用重离子束辐照效应获得的喹羟酮

摘要

本发明为用重离子束辐照效应获得的喹羟酮，涉及重离子束辐照技术，通过化学合成的办法研制新药，研制周期长，费用高，耗用人力多，利用重离子束辐照药品可以很快得到分子结构重组的新物质，对分离出的药效明显的单体作为先导化合物，再进行有针对性的化学合成，是一种快捷有针对性的研制新药的新途径，本发明用16O8+、12C6+重离子对喹烯酮进行辐照，初始能量为75MeV/μ，能量沉积分别为1.585×102Gy－1.585×1012Gy，1.656×101Gy－1.656×109Gy，得到辐照产物喹羟酮，具有抗菌活性增强，毒性降低的药效；本发明找到了一种快捷有效的研制新药的新途径的有益效果。

说明书

技术领域

本发明涉及辐照技术领域，尤其是重离子束辐照技术。

背景技术

自1965年黎巴嫩贝鲁特(Beirut)的Haddalin和Issidorides发表Beirut反应第一篇文章以来，已有上百种应用该反应合成的专利问世和合成不下一千种新的N，N-二氮杂奈-1，4二氧化物(喹喔啉)类化合物。事实上，根据Beirut反应合成的多种喹喔啉化合物的取代衍生物如：痢立清(Catbadox)、喹乙醇(Quinocetone)、乙酰甲喹等作为抗菌及促生长剂应用于畜牧兽医及养殖业中，已取得了巨大的经济与社会效益。但此类化合物存在较大的毒副作用，单纯地改变其侧链已不能满足需要，因为结果往往是毒性降低，其效果也大大下降。

通过辐照效应改进药物的性能是一种有效而先进的办法。在国内，利用离子束来进行药物品质改良方面，主要是对微生物的辐照诱变育种，因为国内用来做这方面工作的离子束能量都很低，不可能辐照很厚的样品。而我们拟采用的是兰州重离子研究装置(HIRFL)提供的中能重离子束，它可以辐照较厚的固体药物样品，类似的工作在国内外还未见报道。但在国外已有常规辐射(如X-、γ-射线)对有机化合物进行分子结构改造的研究，然而常规辐射的LET(即单位路程上转移的能量)要比重离子小得多，而且这种辐射粒子不可能参与置换或加成反应，它使分子结构改变的效率较低。所以利用重离子束进行这项研究具有独特优势。

荷能重离子对物质的作用，按其能量的高低可有以下基本过程：在能量较高、受体线度相对较小情况下，表现为荷能离子的贯穿，这时主要是能量转移，也可能有电荷交换，它们会产生能量效应或能量与电荷的二重效应；在能量较低、受体线度相对较大情况下，表现为荷能离子的注入，这时便会产生能量转移、电荷交换以及质量沉积三重效应。利用上述过程，在先导药物分子接受了离子能量后，便会造成分子链的断裂和键的破坏，当它们修复时，就会发生重组，也可能与停留在周围的离子发生作用，通过置换或加成(例如，加氧、抽氢、环的扩大或缩小等)反应，构成与原来分子结构与组成不相同的新分子或多个单体。这种新分子或单体可能具有更好的药效(例如，抗菌活性增强，毒性降低等)。这样，就可以用分离出的药效明显的单体作为标样来进行化学合成，通过药理学、毒理学和临床试验，从而找到一种快捷有效的研制新药的新途径。

发明内容

本发明的目的为提供一种抗菌活性强，毒性较低的用重离子束辐照效应获得的喹羟酮。

实现上述目的的技术方案如下：

将喹烯酮置于重离子加速器中进行辐照，重离子源为¹⁶O⁸⁺，初始能为75MeV/μ，能量沉积为1.585×10²Gy-1.585×10¹²Gy，或重离子源为¹²C⁶⁺，初始能量为75MeV/μ，能量沉积为1.656×10¹-1.656×10⁶Gy，对辐照产物进行薄层层析，主要辐照产物的结构式为：

的喹羟酮。

E-2-Methyl-3-2′-Hydro-Phenylethylecetone Quinoxaline-1，4-dioxde

E-2-甲基-3-2′-羟基苯乙烯甲酰基-喹噁啉-1，4-二氧化物

前期准备：

产物预测

如果选取能量为75MeV/u束流强度为10nA的¹⁶O⁸⁺离子辐照喹烯酮分子，对生成的产物可以简单进行预测。如果喹烯酮是固态样品，则可能会有以下过程：

Q*是喹烯酮被激发的中间过渡产物，它会进一步分解形成喹烯酮分解产物；也可能分子间产生交联形成喹烯酮二聚体或多聚体产物；这些中间过渡态物质也可能与入射的氧离子反应，氧离子可能会置换喹烯酮的某一原子或与喹烯酮中的某一原子形成氧原子结合产物。

束流时间的计算

束流时间的计算可以通过对产物的预测来估计，也可以通过计算得到所需的束流时间。要使药物的分子结构发生变化，就必须使分子中的化学键得到一定的能量，当靶分子吸收的能量小于0.01eV时一般不发生变化，当靶分子吸收的能量在0.1-10eV之间时，就会有自由基产生，由于自由基之间的复合、氧化、还原等反应就会使分子结构发生变化，当靶分子吸收的能量大于10eV时分子就会分解，这是由于分子中原子间的化学键能平均在10eV左右，假设所有入射粒子都沉积在样品中，并没有能量损失，那么重离子照射样品使分子中的化学键都断裂所需要束流时间按下式计算：

s(S)＝m×N×g×10(eV)/e×p(eV)

其中m为样品的摩尔数，N为阿佛加德罗常数，g为生物分子中化学键的个数，e是每个离子的能量，p是每秒注入样品中粒子个数，s是所需的束流时间。

脉冲数与离子数的换算

在实验中对束流的探测是由一个位于束流管道出口处的平行板自由空气电离室完成的。因此，实验记录的是由此探测系统计录的脉冲数，空气电离室的极板间距离(d)为3mm，在电离室内产生一个离子对需要的能量约为35eV，这时电离室平行板上就会累积1.6×10^-19库仑的电量，如果记录仪的记录档位处在10^-10(库仑)一档，当平行板上的电量累积到10^-10库仑时会记录一个脉冲。如果知道入射离子经过电离室时的LET(传能线密度)，就可以计算出该离子在电离室内沉积的能量，就可以计算出产生的脉冲数，反过来如果知道了脉冲数也可以计算出经过电离室的离子数，计算公式如下：

脉冲数×10^-10/1.6×10^-19＝N×LET×d/35

N＝脉冲数×10^-10×35/LET×d×1.6×10^-19

N是经过电离室的离子数

试验情况：

重离子¹²C⁶⁺，¹⁶O⁸⁺对喹烯酮的作用

表1是用重离子¹²C⁶⁺1.656×10⁴Gy与¹⁶O⁸⁺1.585×10⁷Gy对喹烯酮辐照后，喹烯酮含量下降。对照品含量为99.6％，而¹²C⁶⁺、¹⁶O⁸⁺辐照后其含量分别为83.78％、82.49％。

表1辐照剂量和喹烯酮的含量

    重离子    辐照剂量/Gy    鉴别    S382nm：I382  含量％    ¹²C^6+    16O⁸⁺    1.656×10⁴    1.585×10⁷    0.8412    0.8277  83.78  82.49

S：喹烯酮样品；I：辐照后的喹烯酮

重离子辐照后引起化学成分及抗菌活性的变化

喹烯酮辐照前后的外观变化

表2给出了相同质量喹烯酮溶解在相同体积的二甲基亚砜(DMSO)中，重离子辐照前后外观的差别。

表2喹烯酮重离子辐照后在DMSO中的外观

样品    外观喹烯酮经¹²C⁶⁺辐照的喹烯硐经¹⁶O⁸⁺辐照的喹烯硐    清澈    有沉淀物    有浆状物

喹烯酮液的紫外吸收光谱

精确称喹烯酮0.1g，置500ml棕色瓶中，加入60ml二甲替甲酰胺，摇匀，再加50ml(0.1mol/l)盐酸，振摇，完全溶解后，用水稀释至刻度，摇匀；精确量取5ml，置100ml棕色瓶中，用甲醇稀释至刻度，在382±1nm的波长处测定吸收度，同时对照样品按同法操作，根据对照样品与供试品吸收度的比值，计算，即得喹烯酮的含量。

A₃₈₃，辐照后的喹烯酮在266nm、382nm处的吸收度降低。喹烯酮对照品吸收度A₃₈₂＝0.37181，而重离子辐照后¹²C⁶⁺A₃₈₂＝0.31150、¹⁶O⁸⁺A₃₈₂＝0.30671，即其含量降低。

重离子辐照喹烯酮TLC分析

选用10×20×0.3cm玻璃板，用蒸馏水冲洗干净，凉干待用。称约8g GF₂₅₄硅胶，加2-2.5倍重的蒸馏水，顺时针搅成糊状，制成约3-5mm厚，在110℃活化，放干燥器中2h后使用。

¹²C⁶⁺重离子辐照喹烯酮有五种成分，B为喹羟酮，A、C、D、E为辐照后产生的新化合物；¹⁶O⁸⁺辐照喹烯酮有四种成分：B为喹羟酮，A’、C’、D’为新化合物。展开剂系统为：乙酸乙酯∶丙酮∶乙醇∶水＝50∶40∶10∶5或50∶40∶10∶10分离结果理想。

喹烯酮的抑菌实验

体外抑菌实验，表3是重离子辐照喹烯酮前后抑菌作用的变化，特别是对大肠杆菌最小抑菌浓度(MIC)减小，而抑菌圈增大明显。

表3喹烯酮在重离子辐照前后的最小抑菌浓度μg/ml

菌种    喹烯酮    喹烯酮    ¹²C⁶⁺辐照    ¹⁶O⁸⁺辐照大肠埃希变形杆菌绿脓杆菌克雷伯氏菌    62.5    312.5    1250    31.25    9.75    78.1    312.5    19.5    4.88    39.0    15.6    9.75

体内抗菌实验健康对照组：不感染，不给药，与实验组在同一条件下饲养，观察结果全部健活。感染组：用大肠杆菌进行腹腔感染但不给药，一般于24h内即明显发病，腹泻沉郁，三天内全部死亡。给药组：¹²C⁶⁺辐照喹烯酮，存活18只，精神正常。¹⁶O⁸⁺辐照喹烯酮，全部存活，精神正常。药物对照组：与以上相同剂量喹烯酮，存活15只，精神正常。卡方检验：以碳、氧离子辐照喹烯酮的体外对大肠杆菌的抑菌圈直径与喹烯酮不同为依据，求得小鼠以碳、氧离子辐照喹烯酮保护后的  理论存活数，与实验小鼠的存活数比较，计算X²＝0.47远小于X²_0.05＝6.63，差异不显著，即体外抑菌与体内抗菌结果一致。

通过抑菌试验，初步认为¹⁶O⁸⁺辐照喹烯酮后的物质比喹烯酮有更高的生物活生。¹⁶O⁸⁺辐照喹烯酮有A、B、C、D四种成分，B为喹烯酮，A、C、D为新化合物。通过IR发现在特征区3400左右出现明显的峰，MS离子碎片有m/z＝18(H₂O)初步证明该辐照产物中有含-OH的物质。分离纯化A’、C’、D’三个点进行结构鉴定，a’为喹羟酮，C’和D’分别为喹烯酮的二聚物和多聚物。

重离子辐照喹烯酮后“A’”成分的谱学的物质鉴定：

1、红外光谱(IR)：仪器采用Nicolet NEXUS 670 FT-IR仪器，IR(KBr)cm^-1：3500-2850，3084，1661，1566，1447，1329，1260，1091；

2、质谱(NS)：仪器型号：HP-5998，EI-MS显示有[M]⁺322；

3、核磁共振(NMR)：仪器采用INOVA-400MHz超导核磁共振仪，¹HNMR(DMSO-d₆)δppm：10.88(0H)，8.5(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，8.42(1H，d，J＝8.4Hz，H-8)，7.97(2H，m，H-6，H-7)，7.84(1H，d，J＝16.4Hz，H-13)，7.56(1H，d，J＝7.6Hz，H-19)，7.33(1H，d，J＝16.4Hz，H-12)，7.28(1H，t，J＝7.2Hz，H-17)，6.92(1H，d，J＝8.0Hz，H-16)，6.83(1H，t，J＝7.2，Hz，H-18)，2.36(3H，s，3-CH₃)；

¹³CNMR(DMSO-D₆)δppm：187.3，160.0，144.6，139.0，138.9，137.6，136.6，133.1，132.5，131.5，130.9，125.3，120.6，119.7，119.5，116.5，14.0；

根据EI-MS数据，结合核磁共振(NMR)谱数据可确定该化合物分子式为C₁₈H₁₄N₂O₄分子量为322；IR中1661峰以及¹³CMR中δ181.3表明分子中存在羰基官能团，δH7.84(1H，d，J＝16.4Hz，H-13)，δH7.33(1H，d，J＝16.4Hz，H-12)的化学位移以及偶合常数表明分子中C-12，13的双键为反式构型；根据HMQC归属碳上的质子信号，根据HMBC归属碳氢远程相关，COSY显示5、8上的质子与6、7位的质子有远程偶合关系，12位和13位上的质子有远程偶俣关系，17位和16，18位上的质子有远程偶合关系；18位和17、19位上的质子有远程偶合关系；

以上数据及分析结果可确定该化合物为喹羟酮。

表4：化合的¹HNMR(400MHz)和¹³CNMR(100MHz)数据及gHMBC相互关系(δ，ppm，TMS，CDCL-d₆)

  NO  δH    δc   DEPT    gHMBC correlations  2  3  5  6  7  8  9  10  11  12  13  14  8.5(1H，d，J＝8.4Hz)  7.97(H，m，H-6)  7.97(H，m，H-7)  8.42(1H，d，J＝8.4Hz)  7.33(1H，d，J＝16.4Hz，)  7.84(1H，d，J＝16.4Hz)    139.0    138.9    119.7    131.5    132.5    119.7    137.6    136.6    187.2    125.3    144.6    120.6    C    C    CH    CH    CH    CH    C    C    C    CH    CH    C    H-12，H-CH₃    H-CH₃    H-6，H-7    H-8    H-5    H-6，H-7    H-5，H-7    H-6，H-8    H-12，H-13    H-19    H-12，H-16，H-18

    15    16    17    18    19    CH₃  6.92(1H，d，J＝8.0Hz)  7.28(1H，t，J＝7.2Hz)  6.83(1H，t，J＝7.2Hz)  7.56(1H，d，J＝7.6Hz)  2.36(3H，s，3-CH₃)    158.0    116.5    133.1    119.5    130.9    14.0    C    CH    CH    CH    CH    CH₃    H-13，H-17，H-19    H-18    H-19    H-16(H-17)    H-13，H-17    C-2，C-3

根据以上测试得出该化合物的分子结构为，

E-2-Methyl-3-2′-Hydro-Phenylethylecetone Quinoxaline-1，4-dioxde

E-2-甲基-3-2′-羟基苯乙烯甲酰基-喹噁啉-1，4-二氧化物

此种物质我们定名为：喹羟酮

重离子辐照喹烯酮后“A’”成分的结构：

E-2-Methyl-3-2′-Hydro-Phenylethylecetone Quinoxaline-1，4-dioxde

E-2-甲基-3-2′-羟基苯乙烯甲酰基-喹噁啉-1，4-二氧化物

通过四大光谱分析确定A’的结构为：

E-2-甲基-3-2’-羟基苯乙烯甲酰基喹喔啉-1，4-二氧化物

本发明借助HIRFL提供的重离子束对喹烯酮进行结构改造，氧离子(初始能：75MeV/μ¹⁶O⁸⁺，能量沉积；1.585×10⁷Gy)注入能量大于其每个化学键的最低结合能(约10eV/键)，结构发生了变化，获得了喹羟酮。

喹羟酮的促生长作用研究：

本试验研究喹羟酮对肉鸡生产性能、蛋白代谢的影响；

1、材料及方法

1.1材料

喹烯酮与喹羟酮，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所研制，纯度99％；喹乙醇，由山西芮城兽药厂生产，纯度大于98％；安卡红羽肉鸡，购于甘肃省种鸡场；试剂盒均由南京建成生化公司提供。紫外分光光度仪，HP2040A。

1.2添加不同的喹噁啉类添加剂对肉鸡生产性能、蛋白代谢的影响。

1.2试验设计

采用随机分组设计，各组基础日粮相同，选用1日龄健康安卡红羽肉鸡320只，平均体重为40.07±1.94g。随机分为4组，每组4个重复，每重复20只，公母各半，各组初始体重差异不显著，4组分别为，I：空白对照II：喹乙醇，III：喹羟酮，IV：喹烯酮。

1.3试验饲粮

实验期为42天，分为0-3周龄和4-6周龄2期。试验饲粮根据《安卡红羽肉鸡饲养管理手册》推荐配制各阶段基础饲粮配方。除豆粕、玉米，鱼干粉、麸皮的粗蛋白、钙和磷含量为实测值外，其它饲料组分的成分及能量价值均查自中国饲料成分及营养价值表。

2、试验结果

1不同水平的喹羟酮对肉鸡生产性能的影响

在本试验中，添加喹羟酮的试鸡的平均日增重、采食量和饲料转化率都高于对照组，且50mg/kg和75mg/kg剂量组与对照组差异显著(P＜0.05)。由本试验可以看到，喹羟酮50mg/kg和75mg/kg的可提高日增重、采食量和饲料转化率，与其他喹噁啉添加剂相比，毒性小，无致畸、致癌、致突变性和光毒性。但随着添加剂量增大，各项指标有所下降。添加喹羟酮仍然要注意剂量问题，适宜的添加量，一方面可最大限度发挥畜禽的生长能力，另一方面也可以降低动物性食品的药物残留问题。

2不同水平的喹羟酮对氮的影响

添加喹羟酮后，50mg/kg和75mg/kg组粗蛋白日食入量和表观利用率都显著高于对照组和100mg/kg组(P＜0.05)；添加组的日排泄蛋白则显著低于对照组(P＜0.05)。因为喹羟酮可以改变肠道微生物种类，抑制有害菌产生的毒物刺激肠道，减少肠壁细胞更新，使肠壁变薄，有利于对营养物质(特别是蛋白质)吸收利用。

3不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡血浆白蛋白和总蛋白的影响

在本试验中添加不同浓度喹羟酮后，添加组和未添加组差异不显著(P＞0.05)，喹羟酮50mg/kg组血浆总蛋白和白蛋白含量相对最高，为提高机体蛋白合成提供有利的内环境，从而增强蛋白利用率。本试验也充分说明，喹羟酮毒性小，对肝脏分泌蛋白功能没有负面影响。

4不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡小肠的影响

添加不同水平喹羟酮后，50mg/kg和75mg/kg组的小肠重量和小肠重/体重的值比对照组显著低(P＜0.05)，而小肠的长度各组之间差异不显著，本试验添加抗生素喹羟酮后，降低小肠重量，主要是因为喹羟酮抑制肠道有害微生物产生的有毒物质对肠壁的刺激，减少肠壁细胞更新，且肠壁纤毛排列更有规律且更加纤细，肠壁固有层更薄，有助于减少维持需要的营养物质和能量，使更多的营养物质用于试鸡的生长发育。

5不同浓度梯度喹羟酮对肉鸡肌肉中RNA和DNA的影响

添加不同浓度喹羟酮后，肉鸡肌肉中RNA的浓度都明显高于对照组(P＜0.05)；而DNA浓度各组之间差异不显著(P＞0.05)；添加喹羟酮的试鸡肌肉中RNA/DNA的值显著高于对照组(P＞0.05)，而添加喹羟酮的各组之间差异不显著(P＜0.05)。因此认为，喹羟酮可以影响代谢，增加肌肉中的RNA浓度和RNA/DNA值，从而导致蛋白质、细胞的形成和组成增多，促进肌肉蛋白合成增强，进而达到增加动物体重，促进生产。

不同浓度喹羟酮实验证明，添加50mg/kg和75mg/kg喹羟酮主要有以下几个作用：

1、饲养试验表明，提高日增重、增加采食量，提高饲料转化率；

2、消化代谢试验表明，喹羟酮可提高饲料氮的利用率，增加氮沉积；

3、通过分析肌肉中RNA和DNA的浓度表明，喹羟酮促进肌细胞的肥大性增生，增强肌肉的生物蛋白合成能力。

4、对小肠分析试验表明，喹羟酮可改善小肠组织结构，使肠壁变薄，增强对营养物质的吸收利用。

在试验过程中，50mg/kg的添加效果最为明显，而高剂量喹羟酮对试鸡的生产性能影响并不显著，因此在实践中适宜的添加量可保证畜禽最大限度发挥生产性能，同时也可降低生产成本，得到最高的经济效益，是理想的促生长饲料添加剂。

喹烯酮、喹羟酮的抑菌试验

试管法(单位μ/ml)：

  菌种  200  100  50  25  12.5  6.25  3.12  1.56  O    M  O    M  O    M  O    M  O    M  O    M  O    M  O    M  沙门氏杆菌  +    -  +    -  +    -  +    -  +    +  肠炎杆菌  -    -  -    -  -    -  -    -  +    -  +    +  绿脓杆菌  +    -  +    -  +    +  猪大肠杆菌  -    -  -    -  -    -  -    -  -   -  +    -  +    +  鸡大肠杆菌  +    -  +    -  +    -  +    +  巴氏杆菌  -    -  -    -  -    -  +    -  +   -  +    +

注：O为喹烯酮，M为喹羟酮；“-”抑菌，“+”长菌杯碟法(单位mm)

  菌种   沙门氏   杆菌    肠炎    杆菌    绿脓    杆菌    猪大肠    杆菌    鸡大肠    杆菌    巴氏    杆菌  MIC  O    25    12.5    50  M    25    12.5    100    6.25    50    12.5  抑菌圈D    16.5    14.3  杯碟法    15.2    18.1    12.1    16.3    15.7

本发明的有益效果：

1、本工作应用重离子¹²C⁶⁺，¹⁶O⁸⁺对喹烯酮结构进行改造，获得至少四种辐照产物，并对辐照后的喹烯酮进行紫外、薄层层析(TLC)的分析及抗菌活性的研究，将分离后的二种单体进行红外、核磁、质谱并初步确定了结构。结果表明，重离子辐照后的喹烯酮产生的喹羟酮抗菌作用明显提高。

2、尽管目前寻找新药有许多途径，但前期都需用较长时间做大量实验，一般开发一类新药至少要10年左右，如能有新的简单、快捷方法，将会加速开发新药的步伐，缩短研制周期，大大降低研究费用，重离子在这方面有所作为，虽然刚刚起步，但它对药物结构改造和拓宽筛选途径，已显示出了巨大潜力，对医药事业的发展将会起到积极的推动作用。

3、目前，国内尚无新化学饲料添加药出现，喹羟酮的出现标志着我国新化学饲料添加剂研制工作已经起步，不仅可以增加一个自己创制的饲料添加剂新品种，而且由于该药具有低毒适于禽用，特别是幼禽使用的特点，对提高畜禽生产水平、减少疾病、发展饲料条件工业有一定推动作用。

具体实施方式：

现通过以下实施例对本发明的技术方案作进一步说明：

  序号    重离子种类    初始能Mev/μ    能量沉积Gy结果    1    ¹⁶O⁸⁺    75    1.585×10²经过谱学测定是为同一化合物    2    75    1.585×10⁷    3    75    1.585×10¹²    4    ¹²C⁶⁺    75    1.656×10¹经过谱学测定为同一化合物    5    75    1.656×10⁴    6    75    1.656×10⁹

从上看出喹烯酮经过¹⁶O⁸⁺或¹²C⁶⁺重离子辐照，能量沉积分别为1.585×10²-1.585×10¹²或1.656×10¹-1.656×10⁹都能得到喹烯酮。