纯化重组蛋白的具体步骤为：

(1)、收集菌液，4℃12000r/min离心5min，弃上清，留沉淀，-20℃与室温反复冻融沉淀3次后将沉淀混匀在9倍体积PBS液中，4℃孵育5min，得到重组蛋白；超声裂解重组蛋白，功率：400W，工作2S，间隔2S，重复7-8次，可作革兰染色观察细菌裂解情况，12000r/min离心10min，获得沉淀；

(2)、加入变性缓冲液9ml，4℃作用2-3h，加入复性缓冲液9ml，4℃作用4h，4℃条件下，用PBS透析2天，期间不断换透析液，以除去变性剂。

本发明制备的重组犬α型干扰素，经分离纯化后，制成冻干粉针剂，加2ml无菌双蒸水后，能迅速溶解为均匀悬浊液，规格为：干扰素含量≥2万单位/瓶，2～8℃可长期保存，室温(≤25℃)可保存一年半。使用时要轻轻摇匀后方可进行肌肉注射，幼禽、畜5000～10000单位/只/天；成年禽、畜20000～40000单位/只/天，每日注射一次，一个疗程3～5次。

本发明系采用先进的基因工程技术制备犬α型干扰素，降低了干扰素生产的成本以及犬白细胞生产用血液来源及污染等问题，经过严格田间试验和区域试验证实，无可见不良反应。重组犬α型干扰素注入动物机体后，可有效治疗犬病毒性腹泻、细小病毒病等病毒性疾病，具有疗效好，安全可靠，无毒副作用和不污染环境等特点。

在治疗已发病犬的同时，应及时隔离未发病犬，并给予等量相应药物预防注射，使用本发明制备的重组犬α型干扰素时，应注意环境的消毒等综合预防措施，防治再感染或疫病的复发。

具体实施方式：

重组犬α型干扰素制备工艺：

1、构建克隆载体：

犬α型IFN的目的基因为： atggccctgc cctgctcctt ctcggtggcc ctggtgctgctcagctgcca ctccctgtgc tgtctggctt gcgacctgcc cgacacccac agcctgcgca actggagggtcctgacgctc ctgggacaga tgaggagact ctccgccagc tcttgtgacc actacaccac tgactttgccttccccaagg aactgtttga tggccagcgg ctccaggagg cgcaagccct ctctgtggtc cacgtgatgacccagaaggt cttccacctc ttctgcacga acatgtcctc tgctccttgg aacatgaccc tcctgggggaattgtgctcg gggctctctg agcagctgga tgacctggat gcctgtcccc tgcaggaggc agggctggccgagacccccc tcatgcatga agactccacc ctgaggacct acttccaaag gatctccctc tacctgcaagacaggaacca cagcccgtgt gcctgggaga tggtccgagc agaaatcggg agatccttct tctccttgaccatcttgcaa gaaagagtaa ggaggaggaa atga

特异性引物：上游：AAT TTG CCA CCT GCC CGA CA

            下游：GAT CTT TCC TCC TCC TGA TTC TTT C

用特异性引物PCR扩增犬α型干扰素的目的基因后，将目的基因克隆于pMD18-Tsimple vector至并转化JM109大肠杆菌涂LB培养基平板进行蓝白斑筛选，取白色样的克隆菌进行目的基因PCR验证，同时进行双酶切鉴定。根据实验结果，将PCR和双酶切均阳性质粒进行目的基因测序。

2、构建表达载体：

选择目的基因经测序后与Genebank一致的克隆载体进行双酶切后与表达载体PET-28a进行连接，并转化至B1-21(DH-5α)大肠杆菌，涂布于含卡那霉素的LB培养基平板培养过夜。取卡那霉素LB平板生长的菌落经PCR鉴定目的基因，阳性克隆菌质粒行双酶切鉴定，鉴定为阳性者表示表达载体构建成功。

3、重组蛋白的表达：

挑取重组表达菌于LB培养基(含卡那霉素100μg/ml)中少量扩增，LB培养基(含卡那霉素100μg/ml)中放大培养或发酵3h后，加入IPTG诱导表达(终浓度200μg/ml)7h，收集细菌。

4、将收集的细菌12000r/min离心1-5min，留沉淀。

5、重组蛋白进行鉴定经IPTG诱导后，菌体蛋白经SDS-PAGE蛋白电泳及考马斯亮蓝染色显示。与空菌相比，在33KD左右有一条浓染的新增蛋白条带。经Western blotting鉴定，能与抗α型IFN参考血清发生强阳性反应。

6、粗制品干扰素的制备

1)、-20℃与室温反复冻融沉淀3次，4℃超声裂解细菌沉淀，功率：400W，工作2S，间隔2S，重复4-8次(可作革兰染色观察细菌裂解情况)，离心12000r/min，获得沉淀。

2)、每克沉淀加入变性缓冲液(8mol/ml尿素、)，4℃作用2-3h。

3)、每毫升尿素-蛋白溶解液加入复性缓冲液(含2mol/ml还原性谷光甘肽和0.2mol/ml氧化性谷光甘肽)9ml，4℃作用过夜。

4)、4℃条件下，用PBS透析2天，期间不断换透析液，以除去变性剂等。

将检验合格的粗制品干扰素在4℃离心，2000～3000r/min离心30min，取上清液用蔡氏滤器加压过滤，收集无菌滤液，取样进行无菌检验、效价滴定和安全检验。经检测合格后，加入终浓度含5％脱脂奶粉、5％GS(葡萄糖)和10％犬血清(或血浆)作为冻干保护剂混匀后，置于冻干机冻干。

粗制品干扰素可依下列步骤精纯：

1、AKTATM explorer蛋白纯化仪亲和层析精纯蛋白，按常规操作。

2、盐析法粗纯蛋白质操作步骤

(1)在粗制干扰素中加1/10倍体积量4℃预冷的5M硫氰酸钾(KCNS)(1/10倍体积量释义：硫氰酸钾体积量为粗制干扰素的10倍，本申请中类似表述均同此解释)，慢加搅拌，加完后，用4℃预冷2N HCl调pH至3.5，慢加约3ml/min，4℃静置8-12h，

(2)4℃条件下，2000r/min离心20min，弃去上清液，取沉淀；

(3)沉淀中加1/15倍体积量的-20℃预冷95％酒精；先加少量酒精，组织匀浆器快档研磨3min，再加至足量酒精，用2N HCl调至pH4.0，

(4)4℃下2500r/min离心20min，弃沉淀；

(5)上清液用1N NaoH调至pH5.0-5.5，

(6)4℃下2000r/min离心20min，弃沉淀；

(7)上清液用0.1N NaoH调至pH5.6-6.0；

(8)4℃下2000r/min离心20min，弃沉淀；

(9)上清液用1N NaoH调至pH8.0，

(10)4℃下2000r/min离心20min，弃上清液；

(11)沉淀物中加入原1/10-1/15倍体积量pH8.0的0.1M PB(含0.5M KCNS)溶液；

(12)4℃搅拌过夜，使之充分溶解；

(13)4℃下2000r/min离心20min，弃沉淀；

(14)上清液用2N HCl调至pH3.0；

(15)4℃下2000rpm离心20min，弃上清液；

(16)沉淀物中加入1/100倍体积量pH8.0的0.1M PB溶液溶解，然后用pH7.6 PB溶液透析，除去CNS^-；

(17)用HNO₃、0.1N AgNO₃检测CNS^-，直至透析除尽为止；

(18)3万r/min离心1h，弃沉淀；

(19)测定干扰素效价及比活性，比活性≥1×10⁵国际单位/mg蛋白为合格；

(20)无菌分装，-70℃保存。

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