基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法

摘要

本发明涉及一种基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法，其中扩增目标基因与质粒载体的引物的5’端第11－21位间的某一磷酸二酯键为硫代修饰；目标基因的正向引物和载体的反向引物，目标基因的反向引物和载体的正向引物，每对引物5’端至硫代修饰上游第2位的连续碱基序列互补配对。PCR扩增目标基因与质粒载体后，纯化PCR产物。5’外切核酸酶从5’端降解DNA链，硫代修饰与5’外切核酸酶消化DNA双链的共同作用会生成长10－20个核苷酸的3’单链突出端。由于目标基因与质粒载体的3’突出端碱基序列互补，形成稳定的完全配对双链，不需要进行DNA连接反应，直接转化大肠杆菌。本发明目标基因克隆不依赖于限制性核酸内切酶与DNA连接酶，操作通量大，可用于大规模基因克隆。

说明书

技术领域

本发明涉及一种新的基因克隆方法，尤其涉及一种基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克隆方法，可以用于重组蛋白表达载体构建，属于基因工程技术领域。

背景技术

基因克隆技术的出现极大地促进了现代基因工程、蛋白质工程的发展。传统基因克隆技术涉及目标基因DNA片段与质粒载体的限制性核酸内切酶消化、连接酶连接环化目标基因与质粒两步必不可少的操作。由于限制性核酸内切酶消化反应与DNA连接酶反应，特别是限制性核酸内切酶消化反应，效率的高低直接决定着目标基因克隆能否成功。虽然利用碱性磷酸单酯酶除去线性化载体的5’磷酸基团，会大大提高阳性克隆百分比，但该操作异常繁琐，手法难于掌握，经常起不到应有作用。为了克服常规基因克隆方法的缺陷，开发了连接酶非依赖性克隆方法。其中基于T4DNA聚合酶的连接酶非依赖性克隆方法是其中的一种方法(Nucleic Acids Research，Vol.18，No.20p6069-6074)，该方法通过在扩增目标基因的引物5’端添加一段特殊的碱基序列(一般为12-15个碱基)，该段特殊碱基序列的3’端最后一个碱基是此段序列中唯一的一个该种碱基(例如dG)，在dCTP的存在下目标基因与线性质粒载体与T4DNA聚合酶一起温育，产生长的5’单链突出端，带有5’单链突出端的目标基因与线性质粒载体互补配对后，转化大肠杆菌修复目标基因与线性质粒载体间的缺口，完成目标基因的克隆。该方法操作缺点主要有：1)需要在目标基因与线性质粒载体的5’端引入一段特定的碱基序列，导致克隆的目标基因的两端附加了一段人为的碱基序列；2)引入的一段特定碱基序列有时较难设计，造成目标基因克隆困难。

发明内容

本发明的目的在于针对现有基因克隆技术的不足，提供一种新的连接酶非依赖性基因克隆方法，这种基因克隆技术不需要限制性核酸内切酶消化与连接酶反应，使得基因克隆操作简便、克隆效率与通量大大提高，可用于大规模基因克隆。

为实现这样的目的，在本发明中，用于扩增目标基因与质粒载体的引物片段(寡核苷酸片断)具有如下特征：引物5’端第11-21位间的某一磷酸二酯键为硫代修饰；扩增目标基因的正向引物5’端的第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增载体的反向引物5’端的第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对，扩增目标基因的反向引物5’端的第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增载体的正向引物5’端的第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对；正向引物与反向引物扩增目标基因与质粒载体，然后用限制性内切核酸酶Dpn I消化环形质粒模板，最后纯化PCR产物，如此制备的DNA片段5’端第11-21位间含有一处硫代修饰。5’外切核酸酶从双链DNA的5’端降解DNA链，用其消化PCR扩增的目标基因与线性化质粒载体DNA分子，会产生3’单链突出端，硫代修饰的存在使得5’外切核酸酶在消化DNA过程中会终止在硫代修饰处，从而产生长10-20个核苷酸的3’单链突出端。由于目标基因与质粒载体的3’突出端碱基序列互补配对，二者形成稳定的完全配对双链，不需要进行DNA连接反应，可以直接转化大肠杆菌。转化后，大肠杆菌DNA修复系统可以修复目标基因与质粒载体间的DNA缺口，形成完整的含有目标基因的重组DNA分子。

本发明的具体步骤如下：

1、设计合成用于扩增目标基因与质粒载体的引物序列。引物的序列特征是：(1)5’端第11-21位间的某一磷酸基团为硫代修饰；(2)扩增目标基因的正向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增质粒载体的反向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对，扩增目标基因的反向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列与扩增质粒载体的正向引物的5’端第1位至硫代修饰上游第2位间的连续碱基序列互补配对；(3)3’端下游碱基序列与待扩增DNA片段两端碱基序列配对。

2、聚合酶链式反应(PCR)扩增目标基因与线性化质粒载体DNA片段。将用于扩增DNA片段(目标基因与质粒载体)的正向引物与反向引物、目标核酸模板分子(含目标基因的基因组DNA或质粒载体DNA)、高忠实度耐高温DNA聚合酶(例如pfu DNA聚合酶)、4种脱氧核苷三磷酸(dNTPs)加入PCR反应缓冲液，进行反应。PCR条件同一般的液相聚合酶链式反应。

3、纯化扩增的目标基因与线性化质粒载体DNA片段。对扩增的线性化质粒载体PCR产物，先用限制性核酸内切酶Dpn I(其特异性识别切割双链DNA中A甲基化的GmATC序列)消化质粒模板，由于质粒模板具有多处GmATC序列，DpnI处理使得质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆，回收经Dpn I处理的线性化质粒载体以及目标基因的扩增产物。

4、利用5’外切核酸酶(例如λ外切核酸酶与T7基因6蛋白)消化PCR扩增的目标基因与线性化质粒载体DNA片断。5’外切核酸酶特异性从5’端水解双连DNA中带有5’磷酸基团的DNA链。用5’外切核酸酶消化制备的目标基因与线性化质粒载体DNA片断2-5分钟。5’外切核酸酶消化和硫代修饰(阻碍核酸酶消化)的存在使得DNA片段的两端产生长为10-20个核苷酸的3’突出端。

5、5’外切核酸酶处理的目标基因与线性化质粒载体DNA片断间的杂交配对。将5’外切核酸酶消化的两种DNA片断混合后，室温放置15分钟，使二者的3’突出端杂交配对，形成含目标基因的带缺口重组质粒。

6、含目标基因的带缺口重组质粒转化大肠杆菌。杂交混合物(该混合物中含有含目标基因的带缺口重组质粒)转化大肠杆菌感受态细胞，在固体培养基上37度培养过夜。在大肠杆菌的繁殖过程中，带缺口重组质粒中目标基因与质粒载体间的缺口会被修复，形成含目标基因的完整重组质粒。

7、含目标基因的完整重组质粒的鉴定。挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组质粒的阳性克隆。培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组质粒DNA。

本发明与现有的基因克隆技术相比有显著的进步。主要优点如下：(1)含有目标基因的阳性克隆率高。由于采用PCR扩增质粒载体，消除了限制性核酸内切酶消化质粒造成的假阳性克隆(不含目标基因的质粒载体)，从而极大地提高了阳性克隆比例。(2)操作通量大，适宜于多个目标基因同时克隆。基于硫代修饰的连接酶非依赖性基因克降方法在整个操作过程中不需要特异性的限制性核酸内切酶，操作统一仅需要外切核酸酶消化生成长粘性末端，因此可以简单的扩大克隆通量，进行大规模基因克隆。(3)插入目标基因两端用于与载体互补的碱基序列随意。硫代修饰的存在保证了各种5’外切核酸酶消化反应能够有效地终止在硫代修饰处，使得3’突出端可以随意设计，大大方便了操作。(4)目标基因PCR扩增忠实性高。由于硫代修饰不影响各种DNA聚合酶催化的PCR反应，因此可以采用忠实性最高的pfu DNA聚合酶扩增目标基因，降低在PCR中引入突变的频率。此优点在构建目标基因(特别是长基因)的表达克隆中优势尤为明显，可以保证构建的表达载体能够表达出正确的重组蛋白。

本发明可用于基因克隆，基因片段拼接、目标基因定点突变等领域。目标基因与质粒载体无需限制性核酸内切酶消化，因此可以大大降低假阳性克隆(空质粒)百分比，提高目标基因克隆成功率。

附图说明

图1为本发明基于硫代修饰引物与5’外切核酸酶消化的连接酶非依赖性基因克隆方法的原理图。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述。以下实施例不构成对本发明的限定。

本发明方法如图1所示，首先利用5’端第11-21位间某一磷酸二酯键是硫代修饰的引物片段分别扩增目标基因与质粒载体，获得5’端第11-21位间某一磷酸二酯键是硫代修饰的目标基因与线性化质粒载体的DNA片段；然后利用5’外切核酸酶消化制备的DNA分子，硫代修饰的存在使得5’外切核酸酶在消化DNA过程中会终止在硫代修饰处，从而产生长10-20个核苷酸的3’单链突出端；由于目标基因与线性化质粒载体的3’单链突出端互补配对，二者混合杂交会形成含目标基因的带缺口重组质粒；该质粒转化大肠杆菌后，目标基因与质粒载体间的缺口会被大肠杆菌修复好，形成含目标基因的完整重组质粒，从而完成目标基因的克隆。

本发明一个实施例中的目标基因是衣原体内切核酸酶IV基因，要将其克隆到pUC18载体，使用的5’外切核酸酶为T7基因6蛋白，硫代修饰存在于引物5’端第15位的磷酸二酯键，具体实施步骤如下：

第一步，设计合成用于扩增衣原体内切核酸酶IV基因与pUC18质粒的引物序列。4条引物分别为pUC-18-U-F、pUC-18-U-R、CpendoIV-F、CpendoIV-R。其中pUC-18-U-F与pUC-18-U-R用于扩增pUC18质粒载体，CpendoIV-F、CpendoIV-R用于扩增衣原体内切核酸酶IV基因。4条引物碱基序列如下：

pUC-18-U-F：5’ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcg

pUC-18-U-R：5’ACCAGGCCGCTGCTg-gaattcgtaatcatggtcatag

CpendoIV-F：5’AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctc

CpendoIV-R：5’TCAATGGTGGTGATg-ctaactatctctgttttttgaaaac

其中，符号-表示硫代修饰，小写字母碱基序列与扩增DNA片断互补配对，大写字母碱基为目标基因与线性化质粒载体互补配对区。引物可以自己利用DNA合成仪合成或由各DNA合成公司合成。

第二步，聚合酶链式反应(PCR)扩增衣原体内切核酸酶IV基因与线性化pUC18质粒载体DNA片段。PCR反应组成(50微升反应体积)：正向引物与反向引物，0.5μM；DNA模板(100纳克衣原体基因组DNA，或10纳克pUC18质粒载体DNA)；pfu DNA聚合酶，2.5个单位；dNTPs，200μM；1×PCR反应缓冲液。PCR反应条件：95℃×5分钟；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×4分钟)×20个循环；72℃×10分钟。

第三步，纯化衣原体内切核酸酶IV基因与线性化pUC18质粒载体PCR扩增产物。衣原体内切核酸酶IV基因扩增产物直接用PCR产物纯化试剂盒纯化。由于线性化pUC18质粒载体PCR扩增产物中含有环状的pUC18质粒模板，可以利用限制性核酸内切酶Dpn I处理PCR产物，将pUC18质粒模板消化成短的DNA片断，再利用PCR产物纯化试剂盒纯化Dpn I处理的线性化pUC18质粒载体PCR扩增片段。Dpn I特异性识别切割双链DNA中A甲基化的G^mATC序列，由于质粒模板具有多处G^mATC序列，Dpn I处理把质粒模板变成很多段短的DNA双链，这些短的DNA双链转化大肠杆菌时不能够产生克隆，从而消除了野生型质粒模板产生的假阳性克隆。Dpn I处理与PCR产物纯化试剂盒操作按产品操作说明进行。

扩增的衣原体内切核酸酶IV基因碱基序列如下，其中省略号代表衣原体内切核酸酶IV基因中间的碱基序列，符号-表示硫代修饰：

5’AGCAGCGGCCTGGTc-atatgaaagtacttcctcctccctc..............

   TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag..............

..............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA

..............caaaagttttttgtctctatcaatc-gTAGTGGTGGTAACT5’

扩增的线性化pUC18质粒载体碱基序列如下，其中省略号代表线性化pUC18质粒载体中间的碱基序列，符号-表示硫代修饰：

5’ATCACCACCATTGAg-aagcttggcactggccgtcg...................

   TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................

.............ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT

.............gatactggtactaatgcttaag-gTCGTCGCCGGACCA 5’

第四步，利用T7基因6蛋白消化衣原体内切核酸酶IV基因与线性化pUC18质粒载体的PCR扩增的DNA片断。

将纯化的衣原体内切核酸酶IV基因与线性化pUC18质粒载体的PCR扩增片断进行T7基因6蛋白消化处理，由于硫代修饰会将T7基因6蛋白消化反应终止在硫代修饰位置(5’端第十五位磷酸二酯键)，因此可以产生长为14个核苷酸的3’突出端。T7基因6蛋白消化反应组成(50微升反应体积)：1个单位的T7基因6蛋白，1个皮克摩尔的衣原体内切核酸酶IV基因或线性化pUC18质粒载体DNA片断，1×T7基因6蛋白反应缓冲液。反应条件：37度温育5分钟，70度处理15分钟失活T7基因6蛋白。

T7基因6蛋白消化后的衣原体内切核酸酶IV基因碱基序列如下，其中省略号代表衣原体内切核酸酶IV基因中间的碱基序列，符号-表示硫代修饰：

           5’c-atatgaaagtacttcctcctccctc.............

TCGTCGCCGGACCAg tatactttcatgaaggaggagggag.............

.............gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA

.............caaaagttttttgtctctatcaatc-g 5’

T7基因6蛋白消化后的线性化pUC18质粒载体碱基序列如下，其中省略号代表线性化pUC18质粒载体中间的碱基序列，符号-表示硫代修饰：

           5’g-aagcttggcactggccgtcg...................

TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc...................

...................ctatgaccatgattacgaattc cAGCAGCGGCCTGGT

...................gatactggtactaatgcttaag-g 5’

第五步，T7基因6蛋白处理过的衣原体内切核酸酶IV基因片段与线性化pUC18质粒载体DNA片断互补配对。将T7基因6蛋白消化后的衣原体内切核酸酶IV基因片段与线性化pUC18质粒载体片断等摩尔(各0.1个皮克摩尔)混合于1×T7基因6蛋白反应缓冲液，室温或冰上放置15分钟，使二者3’突出端互补配对，形成插入了衣原体内切核酸酶IV基因的带缺口pUC18重组质粒。

插入了衣原体内切核酸酶IV基因的带缺口pUC18重组质粒碱基序列如下，其中省略号代表带缺口pUC18重组质粒中间的碱基序列，符号_代表衣原体内切核酸酶IV基因与pUC18质粒间的缺口，符号-表示硫代修饰：

..........ctatgaccatgattacgaattc c AGCAGCGGCCTGGT_c-atatgaaagtacttcctcctccctc

..........gatactggtactaatgcttaag-g_TCGTCGCCGGACCA g tatactttcatgaaggaggagggag

...........................................................................

...........................................................................

gttttcaaaaaacagagatagttag cATCACCACCATTGA_g-aagcttggcactggccgtcg..........

caaaagttttttgtctctatcaatc-g_TAGTGGTGGTAACTc ttcgaaccgtgaccggcagc..........

第六步，含衣原体内切核酸酶IV基因的带缺口pUC18重组质粒转化大肠杆菌。将第五步制备的插入了衣原体内切核酸酶IV基因的带缺口pUC18重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞(氯化钙法制备的感受态细胞即可)，转化后菌体涂布于含100微克/毫升氨苄青霉素的LB平板，于37度培养过夜。大肠杆菌的DNA修复系统会修复好衣原体内切核酸酶IV基因与pUC18质粒间的缺口，形成没有缺口的插入了衣原体内切核酸酶IV基因的完整pUC18重组质粒。转化按标准操作进行。

第七步，含衣原体内切核酸酶IV基因的pUC18重组质粒的鉴定。从第六步的平板上挑取单菌落，进行菌落PCR，鉴定含有衣原体内切核酸酶IV基因的单菌落，若能扩增出衣原体内切核酸酶IV基因的特异性DNA条带，该菌落即为插入了衣原体内切核酸酶IV基因的pUC18重组质粒的阳性克隆，培养阳性克隆并从中抽提重组质粒。菌落PCR组成(10微升反应体积)：衣原体内切核酸酶IV基因特异性引物，0.5μM；Taq DNA聚合酶，0.5单位；dNTPs，200μM；1×Taq聚合酶反应缓冲液；单菌落菌体。反应条件：95℃×10分钟；(95℃×30秒，65℃×30秒，72℃×1分钟)×30个循环；72℃×5分钟。质粒抽提按标准操作进行。