柴胡总皂苷提取物及其制备方法

摘要

本发明公开了一种从中药柴胡中提取得到的总皂苷提取物及其制备方法。该提取物主要包括柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h及其类似物。该提取物可由溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法、柱色谱法、超临界流体色谱法、液－液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合制备获得。所制得的柴胡总皂苷提取物中各种皂苷类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h等成分的含量之和占全部总皂苷含量以重量计为5～100％。

说明书

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及一种中药柴胡总皂苷提取物及制备方法、质量控制方法及其在医药和保健食品领域的应用。

背景技术

柴胡为常用中药，来源于伞形科植物北柴胡Bupleurum chinense DC.和南柴胡Bupleurum scorzonerifolium willd.的干燥根。传统中医药理论认为柴胡归肝、胆经，具有和表解里，疏肝，升阳的功效，主治感冒发热，寒热往来，胸胁胀痛，月经不调，子宫脱垂，脱肛等证，现代药理研究表明柴胡具有解热、抗病毒、抗细菌内毒素、抗炎、降血脂、保肝、抗肿瘤、提高免疫力、抗惊厥等多种功效。柴胡中主要含有皂苷、挥发油、多糖等成分，其中皂苷类成分为其主要活性成分。存在于柴胡药材中的皂苷，为一类在其结构中的C-13、28位之间含有环氧醚键的柴胡皂苷，如柴胡皂苷a、c、d等。该类皂苷不稳定，在加热(如煎煮等)及植物中酸性成分的双重作用下，易发生结构转化，生成一系列次生柴胡皂苷，如柴胡皂苷b1、b2、h等(匡海学，中药化学，北京：中国中医药出版社，2003)。柴胡皂苷a、c、d及次生皂苷b1、b2、h均具有显著的药理活性。现有的关于柴胡皂苷提取物制备方法的专利主要涉及柴胡皂苷a、c、d，如专利“一种柴胡提取物、其制备方法及其应用”(申请号200610099498.7)等。为了避免这些柴胡皂苷的次生化，常需要控制严格的提取条件，如溶剂酸碱性、加热温度和时间等，且不能最大限度地避免皂苷的转变。因此在柴胡传统使用过程中，柴胡皂苷的次生产物，如柴胡皂苷b1、b2、h，是大量存在的，是柴胡提取物的重要组成部分，是柴胡、柴胡提取物和柴胡总皂苷的主要功效成分之一。为此，本专利发明涉及的柴胡总皂苷提取物所包含的皂苷类成分既包括了柴胡皂苷a、c、d等原型皂苷，也包括了次生皂苷柴胡皂苷b1、b2、h等，与已有专利发明有明显区别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种柴胡总皂苷提取物及其制备方法。

本发明提出的柴胡总皂苷提取物，是从中药柴胡中提取的含有多种皂苷类活性成分的组合，其中主要化合物结构如下：

化合物 R₁ R₂    R₃ 英文名称柴胡皂苷a β-OH OH    Glc(1-3)Fuc Saikosaponin a柴胡皂苷c β-OH H    Glc(1-6)[Rha(1-4)]Glc Saikosaponin c柴胡皂苷d α-OH OH    Glc(1-3)Fuc Saikosaponin d

化合物  R₁  R₂    R₃ 英文名称柴胡皂苷b1  β-OH  OH    Glc(1-3)Fuc Saikosaponin b1柴胡皂苷h  β-OH  H    Glc(1-6)[Rha(1-4)]Glc Saikosaponin h柴胡皂苷b2  α-OH  OH    Glc(1-3)Fuc Saikosaponin b2

本发明所述原料柴胡，来源于伞形科柴胡属的任意一种植物。作为提取柴胡总皂苷的原材料，可以是市售柴胡饮片，也可以是这些植物的茎、叶、花穗、果实、地下根茎及根等任一部位或全部植株，其中优选的药材部位为这些植物未抽花茎的干燥根。上述所述的柴胡包括未经任何炮制处理的原药材及饮片，还包括各种炮制品，如“醋炙柴胡”等。

本发明所述的柴胡总皂苷提取物，是指从上述任一植物的任何部位提取得到的，包含多种柴胡类活性成分的组合物，其中优选的是从北柴胡Bupleurumchinense DC.和南柴胡Bupleurum scorzonerifolium willd.的未抽花茎的干燥根中提取制备得到的，含有多种皂苷类活性成分的组合物。这些皂苷类成分主要包括以下图所示结构为母核的一系列衍生物

作为柴胡总皂苷提取物，其中各皂苷类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中优选的为50～100％(w/w)。

在本发明所述的柴胡总皂苷提取物所涵盖的各种柴胡皂苷类活性成分之中，最主要的是柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d、柴胡皂苷b₁、柴胡皂苷b₂、柴胡皂苷h等成分。

本发明还提出了所述柴胡总皂苷提取物的制备工艺，它可以采用以下任意一种方法，或这些方法的任意组合进行制备：(1)溶剂提取法；(2)溶剂萃取法；(3)大孔吸附树脂法；(4)超临界流体萃取法；(5)柱色谱法；(6)液-液逆流分配色谱法。其中优选的方法为大孔吸附树脂法。

在使用这些方法进行制备时，一般包括以下几个步骤：

(1)提取：所用溶剂可以是水或任意一种醇类、酮类及酯类溶剂，或这些溶剂按一定比例组成的混合溶剂，或由这些溶剂与酸、碱、盐配成的酸性或碱性溶剂。提取方法可以是煎煮、加热回流、超声提取、冷浸、渗漉、微波提取、高压提取等。

优选的提取工艺为：柴胡药材加0～70％乙醇或这些溶剂与碱性物质配成的碱性溶剂，回流提取2～3次，每次提取1～2小时，溶剂用量为5～15倍量(L/kg)。

(2)过滤：包括离心、抽滤、超滤、压滤等方法，使用或不使用以下任意一种澄清剂或其组合：醇沉剂，明胶，高岭土，各种树脂，聚乙二醇，聚乙三醇，壳聚糖以及天然澄清剂成品如101果汁澄清剂、ZTC+1天然澄清剂等。

(3)浓缩：包括常压或减压条件下的薄膜蒸发、旋转蒸发及煎煮浓缩等。

(4)干燥：包括真空干燥、喷雾干燥、冷冻干燥等。

当采用溶剂萃取法进行制备时，一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总皂苷成分，得到总皂苷提取物。

当采用大孔吸附树脂法进行制备时，所用的大孔树脂可以是非极性、弱极性、中等极性、弱碱性或弱酸性等任意一种类型，如D101、D4020、HPD400、AB-8、S-8、HZ-806等，其中优选的为弱极性或中等极性的树脂，如AB-8、HPD400、D101等。所用的洗脱剂为水和含水的乙醇、甲醇、丙酮等，其中优选的为70～100％的乙醇。

优选的柴胡总皂苷提取物树脂纯化工艺为：选用AB-8、HPD400等中等极性或弱极性大孔吸附树脂作为纯化用树脂，柴胡提取物上样液稀释倍数1∶6～16(以生药量计)，吸附流速3～9BV/h，树脂柱径高比1∶5～1∶10，上样量为0.1～0.5g/mL(以生药量计)，0～60％乙醇洗脱1～4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3～8BV/h，用70～100％乙醇洗脱3～6倍树脂体积，洗脱流速为3～9BV/h。

当采用超临界流体萃取法进行制备时，可以对柴胡原材料直接进行萃取，也可以对上述任一方法和步骤所获得的产物进行萃取。萃取时可以使用或不使用以下任一种类溶剂及溶剂混合物：水、醇类、酮类及酯类溶剂。

当采用柱色谱法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤所获得的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。所用的固定相可以是硅胶、聚酰胺、氧化铝、葡聚糖(Sephadex系列或Sephadex LH-20系列)、C-8、C-18、活性炭、纤维素等，所用的洗脱液因固定相的不同而不同，一般是由水、甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯、石油醚等组成的混合溶剂。

当采用液-液逆流萃取法进行制备时，其处理的对象可以是上述提取步骤的产物，也可以是经上述溶剂提取法、溶剂萃取法、大孔吸附树脂法或超临界流体萃取法初步纯化后的产物。一般先将提取物混悬于水中，然后用低极性的酯类、烷烃类或醚类溶剂(如石油醚、乙醚、己烷、汽油、乙酸乙酯等)萃取除去脂溶性杂质，然后用合适极性的溶剂，如氯仿、乙酸乙酯、丙酮、正丁醇等，或是这些溶剂的混合物，萃取获得其中的总皂苷成分，得总皂苷提取物。

该提取物可以单独或与其它任何中西药物或食物按任意比例配伍，用于制备药物或功能性食品，所制得的药物或功能性食品可以是胶囊剂、片剂、丸剂、颗粒剂、口服液、糖浆、冲剂、酒剂、注射剂、膏剂、散剂、饮料等。

本发明质量控制方法可包括以下含量测定方法中的一种或两种：

1.总皂苷

精密称取柴胡皂苷a对照品适量(约4mg)，置100mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。精密吸取柴胡皂苷a对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，置于10ml具塞刻度试管，加0.1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5ml，70℃水浴10min，取出放置至室温，加磷酸4.0ml，70℃水浴5min，放置至室温，于545nm波长处测定吸光度。以柴胡皂苷a对照品取样量为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

精密称取柴胡总皂苷提取物样品各3份，每份100mg，置25mL量瓶中，加70％乙醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述样品溶液0.1mL，柴胡皂苷a对照品溶液0.2mL、0.8mL，置于10ml具塞刻度试管，加0.1％对二甲氨基苯甲醛乙醇溶液0.5ml，70℃水浴10min，取出放置至室温，加磷酸4.0ml，70℃水浴5min，放置至室温，于545nm波长处测定吸光度。外标两点法计算含量。

2.柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d

色谱条件：色谱柱：Hypersil-C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水梯度洗脱，22％～50％乙腈(0～70min)；流速：1.0mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃。

标准曲线绘制：分别精密吸取柴胡皂苷a对照品溶液(浓度为0.217μg/μL)、柴胡皂苷c对照品溶液(浓度为0.218μg/μL)、柴胡皂苷d对照品溶液(浓度为0.193μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批柴胡总皂苷提取物样品各3份，每份约20mg，置10mL量瓶中，加70％乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

3.柴胡皂苷b₁、柴胡皂苷b₂、柴胡皂苷h

色谱条件：色谱柱：Hypersil-C₁₈色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水梯度洗脱，22％～50％乙腈(0～70min)；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：35℃。

标准曲线绘制：分别精密吸取柴胡皂苷b₁对照品溶液(浓度为0.190μg/μL)、柴胡皂苷b₂对照品溶液(浓度为0.354μg/μL)、柴胡皂苷h对照品溶液(浓度为0.163μg/μL)0、2、4、6、8、10μL注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，以对照品进样量(μg)为横坐标，色谱峰峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

含量测定：精密称取3批柴胡总皂苷提取物样品各3份，每份约20mg，置10mL量瓶中，加70％乙醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，作为柴胡皂苷b₁、柴胡皂苷b₂、柴胡皂苷h含量测定的供试品溶液。精密吸取上述供试品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定各色谱峰峰面积，计算含量。

具体实施方式

实施例1：柴胡总皂苷提取物制备工艺

取柴胡饮片1kg，0.4％NaOH-50％乙醇10L回流提取3次，每次提取1小时，减压回收溶剂，得提取物，加水分散溶解，使水溶液稀释倍数为1∶14(以生药量计)，通过8L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速3BV/h，树脂柱径高比为1∶8，上样量为0.125g/mL(以生药量计)，50％乙醇洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为3BV/h，90％乙醇洗脱5倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为柴胡总皂苷提取物。测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为62％，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d三种成分的含量之和为25％。

实施例2：柴胡总皂苷提取物制备工艺

取柴胡饮片10kg，0.5％NaOH-55％乙醇15L，回流提取3次，每次提取1.5小时，回收溶剂，提取物加水分散溶解，使水溶液稀释倍数为1∶12(以生药量计)，通过6L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为1∶7，上样量为0.16g/mL(以生药量计)，45％乙醇洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2BV/h，85％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为柴胡总皂苷提取物。测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为65％，其中柴胡皂苷a、柴胡皂苷c、柴胡皂苷d三种成分的含量之和为27％。

实施例3：柴胡总皂苷提取物制备工艺

取柴胡饮片1kg，水12L水蒸气蒸馏6小时，分离挥发油。药渣用0.05％NaOH-50％EtOH回流提取2次，每次提取2小时，回收溶剂，与水蒸馏液合并，加水分散溶解，使水溶液稀释倍数为1∶14(以生药量计)，通过10L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速4BV/h，树脂柱径高比为1∶8，上样量为0.1g/mL(以生药量计)，50％乙醇洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2BV/h，90％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集90％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为柴胡总皂苷提取物。测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为65％，其中柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h、柴胡皂苷a四种成分的含量之和为22％。

实施例4：柴胡总皂苷提取物制备工艺

取柴胡饮片10kg，水12L水蒸气蒸馏6小时，分离挥发油。药渣用0.05％NaOH-50％EtOH回流提取3次，每次提取1小时，回收溶剂，与水蒸馏液合并，加水分散溶解，使水溶液稀释倍数为1∶12(以生药量计)，通过10L AB-8大孔吸附树脂，吸附流速3BV/h，树脂柱径高比为1∶8，上样量为0.1g/mL(以生药量计)，55％乙醇洗脱4倍树脂体积进行除杂，除杂流速为2BV/h，85％乙醇洗脱4倍树脂体积，洗脱流速为2BV/h，收集85％乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，即为柴胡总皂苷提取物。测定柴胡总皂苷提取物中总皂苷含量为65％，其中柴胡皂苷b1、柴胡皂苷b2、柴胡皂苷h、柴胡皂苷a四种成分的含量之和为25％。

实施例5：柴胡总皂苷片的制备

柴胡总皂苷提取物    100g

淀粉                100g

上述组分混合均匀，加滑石粉适量，压制成1000片。

实施例6：柴胡总皂苷复方制剂的制备

柴胡总皂苷提取物    50g

甘草总黄酮提取物    50g

枳实总黄酮提取物    100g

白芍乙醇提取物      300g

上述组分混合均匀，装入硬明胶胶囊中，共2000粒胶囊。