一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料、制备方法及其在血脂吸附分离中的应用

摘要

本发明旨在提供一种表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜载体材料、制备方法及其应用。该聚合物多孔膜载体材料是以平均孔径为0.05～100μm的医用聚合物无纺布为出发原材料，通过60Coγ－射线共辐照接枝共聚丙烯酸表面改性后，进一步在所得多孔膜的基础上，借助1－(3－二甲氨基丙基)－3－乙基碳二亚胺(EDC)活化的羧基与生物相容性牛磺酸吸附配基的共价偶联，制备表面固定有通过脂蛋白与配基静电相互作用增强选择性吸附分离效果的多孔膜载体材料。本发明所提供的相关制备方法简便、安全、有效、易于大规模推广生产。并且所得吸附载体材料血液相容性良好，可以应用作为血浆脂质成分的吸附分离、临床高血脂症病人的血液动态灌流净化以及废弃血浆分离再生利用辅助材料。

说明书

技术领域

该发明提供了一种新型表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜载体材料、制备方法及其在血浆脂质成份吸附、分离中的应用。本发明所提供的聚合物多孔膜材料涉及临床高血脂症患者血液净化灌流治疗应用中的血浆脂质成份选择性吸附分离载体介质材料，属于生物医用材料以及医疗器械辅助材料领域。该发明所涉及的一种新型表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜载体材料，是由不同平均孔径尺寸的医用等级聚合物无纺布为制备原材料，经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸改性以及后续表面偶联固定牛磺酸吸附功能配基等系列制备过程得到。

技术背景

当前心脑血管系统疾病已经成为威胁人类健康最重要的三大主要疾病之一，据统计全球每年有800～1000万人死于心血管相关疾病。2006年发布的《中国心血管病报告2005》揭示目前我国每年死于心血管系统相关疾病的人数已达300万，累计已占所有临床疾病所导致患者死亡人数的45％左右。进一步分析发现这些死亡的病例导致死亡的直接诱因绝大部分是高血脂症伴生的动脉硬化。临床医学研究表明，高脂血症是诱发动脉硬化乃至冠心病和心肌梗塞的重要病理因素[New Eng.J.Med.，1990，322，1700]。同时，研究发现临床冠心病与患者血浆脂质成份中低密度脂蛋白(LDL)异常、浓度过高存在密切相关[Mayo Clin.Proc，1999，74，466]。通过临床治疗降低患者血浆脂质成份中过高的低密度脂蛋白(LDL)浓度能够显著改善心脑血管系统的血液流变性[New Eng.J.Med.，1995，333，1301]。因此，美国国家胆固醇教育计划最新指南指出，降低血浆脂质成份中过高的低密度脂蛋白(LDL)浓度已成为有效降低冠心病发病率的重要预防措施。特别是对于在临床治疗中，单纯通过患者的膳食控制或者药物治疗难以取得明显效果的严重遗传性高胆固醇血脂症患者，如何开发更为有效的降低血浆有害脂质成份的临床治疗方法显得非常紧迫。

最近几十年来的临床医学与生物医疗器械技术的研究发展表明，研究、开发血液相容性良好、血浆脂质成份吸附选择性优异、水基介质中稳定、易于在血液净化器械中使用并且制造成本低的净化生物材料成为主要技术发展方向。为了快速降低高血脂症患者血液中过高的低密度脂蛋白(LDL)浓度，血液净化技术发展早期经常采用血浆交换(Plasma Exchange)与双重滤过法(Double-Filtration Plasma Pheresis)。在此基础上，后来继续发展出现了免疫吸附(Immuno Adsorption)、肝素诱导沉淀法(HELP)等新的临床医学治疗方法。但是在血液净化实际应用中发现可能诱导患者的免疫反应以及严重的过敏反应，带来临床治疗风险，同时存在净化过程操作复杂、净化载体材料与相关辅助器械制造成本过高等问题。目前在临床上较为成熟广泛应用的是磺化葡聚糖纤维素吸附法，然而依然存在吸附分离载体材料纤维素微珠强度低、耐压不足、临床治疗费用昂贵等现实缺点，促使生物材料研究者继续研究探索新的吸附分离载体材料和相关配套器械。

作为重要的血液净化载体材料，最为广泛应用的是高分子凝胶体系、表面改性聚合物微球体系以及多孔聚合物纤维体系，相比较利用多孔膜吸附分离的技术报道不多。美国专利报道了系列经过聚丙烯酸表面改性制备微孔纤维聚砜膜吸附分离低密度脂蛋白(LDL)的吸附载体材料以及相关应用[US Patents 5496637、5187010、5236644、5258149]。但是上述专利所提供的微孔纤维聚砜膜的制备过程复杂，制备条件要求高，并且制备过程中需要大量使用有机溶剂。同时，为了更好地表面固定丙烯酸，制备过程中需要加入致孔剂，这些可能导致血浆灌流净化应用中产生意外不良反应。日本专利[特開平6-178807，特開平6-237997，特開平5-301043]报道了采用涤纶(PET)无纺布为原材料，通过后续高能电子射线辐射，在无纺布表面接枝共聚合丙烯酸，继续借助一定长度的手臂试剂偶联对血浆脂质成份低密度脂蛋白(LDL)具有特异性亲和力的活性分子，如某些短链的寡肽、葡聚糖硫酸酯等，从而最终制备得到系列低密度脂蛋白(LDL)的吸附剂。上述血液净化吸附分离材料尽管动态灌流吸附实验结果良好，但制备所采用的高能电子辐射设备昂贵，并且表面接枝共聚合丙烯酸的接枝率偏低，亲和性吸附配基的合成以及在无纺布表面的偶联固定反应过程复杂，因此距离作为临床血液净化材料的实际应用要求存在较大差距。

另一方面，牛磺酸是目前已知的一种生物相容性好的天然化合物，是由半胱氨酸衍生的β-氨基磺酸(结构式为HSO₃CH₂CH₂NH₂)，广泛存在于人体及哺乳动物组织细胞内，对维持人和动物正常的生理功能具有重要意义。近年来，国内外围绕牛磺酸防治心血管疾病已经开展了广泛的研究，已经初步证明它具有临床降血脂的效果[日本药理学杂志，2004，23(5)：311～317]。作为人体必需的氨基酸，牛磺酸生理毒性小、价格低、无抗原性、可以人工合成，因此国内已经报道将其应用于制备治疗高血脂症的吸附剂[高分子学报，1999，(6)：662～667]，探讨了交联聚乙烯醇水凝胶表面接枝牛磺酸后对低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、甘油三酯(TC)的吸附性能。研究发现牛磺酸作为吸附配基对LDL、TC具有较好的选择性吸附能力。另外，上述制备过程需要使用二甲基亚砜等有机溶剂，制备所得凝胶载体中是否残留有毒有机溶剂等问题有待临床进一步考查。

发明的内容

本发明的目的是提供一种新型表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜材料，以应用于血液净化动态灌流中选择性地吸附、分离低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及过高的总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)。

本发明还将提供上述新型表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜材料的制备方法。以水不溶性、生物稳定性良好的系列平均孔径的医用等级聚合物无纺布为原材料，通过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸表面导入亲水性、负电性羧基官能团以后，进一步通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)催化的化学偶联牛磺酸吸附配基的反应，最终制备得到具有负电性羧基官能团以及牛磺酸配基的血浆脂质成份吸附、分离多孔载体材料。

本发明的另一目的是提供上述新型表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜材料的用途，应用于血液净化动态灌流中选择性地吸附、分离血浆有害脂质成份低密度脂蛋白(LDL)、极低密度脂蛋白(VLDL)以及过高的总胆固醇(TC)与甘油三酯(TG)。本发明所提供的表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜材料的吸附机制在于综合利用基于低密度脂蛋白(LDL)生物结构模型的静电吸引力(即LDL的表面正电性载脂蛋白B结构部分与多孔吸附载体材料的负电性羧基以及磺酸基)，也就是偶联的牛磺酸吸附配基的磺酸根以及聚合物多孔膜载体剩余的负电性羧基基团能够促进吸附载体与LDL载脂蛋白B所带正电荷的静电相互吸引作用，提高综合吸附分离能力以及多种脂蛋白(高密度脂蛋白HDL、低密度脂蛋白LDL、极低密度脂蛋白VLDL)的吸附选择性。由于本发明所提供的一种新型血浆脂质成份吸附分离多孔膜材料载体制备中采用的丙烯酸与牛磺酸配基已经被大量实验证明具有良好生物相容性、血液相容性及血浆脂质成份选择性结合亲和力，并且采用了比较便利的⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合改性技术。因此，本发明将提供一种新型生物安全、血浆脂质成份高效分离、生物相容性良好、制造成本价廉的载体材料。本发明提供的新型载体材料将有可能应用于由于血浆脂质成份如低密度脂蛋白LDL等异常偏高所诱发的冠心病、动脉粥样硬化等临床患者的血液净化治疗。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料、制备方法及其在血脂吸附分离中的应用。本发明的表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜载体材料是一种经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸的亲水改性的水不溶性医用聚合物无纺布，再经表面共价偶联固定牛磺酸吸附配基获得的表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料。

上述的辐照接枝共聚丙烯酸改性的无纺布是以平均孔径为0.05～100μm的水不溶性医用等级聚合物无纺布，经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸，丙烯酸的接枝率为5～150重量％，膜表面羧基官能团的含量为10～200μmol/cm²。

所述的医用等级聚合物无纺布是医用涤纶无纺布或者医用聚丙烯无纺布等，平均孔径为0.05～100μm，采用材质为每平方厘米5～30毫克。

所述的⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸改性的水不溶性医用聚合物无纺布改性过程中，采用丙烯酸单体水溶液的浓度为1～50wt％，阻聚剂硫酸亚铁用量为0.1～3.0wt％，催化剂无机酸的浓度为[H⁺]＝0.1～5.0M。

本发明的表面固定牛磺酸的多孔膜载体材料是在⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸表面亲水改性的基础上，进一步通过1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)活化多孔膜材料表面羧基后，共价化学偶联固定所述牛磺酸吸附配基于多孔膜载体。

上述制备过程中所采用的无纺布出发材料的可能材质规格为每平方厘米5～30毫克，比较理想的为每平方厘米5～20毫克，最理想的为每平方厘米8～15毫克。平均孔径可能的范围为0.05～100μm，比较理想的平均孔径尺寸为0.05～20μm，比较适合吸附、分离应用的平均孔径是0.1～10.0μm。

上述系列不同平均孔径的医用等级无纺布原材料，首先经过预先裁剪、加工成5.0cm×5.0cm²尺寸的样品。然后依次顺序在丙酮溶液、高纯水溶液中运用超声波清洗15～30分钟，取出真空干燥至恒重备后续制备工序使用。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸吸附配基的聚合物多孔膜材料的制备方法，将上述经过超声波清洗、干燥所得的不同材质规格、不同平均孔径尺寸的聚合物无纺布试样浸泡于一定浓度的丙烯酸溶液中，采用⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合方法，制备接枝共聚丙烯酸改性的系列多孔膜吸附载体材料。

上述⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合丙烯酸过程中，丙烯酸水溶液单体浓度应用可能的范围是1～50wt％，可以避免溶液中丙烯酸发生明显竞争性自聚反应的比较理想的丙烯酸水溶液浓度为1～30wt％，应用效果最理想的丙烯酸水溶液单体浓度为5～20wt％。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料的制备方法，采用⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸制备改性样品过程中，为了有效地防止水溶液中丙烯酸单体的自聚合，提高载体材料表面的接枝率，因此需要在丙烯酸溶液中加入合适的阻聚剂，可能的阻聚剂是硫酸亚铁盐、氯化亚铁、摩尔盐等。以常用的硫酸亚铁为例，丙烯酸水溶液中接枝共聚合改性应用可能的阻聚剂浓度范围是0.1～3.0wt％，相对接枝共聚合效果比较理想的阻聚剂浓度为0.5～1.5wt％。

同时，上述共辐照接枝共聚合过程中，催化剂能够促进该发明所提供的一种表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料的⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸的效率。一般常用催化剂为无机质子酸，如硫酸、亚硫酸、硝酸、盐酸和磷酸等，以硫酸催化剂为例，能够有效的浓度是0.1～5.0wt％，比较理想的浓度为0.5～1.0wt％。

上述不同材质规格、不同平均孔径尺寸的聚合物无纺布原材料，在⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合过程中，经过含有上述浓度丙烯酸单体、阻聚剂、催化剂的水溶液浸泡16～24小时后，置于⁶⁰Coγ-射线辐射场中，通过辐照剂量的控制，制备系列接枝率的共聚丙烯酸改性多孔膜载体材料。⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚合制备过程发现，上述⁶⁰Coγ-射线应用可能的辐照总剂量范围是10～50KGY，考虑到经济性以及所得材料的综合性能，比较理想的辐照总剂量为20～30KGY。

上述聚合物无纺布原材料在含有丙烯酸单体、阻聚剂、催化剂的水溶液中浸泡过程中，无纺布原材料与浸泡水溶液的重量比为1∶100～300，以完全浸泡为宜。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料的制备方法，上述不同材质规格、不同平均孔径尺寸的聚合物无纺布原材料试样在⁶⁰Coγ-射线辐照接枝共聚丙烯酸后，从溶液中取出，用纯水反复洗净后真空干燥至恒重后得到系列规格、平均孔径以及接枝程度的聚丙烯酸改性聚合物多孔膜载体材料。通过接枝共聚合反应前后载体材料重量的变化，可以定量计算相应接枝率5～150wt％，通过酸碱滴定可以定量地测定多孔膜的羧基含量为10～200μmol/cm²。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的聚合物多孔膜材料的制备方法，为了有效提高制备所得载体的吸附选择性与吸附分离效率，将上述经过⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸改性的系列多孔膜载体材料表面进一步化学偶连可以通过正、负静电引力作用增强吸附、分离效果的牛磺酸吸附配基。

根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料的制备方法，为了在⁶⁰Coγ-射线共辐照接枝共聚丙烯酸改性所得的系列多孔膜载体材料表面羧基上共价偶联固定牛磺酸吸附配基，因此需要预先将共辐照接枝所得无纺布表面的羧基进行活化，其具体方法是：在80mL浓度为0.05～2M的氯化钠水溶液中加入1～20mM的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL)，进一步用稀盐酸溶液和稀氢氧化钠溶液调节所得混合溶液的pH值至2～6，继续在0～5℃中静置0.5～2h。然后将已经接枝共聚改性所得无纺布试样完全浸入上述水溶液中，以稀盐酸溶液和稀氢氧化钠溶液重新调节反应溶液的pH值至2～6，轻微磁力搅拌反应1～5h。随后将牛磺酸加入到适量0.01M浓度的氢氧化钠稀溶液中充分溶解后加入上述浸有聚丙烯酸改性的多孔膜的反应水溶液中，使反应水溶液中含有10～500mg/ml的牛磺酸，在0～5℃中，轻微磁力搅拌反应10～24h。反应结束后，用蒸馏水多次清洗所得多孔膜材料，然后用醇类有机溶剂抽提5～24小时，如采用甲醇索氏抽提24小时，干燥或真空干燥所得多孔膜材料备用。上述0～5℃的控制，以冰水浴最为简便。

上述过程中要严格按照要求控制反应溶液体系的pH值，这是因为一方面1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)催化多孔膜材料表面羧基与牛黄酸氨基反应的需要，另一方面也是为了降低反应物牛磺酸的羧基与氨基自身反应形成稳定的内盐结构的机会，提高牛磺酸的溶解度和实际接枝反应利用率。上述羧基活化方法中使用的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)的浓度为1～20mg/ml，比较理想的范围是2～10mg/ml；水溶液pH值可能的范围为2～6，比较理想的范围是3～5。

上述制备过程中，共辐照接枝共聚丙烯酸改性所得聚合物多孔膜载体材料、0.5～2M氯化钠、1～20mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)的pH＝2～6的水溶液、含有45mg～14g/ml牛磺酸的稀氢氧化钠水溶液的重量比为1∶80～160∶80～360∶20～40。上述反应物质混合以后，以稀盐酸或者稀氢氧化钠水溶液微调混合水溶液的pH＝2～6。其中，含有氯化钠、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺的水溶液控制pH＝2～6和含有10～500mg/ml牛磺酸更为重要。

本发明的优点

本发明所提供的一种表面固定牛磺酸吸附配基的多孔膜载体材料，可以应用于血液净化灌流以实现选择性地吸附、分离有害血浆脂质成份，具有如下优点：

(1)制备方法简单，工艺条件容易控制，生产重复性很好。整个生产工艺中几个关键参数是：辐射总剂量、单体溶液浓度、牛磺酸溶液的浓度和pH值，结果对其它参数不敏感，而这几个参数很容易被精确控制，所以试验重复性好，容易规模化生产。

(2)材料来源广泛，生产成本低。本发明涉及的主要材料是无纺布与丙烯酸，它们价格十分低廉，而且来源广泛，容易获得；其它材料如牛磺酸(0.5元/克)、EDC(6元/克)等用量很少，而且价格也都很普通。

(3)本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料，其血液相容性好，浸提液无急毒性，适合紫外以及γ-射线等常规医用消毒方法。

(4)根据本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料，其血浆脂质成份低密度脂蛋白(LDL)、总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的静态吸附能力达到比吸附分离前最高值下降37.3％、41.0％、63.4％。

(5)本发明所提供的一种表面固定牛磺酸配基的多孔膜材料应用前景广泛。不仅可能应用于临床高血脂症患者血液净化，同时可能应用于血液制品精加工产业，从不符合输血标准废弃人血浆中通过该发明所提供的吸附、分离载体材料以及相关分离辅助设备回收有用血浆，加工高附加值的血液制品。

具体实施方式：

以下通过实施例对本发明进行具体说明，将有助于对本发明的理解，但并不限制本发明的内容。实施例中所采用的化学分析方法具体说明如下：

(1)多孔吸附分离膜表面羧基含量的定量分析方法

取经过⁶⁰Coγ--射线共辐照接枝共聚合丙烯酸制备改性所得多孔膜试样一块(5×5cm²)，放入100ml容积的锥形瓶中，然后加入50mol/L浓度的NaOH溶液50ml，室温下静止浸泡24小时。提取浸泡液10ml，用已经标定浓度的盐酸溶液滴定，记录滴定终点时所用盐酸溶液的体积，并且每个试样滴定分析三次，取平均值。因此，多孔膜表面接枝丙烯酸羧基的含量可以通过以下公式计算得到：

$>>[>COOH>]>=>>>n>>(>Vi>->V>0>)>>>25>>\times >5>$

其中n为盐酸的浓度，V_i为试样滴定所用盐酸溶液的体积，V₀为未经丙烯酸接枝共聚合改性的多孔膜载体空白参照滴定所用盐酸溶液的体积。

(2)血浆低密度脂蛋白LDL浓度的分析方法

采用一步法(即酶法)分析，其原理为：人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下，除低密度脂蛋白LDL以外的其它脂蛋白与胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶等发生化学反应而被消除。当加入试剂R2后，其中的表面活性剂迅速发生作用，并释放LDL，并在酶作用下单一催化LDL-C反应，发生现色反应，其显色程度与血清中LDL-C含量成正比。

测定所用试剂的规格及成份：(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司  沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1：2*40ml  R2：2*10ml，校准液：1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)。

R1：由聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。

R2：由过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。

工作液配制：

试剂：R1：4ml与试剂R2：1ml混匀。

工作液在2～8℃可稳定3天。(最好使用前临时配制)。

测试程序：将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处紫外吸光度值，计算低密度脂蛋白LDL的含量

(3)高密度脂蛋白HDL浓度测定方法

采用一步法(即酶法)测定，其原理：人血清与试剂R1中的聚阴离子及聚离子反应，在表面活性剂的作用下于脂蛋白周围形成稳定的保护层，当加入试剂R2后，表面活性剂迅速释放HDL，并在酶作用下单一催化HDL-C反应，其显色程度与血清中高密度脂蛋白HDL-C含量成正比。

测定所用试剂的规格及成份：(试剂盒购自上海荣盛生物技术有限公司 沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1：2*40ml  R2：2*10ml，校准液：1*1ml(使用时1ml蒸馏水复溶)

R1：聚阴离子及胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、酚、过氧化氢酶、表面活性剂等组成。

R2：过氧化物酶、4-氨基安替比林、缓冲液及表面活性剂等组成。

工作液配制：4ml R1与1ml的R2试剂混匀，可在2～8℃下可稳定3天。(最好使用前临时配制)。

测试程序：将待测试样10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃中水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)的在546nm处的紫外吸光度值，由此计算高密度脂蛋白HDL的浓度：

(4)血浆总胆固醇TC浓度的测定方法

采用CHOD-PAP法，其原理：待测试样中游离及脂化的胆固醇，经下述反应产生醌亚胺，可用紫外分光光度计在500nm处测定其吸光度，根据吸光度的变化，计算血浆胆固醇的含量。

测定所用试剂的规格及成份：(上海荣盛生物技术有限公司  沪食药监械(准)字2005第2401199号)

R1(缓冲液)：2×25ml  R2(酶试剂)：2×25ml

校准液：(5.16mmol/l或200mg/dl)：1×1ml

PiPes：35mmol/L，胆酸钠：0.5mmol/L

胆固醇脂酶＞0.2U/ml，胆固醇氧化酶＞0.1U/ml

酚：28mmol/l，过氧化物酶＞0.8U/ml

4-氨基安替比林：0.5mmol/l，pH 7.0

工作液配制：缓冲液1份与酶试剂1份等量混匀，储存于2～8℃可稳定30天。

测试程序：将待测10μl加入lml工作液中，充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处的紫外吸光值，由此计算

总胆固醇mmol/l＝mg/dl×0.0258

(5)三酯TG浓度的测定方法

采用TRIGLYCERIDES KIT(酶比色法)法，其原理：待测样品中的甘油三酯经下述反应产生红紫色色素，可用紫外分光光度计定量测定。

测定所用试剂的规格及成份：(上海荣盛生物技术有限公司  沪食药监械(准)字2005第2401199号)

2×25ml

Pipes：45mmol/L；氯化镁：5mmol/L；过氧化物酶＞0.8U/ml；

脂蛋白酯酶＞100U/ml；ESBmT 3mmol/l；4-氨基安替比：0.75mmol/L；

3-磷酸甘油氧化酶＞4U/ml；甘油激酶＞1.5U/ml；ATP：0.9mmol/l，pH7.5.

测试程序：将待测样品10μl加入1ml工作液中充分混匀，37℃水浴10分钟后，以空白管(10μl蒸馏水加入1ml工作液)调零，分别读取样本管和校准管(10μl标准液加入1ml工作液)在500nm处紫外分光光度计吸光度值，由此计算甘油三酯TG的浓度：

甘油三酯mg/dl＝甘油三酯mmol/L×88.5

(6)表面全反射红外光谱ATR-FITR分析

将待测样品预剪成10mm×80ml的长条在付里叶变换红外光谱仪AVATAR-360上进行测试。

                              实施例1

将平均孔径0.10μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后，将上述试样浸泡于含丙烯酸单体10％(质量百分比)的水溶液中，溶液中另含有1.0wt％硫酸亚铁阻聚剂、0.5wt％硫酸催化剂，浸泡24小时后，将样品置于⁶⁰Coγ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量30KGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚接枝率为30wt％，相应所得多孔膜载体材料的表面羧基含量为25μmol/cm²，ATR-FITR红外光谱分析发现该试样在1700cm^-1处新出现一个很强的吸收带，是羧基官能团的特征吸收信号，表明丙烯酸已被成功接枝共聚合引入聚丙烯无纺布表面，得到聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

                              实施例2

将0.45μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5wt％的硫酸亚铁阻聚剂、1.0wt％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于⁶⁰Coγ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为20KGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为84wt％，定量滴定表面羧基含量为70μmol/cm²。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm^-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明84wt％接枝率、0.45μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

                              实施例3

将1.0μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15wt％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5wt％的硫酸亚铁阻聚剂、0.5wt％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于⁶⁰Coγ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为30KGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为75wt％，定量滴定表面羧基含量为96μmol/cm²。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm^-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明75wt％接枝率、1.0μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

                              实施例4

将5.0μm的医用聚丙烯无纺布裁剪成5cm×5cm²的试样，依次在丙酮和水中超声波清洗15～30分钟，真空干燥备用。然后将上述试样浸泡于含有15wt％丙烯酸单体的水溶液中。溶液中同时含有0.5％的硫酸亚铁阻聚剂、1.0wt％的硫酸催化剂，浸泡24小时候后，将样品置于⁶⁰Coγ-射线源辐射场中，控制累计辐照总剂量为30KGy。取出上述辐照处理试样后，洗净、干燥、称重并计算得到丙烯酸的共聚合接枝率为115％，定量滴定表面羧基含量为118μmol/cm²。ATR-FITR红外光谱分析发现在1700cm^-1处出现一个很强的吸收峰，对应于羧基的特征吸收信号，表明115％接枝率、5.0μm平均孔径的聚丙烯酸改性的聚丙烯无纺布多孔膜载体材料。

                              实施例5

在0.1mol/L的氯化钠水溶液中加入4mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用盐酸稀溶液和氢氧化钠溶液调节溶液的pH值到4.7，将三口瓶放于4℃的冰水浴中半个小时。将实例1无纺布浸入上述溶液中，同时将溶液pH值重新调节到4.7，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下反应4h。将含75mg/ml牛磺酸的稀NaOH溶液加入上述反应液中，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下继续反应24h。反应结束后，将牛磺酸固定的无纺布，用二次蒸馏水多次清洗，再用甲醇做抽提剂，索氏抽提24h，真空干燥，得到表面偶联固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料。

                              实施例6

在0.1mol/L的氯化钠水溶液中加入4mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用盐酸稀溶液和氢氧化钠溶液调节溶液的pH值到4.7，将三口瓶放于4℃的冰水浴中半个小时。将实例2无纺布浸入上述溶液中，同时将溶液pH值重新调节到4.7，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下反应4h。将含150mg/ml牛磺酸的稀NaOH溶液加入上述反应液中，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下继续反应24h。反应结束后，将牛磺酸固定的无纺布，用二次蒸馏水多次清洗，再用甲醇做抽提剂，索氏抽提24h，真空干燥，得到表面偶联固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料。

                               实施例7

在0.1mol/L的氯化钠水溶液中加入4mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用盐酸稀溶液和氢氧化钠溶液调节溶液的pH值到4.7，将三口瓶放于4℃的冰水浴中半个小时。将实例3无纺布浸入上述溶液中，同时将溶液pH值重新调节到4.7，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下反应4h。将含225mg/ml牛磺酸的稀NaOH溶液加入上述反应液中，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下继续反应24h。反应结束后，将牛磺酸固定的无纺布，用二次蒸馏水多次清洗，再用甲醇做抽提剂，索氏抽提24h，真空干燥，得到表面偶联固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料。

                              实施例8

在0.1mol/L的氯化钠水溶液中加入4mM 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，用盐酸稀溶液和氢氧化钠溶液调节溶液的pH值到4.7，将三口瓶放于4℃的冰水浴中半个小时。将实例4无纺布浸入上述溶液中，同时将溶液pH值重新调节到4.7，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下反应4h。将含300mg/ml牛磺酸的稀NaOH溶液加入上述反应液中，在4℃、轻微磁力搅拌的条件下继续反应24h。反应结束后，将牛磺酸固定的无纺布，用二次蒸馏水多次清洗，再用甲醇做抽提剂，索氏抽提24h，真空干燥，得到表面偶联固定牛磺酸吸附配基的多孔膜材料。

                              实施例9

将上述实施例5、6、7、8制备所得多孔膜载体材料剪成碎片，装入10ml样品瓶中，吸取6ml模拟生理溶液(pH＝7.4)将其充分溶胀，然后用注射器将样品瓶中的模拟生理溶液彻底抽干，加入2ml人血浆。然后密封在37℃下振荡3小时后，检测等温吸附前后LDL、HDL、TG、TC的变化情况，结果如下表所示(其中空白对照样是孔径为0.45μm，未接枝丙烯酸的聚丙烯无纺布)。

  吸附载体 LDL吸附量  (mg/g) HDL吸附量  (mg/g)  空白对照  (实施例2出  发原料)  实施例5  实施例6  实施例7  实施例8   14.1   16.9  23.9  35.7  36.1   10.0   18.2  18.6  18.9  18.8

                             实施例10

将采样于高血脂症患者的血浆5ml动态灌流经过装有6层实施例4所得的多孔膜载体材料吸附分离器，动态灌流速度1ml/min，灌流2小时后，血浆中的LDL的浓度由111.64mg/dl降低为33.71mg/dl、HDL的浓度由51.77mg/dl降低为35.41mg/dl、TC的含量由160.31mg/dl下降为74.30mg/dl、TG的含量由522.80mg/dl下降为313.38mg/dl。