胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备及其在组织工程皮肤构建中的应用

摘要

目的:利用高分子生物材料胶原-壳聚糖和纤维蛋白胶制备适应组织工程皮肤构建的不对称支架,并探讨其用于体外组织工程皮肤构建的可行性. 材料和方法: 一.皮肤细胞的分离培养 1.人真皮成纤维细胞(Fbs)的培养取包皮环切术后的皮肤块,以组织块培养法分离出入真皮成纤维细胞,并传代培养,选择3-8代细胞作为工作细胞,用于组织工程皮肤构建. 2.人表皮细胞的培养选择由本院皮肤科馈赠的人角质形成细胞系(HaCaT),解冻复苏后加入DMEM(高糖,含10﹪胎牛血清,100U/ml青霉素,100U/ml链霉素)培养基,置于37℃,5﹪CO<,2>的饱和湿度孵箱中培养,2天换次液,传代培养. 二.胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的制备 将由牛跟腱中提取出的胶原和壳聚糖分别溶于0.5mol/L的乙酸溶液中,配制浓度为0.5﹪的胶原溶液和壳聚糖溶液,再将胶原溶液和壳聚糖溶液按质量比9:1混合均匀,注入模具;采用冷冻-冻干法,-20℃冷冻2小时后,置冻干机中冻干,得到胶原/壳聚糖,再将其置105℃真空干热处理24小时,再置于浓度比为2:1的1-乙基-3-3(二甲基胺丙基)-碳化二亚胺(EDAC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)混合溶液中交联处理24小时,用三蒸水反复漂洗后,再次冷冻-冻干便获得EDAC-NHS交联的胶原-壳聚糖多孔支架.将此种多孔支架置于75﹪乙醇中浸泡消毒过夜,磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗5次以上;将配好浓度的纤维蛋白原溶液以50μl/cm<'2>的量均匀涂覆在其表面,再以等量的凝血酶滴加在其上,室温或37℃温箱静置30分钟,获得胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架. 三.胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架的组织学和微结构观察 将纤维蛋白原(原浓度为80mg/ml)用DMEM培养基配成浓度为40mg/ml和8mg/ml,将凝血酶(原浓度为600U/ml)用DMEM培养基配成浓度为3001u/ml和60u/ml;将纤维蛋白原溶液以50ul/cm<'2>的量均匀涂覆在已消毒的胶原-壳聚糖多孔支架表面,再以相应浓度等量(体积)的凝血酶滴加在其上,室温或37℃温箱静置30分钟,待纤维蛋白原聚合成胶后,获得胶原一壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架.将制备的胶原.壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架置于10﹪中性福尔马林溶液中固定,石腊包埋,HE染色.同时留取标本,戊二醛和锇酸双固定后,临界点干燥,用作扫描电镜标本. 四.胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于体外组织工程皮肤构建 用上述方法制各胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架,将培养的表皮细胞以5x10<'5>/cm<'2>密度接种到此支架的表面,加入含10﹪胎牛血清,100U/ml青、链霉素的DMEM高糖培养液浸没材料,置37℃,5﹪CO<'2>饱和湿度孵箱中培养,2～3天换次液,3～7天后改为气液界面培养.同时在没有纤维蛋白胶层的胶原.壳聚糖多孔支架上接种相同浓度的表皮细胞,相同条件下培养作为对照. 五.胶原-壳聚糖/纤维蛋白胶不对称支架用于组织工程复合皮肤的构建 将制备的胶原.壳聚糖多孔材料置于75﹪乙醇中浸泡消毒30分钟,磷酸盐缓冲液(PBS)反复漂洗后,将培养的真皮成纤维细胞消化、离心后计数板计数,将细胞浓度调整到2x10<'6>/ml,将细胞悬液接种到胶原/壳聚糖多孔材料中,然后将材料一细胞复合物置于6孔板中,加入含10﹪胎牛血清和青、链霉素各100U/ml的DMEM高糖培养基(每孔3m1),浸没材料,置37℃, 5﹪CO<,2>饱和湿度孵箱中培养1周,每2～3天换次液.1周后将此材料一细胞复合物取出,转入另-6孔板中,置孵箱中放置30分钟使其表面略干燥,然后在其表面依次涂上预先配置好浓度的纤维蛋白原和凝血酶,再将其置于孵箱中放置30分钟,待纤维蛋白胶体形成后,将培养的表皮细胞消化、计数,以5x10<'5>/cm<'2>密度接种到此不对称支架的表面,再放回孵箱静置半小时,然后加入培养基浸没材料,继续培养,3～7天后转到自制的不锈钢网架上,作气液界面培养,2～3天换次液. 六.不对称支架中真皮成纤维细胞的活性检测 将接种了真皮成纤维细胞的不对称支架,置于DMEM(高糖,含10﹪胎牛血清,100U/ml青、链霉素)培养基中培养,隔2～3天换液,1周后取材做二乙酸荧光素(FDA)和碘化丙啶(PI)双染色,2周后取材做扫描电镜,观察细胞的形态变化、生长增殖、细胞外基质的分泌以及与支架材料的黏附情况. 七.构建的组织工程皮肤的组织学观察 将体外构建的组织工程皮肤予不同的时间点取材,10﹪中性福尔马林固定,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,浸腊,石蜡包埋,5μm切片,常规HE染色,光镜下观察并拍照. 八.免疫组化染色将构建的组织工程皮肤气液界面培养2周后取材,10﹪中性福尔马林固定,做石蜡切片,经脱腊、水化后,按迈新免疫组化试剂盒(Kit-9710)说明,做角蛋白10(CK-10)和广谱角蛋白(Pan-CK)免疫组化染色. 结论:本文将胶原-壳聚糖多孔支架和纤维蛋白胶相结合成功地制备出一种不对称支架,此种不对称支架具有的微观结构适合种子细胞的有序分布和生长,且生物相容性好,适应了组织工程皮肤构建的需要,有潜在的应用前景.

目录

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

综述 皮肤组织工程构建研究的新进展

在读期间发表论文

致 谢