胶原－壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架及其制备方法和应用

摘要

本发明涉及一种适应组织工程皮肤构建的多孔支架材料及其制备方法，具体得说是涉及胶原—壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架及其制备方法和应用。胶原—壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架，该不对称支架包括胶原—壳聚糖多孔材料层和纤维蛋白胶层，纤维蛋白胶层均匀设置在胶原—壳聚糖多孔材料层的表面，两者之间形成有交界面。本发明所制备的胶原—壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架具有良好的细胞相容性，是一种适应组织工程皮肤尤其是复合皮肤构建的皮肤再生材料。另外，本发明还公开了上述的不对称支架的制备方法和应用。

说明书

                          技术领域

本发明涉及一种适应组织工程皮肤构建的多孔支架材料及其制备方法，具体得说是涉及胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架及其制备方法和应用。

                          背景技术

临床上，烧伤、创伤、糖尿病、静脉溃疡等各种原因引起的皮肤缺损是一种常见的疾病。目前常规的治疗方法便是做皮肤移植，如自体皮移植、同种异体皮或者是异种皮移植。其中自体皮移植由于没有排斥反应的问题，被作为首选的治疗方法。但是却常常存在自体皮源不足的问题，尤其是遇到大面积的烧伤病人时，这种供需矛盾更加突出。近20年来，随着材料科学和生命科学的发展，组织工程学迅速兴起。组织工程化皮肤的出现为临床上皮肤缺损的创面修复提供了一条崭新的途经。具有很大的研究前景和应用价值。但是要构建出理想的组织工程皮肤，就必须制备出一种生物相容性良好，机械性能适宜的，并具备特定微观结构的支架材料。

胶原和壳聚糖都是天然的高分子材料。作为组织工程的支架材料，胶原具有许多优越条件，它拥有最好的生物相容性，并且具有可降解、低免疫原性的特点。壳聚糖亦具有良好的生物相容性，且有促进创面愈合，抗感染的特性。这两种材料在自然界中来源广泛，成本低廉，由他们按适当比例混合后制备的支架材料可以取长补短，从而获得一种性质更加优化的支架材料。

中国发明专利申请CN02112498.1公开了一种采用天然生物材料胶原和壳聚糖为原料，通过冷冻-冻干，再进一步通过真空干热法、醛类化合物或碳化二亚胺类化合物交联，制备具有微结构可控、适宜降解速率和良好生物相容性的多孔支架。该发明的胶原/壳聚糖支架的生物相容性好，降解速率可控，且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单可行，重复性好，所构建的支架可以广泛地应用于组织工程领域，具有良好的临床应用前景。

中国发明专利申请CN200610041912.9公开了一种制备可生物降解的组织工程用支架材料的方法。该发明提供的可生物降解组织工程用支架材料具有适宜的微观结构和空隙率，具有优良的机械强度和可控的降解速率，可广泛应用于皮肤、神经修复管、血管以及心脏瓣膜等多种组织的修复与重建。

中国发明专利申请CN200510061872.X公开了一种胶原-壳聚糖和硅橡胶双层皮肤再生支架及其制备方法。该皮肤再生支架由胶原/壳聚糖多孔支架和硅橡胶薄膜通过生物相容性良好的胶粘剂粘结而成。其中胶原/壳聚糖多孔支架可以有效诱导缺损组织处细胞的迁移、增殖和分化，原位诱导缺损真皮组织的再生；硅橡胶薄膜则起到了临时表皮层的作用，可以有效控制水分的挥发和防止细菌的侵入等，对创面起到了临时保护作用。本发明所制备的胶原-壳聚糖/硅橡胶复合支架具有良好的生物相容性，可控的降解速率和优异的创面修复能力，具有较良好的临床应用前景。

纤维蛋白胶由纤维蛋白原在凝血酶的催化下转化而来，具有良好的组织和细胞相容性，在体内可降解，临床上主要被用于手术过程中的止血剂和组织粘合剂。研究表明它具有促进细胞黏附、增值和迁移的作用，目前亦被作为一种良好的载体材料用于组织工程的创伤修复中。

现在还未有将纤维蛋白胶与胶原/壳聚糖多孔支架复合制成适应组织工程皮肤构建的多孔支架材料的相关报道。

                          发明内容

本发明的一个目的是提供一种生物相容性良好，机械性能适宜，并具备特定微观结构，完全适应组织工程皮肤构建，可以有效促进皮肤创面修复愈合的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架。

本发明的一个目的是提供上述的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备方法。

本发明的一个目的是提供上述的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的应用。

为了实现本第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架，该不对称支架包括胶原-壳聚糖多孔材料层和纤维蛋白胶层，纤维蛋白胶层均匀设置在胶原-壳聚糖多孔材料层的表面，两者之间形成有交界面。

作为优选方案，上述的胶原-壳聚糖多孔材料具有80～150um的孔径结构；纤维蛋白胶具有5～20um的微小孔径。

为了实现本第二个目的，本发明采用了以下得技术方案：

上述的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备方法，包括如下步骤：

1)制备得到胶原-壳聚糖多孔支架；

2)将胶原-壳聚糖多孔支架进行浸泡消毒，然后用磷酸盐缓冲液漂洗；

3)将纤维蛋白原用DMEM培养基或PBS配成浓度为4mg/ml～80mg/ml；

4)将凝血酶(杭州普济医药技术开发有限公司)用DMEM培养基或PBS稀释成浓度为30IU/ml～600IU/ml；

5)将纤维蛋白原溶液均匀涂覆在已消毒的胶原-壳聚糖多孔支架表面，然后再将凝血酶滴加在其上，静置直至多孔膜材料表面形成一层固态的纤维蛋白胶，从而获得胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架。

作为优选，上述的纤维蛋白原的较佳浓度可以为20mg/ml～80mg/ml。凝血酶的较佳浓度可以为150IU/ml～600IU/ml。纤维蛋白原溶液的涂覆量较佳可以为25ul/cm²～100ul/cm²。步骤)5中静置可以采用室温或37℃温箱，静置时间为30分钟～2小时。

上述的步骤1)中胶原-壳聚糖多孔支架的制备方法可以如下：

1)用酸性溶液分别配置质量浓度为0.5％～5％的胶原溶液和壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，搅拌均匀，得胶原-壳聚糖混合溶液；

2)将胶原-壳聚糖混合液注入模具中，采用冷冻-冻干法，冷冻成固体，冻干，得到胶原-壳聚糖多孔支架；

3)将上述所得的胶原-壳聚糖多孔支架在80℃～130℃温度下真空干热物理交联处理，再置于醛类化合物或碳化二亚胺类化合物中交联12～48小时，清洗后，再次冷冻、冻干。

作为优选：其中步骤1)中配制胶原溶液的胶原材料是牛腿胶原、猪皮胶原、鼠尾胶原；壳聚糖的含量(重量)可以为5％～30％；配制胶原溶液和壳聚糖溶液所用的酸为乙酸、甲酸、盐酸中的一种或其混合物。其中步骤2)中冷冻-冻干法温度可以为-20℃～-50℃。其中醛类化合物可以是甲醛或戊二醛；碳化二亚胺类化合物可以采用摩尔浓度比为0.5～5∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液。其中较佳是：1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液浓度为20～80mmol/L。

为了实现本第三个目的，本发明公开了上述的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架在构建组织工程皮肤中的应用。

本发明制备的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架具有双层结构。由纤维蛋白胶和胶原-壳聚糖多孔材料浅层所构成的表皮面层，孔径在5um-20um，适合表皮细胞的接种，而由胶原-壳聚糖多孔材料构成的真皮面层，孔径为80-150um，适合真皮成纤维细胞的接种和生长。因此，本发明所制备的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架具有良好的细胞相容性，是一种适应组织工程皮肤尤其是复合皮肤构建的皮肤再生材料。

                          附图说明

图1是本发明胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架石腊切片，HE染色照片200x。

图2是本发明胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架石腊切片，HE染色照片400x。

图3是纤维蛋白胶(纤维蛋白原80mg/ml，凝血酶600IU/ml室温下聚合成胶)的扫描电镜(SEM)照片。

图4、图5是纤维蛋白原浓度为40mg/ml时，胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架扫描电镜(SEM)照片。

图6、图7是纤维蛋白原浓度为8mg/ml时，胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架扫描电镜(SEM)照片。

图8是人真皮成纤维细胞在不对称支架中培养2W后的扫描电镜(SEM)照片。

图9是胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于组织工程皮肤构建，气液界面培养2W，HE染色照片200x。

图10是不含纤维蛋白胶的胶原-壳聚糖多孔支架用于组织工程皮肤构建，浸入培养1W，HE染色照片200x。

图11是不含纤维蛋白胶的胶原-壳聚糖多孔支架用于组织工程皮肤构建，气液界面培养2W，HE染色照片200x。

图12是不含纤维蛋白胶的胶原-壳聚糖多孔支架用于组织工程皮肤构建，气液界面培养3W，HE染色照片200x。

图13是胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于组织工程复合皮肤构建，气液界面培养1W后，HE染色照片40x。

图14是胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于组织工程复合皮肤构建，气液界面培养3W后，HE染色照片100x。

图15是胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于组织工程复合皮肤构建，气液界面培养3W后，HE染色照片400x。

                         具体实施方式

实施例1

胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架组织形态观察。

将胶原和壳聚糖分别溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量(按重量)为10％，搅拌均匀；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后置冻干机中冻干24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，置于摩尔浓度比为2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液中交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。将胶原-壳聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上；将纤维蛋白原(原浓度为80mg/ml)用DMEM培养基配成浓度为40mg/ml；将纤维蛋白原溶液以50ul/cm²的量均匀涂覆在已消毒的胶原-壳聚糖多孔支架表面，再以等量(体积)的凝血酶(300IU/ml)滴加在其上，室温或37℃温箱静置30分钟，多孔膜材料表面形成固态的纤维蛋白胶，获得胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架。

将制备的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架置于福尔马林溶液中固定，做石腊包埋HE染色。见图1、图2(箭头示纤维蛋白胶嵌入胶原-壳聚糖多孔材料内部，形成类似钉突样锚定结构)。

实施例2

胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架扫描电镜下的超微结构观察。

将胶原和壳聚糖分别溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量(按重量)为10％，搅拌均匀；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后置冻干机中冷干24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，置于摩尔浓度比为2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液中交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。将胶原-壳聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上；将纤维蛋白原(原浓度为80mg/ml)用DMEM培养基配成浓度为40mg/ml和8mg/ml，将凝血酶(原浓度为600IU/ml)用DMEM培养基配成浓度为300IU/ml和60IU/ml；将纤维蛋白原溶液以50ul/cm²的量均匀涂覆在已消毒的胶原-壳聚糖多孔支架表面，再以相应浓度的等量(体积)的凝血酶滴加在其上，室温或37℃温箱静置30分钟，多孔膜材料表面形成固态的纤维蛋白胶，获得胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架。

将制备的胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用乙醇梯度脱水后，饿酸固定，临界点干燥，做扫描电镜。镜下可见胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架有两种不同的孔径，由纤维蛋白胶和胶原-壳聚糖多孔材料浅层所构成的表皮面层，孔径在5um-20um，而由胶原-壳聚糖多孔材料构成的真皮面层，孔径在80um-150um。见图4，图5，图6，图7。(箭头示表皮面层的孔隙结构)。

实施例3

胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架细胞相容性的研究

将胶原和壳聚糖分别溶于0.5mol/L的乙酸溶液中，配置浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量(按重量)为10％，搅拌均匀；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后置冻干机中冻干24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，置于摩尔浓度比为2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液中交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。

将胶原-壳聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上。将培养的人真皮成纤维细胞消化后重悬，细胞计数，浓度调整到2×10⁶/ml，接种到胶原-壳聚糖多孔支架中，加入含10％胎牛血清和青、链霉素各100IU/ml的DMEM高糖培养基，浸没，置37℃，5％CO²饱和湿度孵箱中培养，每三天还一次液。一周后取出，转入另一六孔板中，置孵箱中放置30分钟，使材料表面略干燥后，在其上依次涂预先配置好浓度的纤维蛋白原和凝血酶溶液，再将其置于孵箱中30分钟，待纤维蛋白胶体形成之后再加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、链霉素的DMEM高糖培养液，放回孵箱继续培养。一周后取材做扫描电镜(SEM)。2.5％戊二醛固定后，乙醇梯度脱水，然后饿酸固定，临界点干燥，最后上镜观察。扫描电镜下可见成纤维细胞呈典型的长梭形，附着在支架纤维上生长，在细胞的周围有大量的细胞外基质分泌，体现了不对称支架良好的细胞相容性。见图8。(箭头示细胞外基质)

实施例4

胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于体外组织工程皮肤构建。

将胶原和壳聚糖分别溶于的0.5mol/L乙酸溶液中，配置浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量(按重量)为10％，搅拌均匀；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后置冻干机中冻干24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，置于摩尔浓度比为2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰亚胺混合溶液中交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。

将胶原-壳聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上.置孵箱中放置30分钟使材料表面略干燥后，在其上依次涂预先配置好浓度的纤维蛋白原和凝血酶，等待30分钟，纤维蛋白胶体形成后，将培养的表皮细胞以0.5×10⁶/cm²接种到纤维蛋白胶体的表面，加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、链霉素的DMEM高糖培养液浸没材料，置37℃，5％CO₂饱和湿度孵箱中培养，一周后改为气液界面培养。同样在没有涂纤维蛋白胶的胶原-壳聚糖多孔材料上接种相同浓度的表皮细胞，同样条件下培养作为对照。1、2、3周取材作组织切片，HE染色。见图9～图12。(箭头示纤维蛋白胶层)

实施例5

胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于体外组织工程复合皮肤构建。

将胶原和壳聚糖分别溶于的0.5mol/L乙酸溶液中，配置浓度为0.5％的胶原溶液和浓度为0.5％的壳聚糖溶液，将壳聚糖溶液加入胶原溶液中，其中壳聚糖的含量(按重量)为10％，搅拌均匀；采用冷冻-冻干法，于-20℃冷冻2小时，然后置冻干机中冻干24小时。冻干的胶原/壳聚糖支架于105℃的真空干燥箱中真空干热交联24小时，置于摩尔浓度比为2∶1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二业胺溶液(40mmol/l)和N-羟基丁二酰业胺混合溶液中交联24小时，用三蒸水反复漂洗后，再次冷冻-冻干获得交联的胶原-壳聚糖多孔支架。

将胶原-壳聚糖多孔支架置于75％乙醇中浸泡消毒30分钟，磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上。将培养的真皮成纤维细胞消化后浓度调整到2×10⁶/ml，将细胞悬液接种到胶原/壳聚糖多孔支架中，加入含10％胎牛血清和青、链霉素各100IU/ml的DMEM高糖培养基，浸没材料，置37℃，5％CO²饱和湿度孵箱中培养，每三天还一次液。一周后将材料取出，转入另一六孔板中，置孵箱中放置30分钟，使材料表面略干燥后，在其上依次涂预先配置好浓度的纤维蛋白原和凝血酶溶液，再将材料置于孵箱中30分钟，等待纤维蛋白胶体形成。之后将培养的表皮细胞以0.5×10⁶/cm²接种到纤维蛋白胶体的表面，再加入含10％胎牛血清，100IU/ml青、链霉素的DMEM高糖培养液浸没材料，放回孵箱培养，一周后改为气液界面培养。1、2、3周取材作组织切片。见图13，图14，图15。(箭头示表皮层嵌入真皮支架内部，形成指突样锚定结构)。