一种利用线粒体DNA D－loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法

摘要

本发明公开了一种利用线粒体DNA D－loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法。它包括如下步骤：(1)分别提取鱼类基因组DNA和线粒体DNA；(2)在鱼类线粒体DNA D－loop控制区设计简并引物：其上游引物MitD1－F有21个碱基：CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA；下游引物MitD1－R有23个碱基：GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA；(3)在引物的作用下进行PCR反应；(4)琼脂糖凝胶电泳；(5)对扩增的mtDNA D－loop基因片断进行测序。本发明的利用线粒体DNA D－loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法能进行鱼类遗传信息和遗传多样性分析，快速准确且简单实用。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类遗传信息分析技术领域，具体的说，涉及一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法。

背景技术

鱼类线粒体DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)同其他脊椎动物的mtDNA一样，呈共价闭合环状，包括一条重链，一条轻链，是细胞核外具自主复制、转录和翻译能力的遗传因子。与核DNA相比，鱼类mtDNA具有分子小、结构简单、进化速度快、不同区域进化速度存在差异等特点，是一个相对独立的复制单位。鱼类mtDNA的这些特点，使其成为鱼类进化遗传学、分子生态学、遗传多样性及其保护生物学等研究的重要标记。

鱼类mtDNA的结构和基因成分都与其他脊椎动物的类似，均由22个tRNAs基因、2个rRNA基因(12S rRNA和16S rRNA)、控制区(D-环区)、轻链复制起始区和13个疏水性蛋白质多肽组成。位于编码脯氨酸(Pro)和苯丙氨酸(Phe)tRNA基因之间的区域是mtDNA上主要的非编码区，又称为控制区(control region)或D-loop区，是整个mtDNA序列和长度变异最大的区域，但其中也包含有保守片段。控制区是mtDNA变化最复杂，被了解最少，也最吸引人的区域，对控制区结构功能的研究将有助于了解DNA的复制、转录的机制和进化的规律。一般认为，D-loop区是线粒体基因组上进化最快的部分，它的变异速率约为mtDNA完整分子或mtDNA分子上其它区域的5～10倍，是进行鱼类群体遗传结构揭示、濒危物种的遗传多样性程度鉴定等研究方面的重要遗传标记。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法。

本发明的利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法，包括以下步骤：

(1)分别提取鱼类基因组DNA和线粒体DNA；

(2)在鱼类线粒体DNA D-loop控制区设计简并引物：其上游引物MitD1-F有21个碱基：CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA；下游引物MitD1-R有23个碱基：GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA；

(3)在引物的作用下进行PCR反应；

(4)琼脂糖凝胶电泳；

(5)对扩增的mtDNA D-loop基因片断进行测序。

在上述方法中，所述鱼类基因组DNA的提取方法优选酚-氯仿法、细胞裂解法或Omega试剂盒法。

酚-氯仿法：取0.1g样品，加入PBS冰浴匀浆。加10％SDS 50μl和蛋白酶K(20mg/ml)，颠倒混匀，55℃水浴2～3h或过夜。加等体积PIC(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)至上述样品处理液中，温和、充分混匀。8000rpm室温离心10min，收集上清，反复抽提2～3次，直至水相澄清。加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。最大转数离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇(预冷的)洗涤，最大转数离心3min，弃上清液。重复一次。室温下或超净工作台挥发乙醇，待沉淀将近透明后加30～50μl TE溶解，分装后保存。

细胞裂解法：取100mg左右的鱼肌肉，加TEN9细胞裂解液(50mmol·L^-1Tris·HCl pH9.0，100mmol·L^-1EDTA，200mmol·L^-1NaCl)，终浓度为2％SDS和终浓度为1mg·mL^-1Protein K，混匀后，56℃消化过夜，经饱和酚，酚-氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)抽提，2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc沉淀，70％乙醇洗涤后，用灭菌蒸馏水溶解，4℃存放。

Omega试剂盒法：取30mg组织剪碎放入有Buffer TL溶液的管中，加入OB蛋白酶旋涡震荡充分混合，在55℃水浴以有效裂解。10000g离心5分钟，小心吸取上清转到无菌的微型离心管中，加入Buffer BL旋涡震荡混合。70℃孵育10分钟。加入无水乙醇完全混合，转入HiBand DNA柱中，8000g离心1分钟。然后用Buffer HB洗涤，8000g离心1分钟。用DNA Wash Buffer洗涤，8000g离心1分钟。重复用DNA Wash Buffer洗涤并离心。加入洗脱液，在室温静置3分钟，10000g离心1分钟以洗脱DNA。

在上述方法中，所述提取鱼类线粒体DNA采用直接提取方法：取样品组织200mg剪碎后加入1mL PBS缓冲液，冰浴匀浆。将匀浆液转入Eppendorf管，4℃，800g离心10分钟。取上清4℃，12000g高速离心10分钟。弃上清，加入500μl灭菌蒸馏水悬浮沉淀，取5μl悬浮液备用以用于PCR检测。加等体积PIC(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)至上述样品处理液中，温和、充分混匀。5000g室温离心10min。将上清液转置另一1.5ml离心管中，反复抽提2～3次，直至水相澄清。加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后，最大转数离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇(预冷的)洗涤，最大转数离心3min，弃上清液。重复一次。室温下或超净工作台挥发乙醇，待沉淀将近透明后加30～50μl TE(或ddH₂O)溶解，每10μl分装一只离心管，-20℃保存。

在上述方法中，步骤(3)所述PCR反应的体系和条件如下：

PCR反应体系为28μl，内含dNTP(1mM)、ExTaq Buffer(10×)、10μM的引物MitD1-F和引物MitD1-R、Ex-Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH₂O；

Ex Taq Buffer(10×)     2.5μl

dNTPs                   2μL

MitD1-F                 2μL

MitD1-R                 1.5μL

Template                1μL

ddH₂O                  19μL

Ex-Taq酶                0.1μL

PCR条件为：92℃预变性5min，然后98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸60s，共33个循环，最后在72℃充分延伸10min。

在上述方法中，步骤(5)所述测序为采用PCR扩增产物直接测序；采用Omega公司的E.Z.N.A^TM Gel Extraction Kit进行割胶纯化后测序；用Takara公司的pMD19-T vector载体进行克隆测序或委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明的利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法能进行鱼类遗传信息和遗传多样性分析，快速准确且简单实用。

附图说明

图1为不同方法提取基因组DNA的凝胶电泳图；

图2为PCR扩增线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢mt DNA D-loop的电泳图。

其中，图1中，1、3、5为线纹尖塘鳢样品，2、4、6为云斑尖塘鳢样品；1、2为酚氯仿提取法，3、4为细胞裂解法，5、6为试剂盒法；M为DNA分子量标准DL-2000。

图2中，1、2为酚氯仿提取的基因组DNA；3、4为细胞裂解法提取的基因组DNA；5、6为试剂盒法提取的基因组DNA；7、8为直接提取的mt DNA；1、3、5、7为线纹尖塘鳢样品；2、4、6、8为云斑尖塘鳢样品；M为DNA分子量标准DL-2000。

具体实施方式

一、鱼类基因组DNA提取方法

a.酚-氯仿法：取0.1g样品，加入PBS冰浴匀浆。加10％SDS 50μl和蛋白酶K(20mg/ml)，颠倒混匀，55℃水浴2-3h或过夜。加等体积PIC(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)至上述样品处理液中，温和、充分混匀。8000rpm室温离心10min，收集上清，反复抽提2～3次，直至水相澄清。加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。最大转数离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇(预冷的)洗涤，最大转数离心3min，弃上清液。重复一次。室温下或超净工作台挥发乙醇，待沉淀将近透明后加30-50μl TE溶解，分装后保存。

b.细胞裂解法：取100mg左右的鱼肌肉，加TEN9细胞裂解液(50mmol·L^-1Tris·HCl pH9.0，100mmol·L^-1EDTA，200mmol·L^-1NaCl)，终浓度为2％SDS和终浓度为1mg·mL^-1Protein K，混匀后，56℃消化过夜，经饱和酚，酚-氯仿(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)，氯仿(氯仿∶异戊醇＝24∶1)抽提，2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc沉淀，70％乙醇洗涤后，用灭菌蒸馏水溶解，4℃存放。

c.Omega试剂盒法：取30mg组织剪碎放入有Buffer TL溶液的管中，加入OB蛋白酶旋涡震荡充分混合，在55℃水浴以有效裂解。10000g离心5分钟，小心吸取上清转到无菌的微型离心管中，加入Buffer BL旋涡震荡混合。70℃孵育10分钟。加入无水乙醇完全混合，转入HiBand DNA柱中，8000g离心1分钟。然后用BufferHB洗涤，8000g离心1分钟。用DNA Wash Buffer洗涤，8000g离心1分钟。重复用DNA Wash Buffer洗涤并离心。加入洗脱液，在室温静置3分钟，10000g离心1分钟以洗脱DNA。

二、鱼类线粒体DNA直接提取方法

取样品组织200mg剪碎后加入1mL PBS缓冲液，冰浴匀浆。将匀浆液转入Eppendorf管，4℃，800g离心10分钟。取上清4℃，12000g高速离心10分钟。弃上清，加入500μl灭菌蒸馏水悬浮沉淀，取5μl悬浮液备用以用于PCR检测。加等体积PIC(酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1)至上述样品处理液中，温和、充分混匀。5000g室温离心10min。将上清液转置另一1.5ml离心管中，反复抽提2～3次，直至水相澄清。加1/10体积的3M醋酸钠(pH 5.2)和2.5倍体积的无水乙醇，轻轻倒置混匀。待絮状物出现后，最大转数离心10min，弃上清液。沉淀用70％乙醇(预冷的)洗涤，最大转数离心3min，弃上清液。重复一次。室温下或超净工作台挥发乙醇，待沉淀将近透明后加30-50μlTE(或ddH₂O)溶解，每10μl分装一只离心管，-20℃保存。

三、引物设计

其上游引物MitD1-F有21个碱基：CAC CCY TRR CTC CCA AAGCYA，下游引物MitD1-R有23个碱基：GGT GCG GRK ACT TGC ATGTRT AA。

四、在引物的作用下进行PCR反应

PCR反应体系为28μL，内含dNTP(1mM)、Ex Taq Buffer(10×)、10μM的引物MitD1-F和引物MitD1-R、Ex-Taq酶、含50～150ng的DNA模板溶液、ddH₂O。

Ex Taq Buffer(10×)    2.5μL

dNTPs                  2μL

MitD1-F             2μL

MitD1-R             1.5μL

Template            1μL

ddH₂O              19μL

Ex-Taq酶            0.1μL

扩增条件为：92℃预变性5min，然后98℃变性10s，54℃退火20s，72℃延伸60s，共33个循环，最后在72℃充分延伸10min。扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测其大小、纯度及亮度。

五、测序

采用PCR扩增产物直接测序；采用Omega公司的E.Z.N.A^TM GelExtraction Kit进行割胶纯化后测序；用Takara公司的pMD19-T vector载体进行克隆测序或委托公司进行双向直接测序，测序引物为扩增引物MitD1-F(10μM)和MitD1-R(10μM)，序列分析仪为ABI 3730型全自动DNA测序仪。

不同方法提取基因组DNA的凝胶电泳图如图1所示，1、3、5为线纹尖塘鳢样品，2、4、6为云斑尖塘鳢样品；1、2为酚氯仿提取法，3、4为细胞裂解法，5、6为试剂盒法；M为DNA分子量标准DL-2000。

PCR扩增线纹尖塘鳢和云斑尖塘鳢mt DNA D-loop的电泳图如图2所示，1、2为酚氯仿提取的基因组DNA；3、4为细胞裂解法提取的基因组DNA；5、6为试剂盒法提取的基因组DNA；7、8为直接提取的mt DNA；1、3、5、7为线纹尖塘鳢样品；2、4、6、8为云斑尖塘鳢样品；M为DNA分子量标准DL-2000。从而可对鱼类进行遗传信息分析。

          一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类

                   SEQUENCE LISTING

<110>中山大学

<120>一种利用线粒体DNA D-loop控制区进行鱼类遗传信息分析的方法

<130>

<160>1

<170>Patent In version 3.2

<210>1

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

引物MitD1-F：CAC CCY TRR CTC CCA AAG CYA

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

引物MitD1-R：GGT GCG GRK ACT TGC ATG TRT AA