太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法

摘要

本发明公开一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法，包括利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2－6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记；本发明用于做太平洋牡蛎种质资源和遗传多样性的分析，分子群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究，进一步用于太平洋牡蛎的育种和养殖。

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学DNA标记技术与应用领域，具体涉及海洋经济贝类太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)EST(Express Sequence Tag，表达序列标签)微卫星标记的筛选方法和应用。

技术背景：

太平洋牡蛎原产于日本、韩国、中国等地，是世界上养殖范围最广、产量最高的海洋贝类，也是我国重要的海水养殖种类之一。在我国，太平洋牡蛎养殖业主要分布于辽宁，山东，福建，广东等沿海地区。随着对太平洋牡蛎遗传多样性研究、遗传选育改良以及遗传图谱构建等研究工作的不断深入，对太平洋牡蛎分子标记的需求也越来越多。遗传改良或品种培育是太平洋牡蛎养殖稳定发展的动力，许多研究表明，遗传变异水平与生物的生长速度、抗病能力等生产性状密切相关，因此，开发太平洋牡蛎的分子遗传标记，检测太平洋牡蛎遗传多样性、研究其遗传结构，进而实施分子标记辅助选育，对于太平洋牡蛎的育种和养殖都具有十分重要的意义。

EST是指通过从cDNA文库中随机挑取的克隆，进行大规模测序所获得的cDNA的5’或3’端序列，长度一般为150-500bp。近年来大量快速增长的EST数据已成为SSR的重要来源，约有1-5％的EST含有SSR。与gSSR标记相比，从EST中获得SSR，建立EST-SSR标记更经济、更有特点；由于EST是功能基因的表达片段，在其中发现的微卫星标记会直接和功能基因相关，并有可能和一些生产性状相关联，这些特点对遗传图谱构建以及标记辅助选育都有很高的应用价值；同时，由于不同物种间基因共显性和保守性，从一种物种中开发的EST-SSR可能同时用于近缘的其他物种研究，从而为比较基因组学、同源基因克隆提供新的途径。因此，EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。利用EST微卫星标记，可能把太平洋牡蛎重要经济性状与之关联起来，达到分子标记辅助育种的目的，并可进一步进行太平洋牡蛎功能基因的研究。目前还未见关于太平洋牡蛎EST微卫星标记的研究报道。

发明的内容：

本发明的目的是提供一种太平洋牡蛎EST微卫星标记的筛选方法和应用。

本发明目的是这样实现的：首先利用GeneBank公布的太平洋牡蛎的ESTs的序列，利用微卫星检索软件SSRhunter进行微卫星位点的查找，对于2-6个碱基重复单元重复次数大于5的微卫星片断进行筛选分离，从而得到含有微卫星重复的ESTs序列；然后在微卫星重复序列两端的侧翼序列设计引物，并进一步检测优化引物成为微卫星标记；最后对微卫星标记的重复性、稳定性和多态性进行综合评价，得到微卫星标记。

从太平洋牡蛎ESTs序列进行太平洋牡蛎微卫星分析的步骤是从NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的序列，对2-6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离；采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。

对于太平洋牡蛎的ESTs设计引物，其设计引物参数为：(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。

对于太平洋牡蛎利用微卫星标记进行PCR扩增，其加样参数为：总体积20μl，其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5-2.5mM的Mg²⁺、Taq酶，模板量分别是50-100ng。

对于PCR产物的检测：扩增得到的产物用8-10％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，电压是1-8V/cm，电泳完毕之后用EB(溴化乙锭终，浓度0.5-0.6μg/m1)染色20-30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性。

在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物：Tm值在45-65℃之间；扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为：94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行30-35个循环。

本发明的应用：用于做太平洋牡蛎种质资源和遗传多样性的分析，分子群体遗传学、种质资源鉴定、遗传图谱的构建和功能基因的研究，进一步用于太平洋牡蛎的育种和养殖。

附图说明：

图1：Cg-e001 EST-SSR标记在群体中的扩增结果

图2：Cg-e018 EST-SSR标记在群体中的扩增结果

具体实施方式

实施例一：微卫星位点的筛选及其多态标记的确定。实验中所用的太平洋牡蛎均来自福建养殖群体。

1、微卫星位点的来源和微卫星序列的筛选

从NCBI(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)数据库搜集并下载(以FASTA格式)已有的EST序列，利用SSRhunter软件逐一查找分析所得的3390个序列，对2-6个碱基重复单元、重复次数大于5的微卫星DNA序列进行分离。采用软件DNAstar中的SeqMan对含有微卫星的ESTs进行聚类分析，选取聚类在不同contig中的ESTs设计引物。

2、微卫星标记引物的设计

在微卫星重复的侧翼序列利用引物设计软件Primer Premier 5.0和DNAstar中的Primerselect设计引物；引物要求满足以下条件：(1)引物长度为17-25bp；(2)GC含量要求大于40％；(3)退火温度大于40℃；(4)预期的PCR产物长度为100-300bp。

3、引物的优化

不同的引物根据不同的Tm值进行优化(Tm值上下10度左右)。扩增反应分别用MJ-100和BioRad-200 PCR仪，PCR程序为：94℃变性2分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20μl：其中含有正反向引物0.2μM、0.2mMdNTP(四种脱氧核苷酸的混合物)、1×PCR buffer、1.5-2.5 mM的Mg²⁺、Taq酶，模板量分别是50-100ng。模板是随机的5个太平洋牡蛎样本。扩增得到的产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳-EB染色系统进行检测，选取无或杂带少、特异性产物较高的PCR对应的温度作为最佳的退火温度，对应的Mg²⁺作为最佳Mg²⁺的浓度。

10×PCR buffer含有100mM Tris-HCL(三羟基甲基氨基甲烷-盐酸pH9.0)，500mM KCL(氯化钾pH9.0)，1％Triton X-100(曲拉通X-100)

4、微卫星位点的确定

根据上面筛选出来的Tm值和Mg²⁺选取20个个体检测这些微卫星标记的多态性。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30或者40秒，根据不同的退火温度退火30秒，72℃延伸30秒到1分钟不等，反应进行35个循环。反应体系为20μl：其中含有正反向引物0.2-1μM、0.2mM、1×PCR buffer、1.2-2.0mM的Mg²⁺、Taq酶，模板量分别是50-100ng。PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺电泳，电压是1-8V/cm，电泳完毕之后用EB(溴化乙锭终，浓度0.5μg/ml)染色30分钟，然后在凝胶成像系统下观察记录成像结果，分析确定多态性，最后筛选出9个位点作为太平洋牡蛎微卫星标记，这些标记的具体信息如表一。

表一.开发获得的9个太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的EST-SSR标记

  位点名称 引物序列(5‘-3’) GenBank 注册号 退火温度 Tm  重复单元  功能  Cg-e001  Cg-e002  Cg-e003  Cg-e004  Cg-e006  Cg-e018  Cg-e019  Cg-e020  Cg-c022 F：TTAACAAGAAAGAAAACGAAGAAA R：TGTATGGACGCCCGCAGAA F：TCGACACAGGATGGATGC R：ATGGATTTAAGACTTCTGACACTG F：GTGAATGTACAAAGAATGGT R：GTAAACAAAACAATCAAGTAAAAA F：GGACCCCCACCTTACTATGC R：GTGTCCGAACCCGAAACCA F：TCTAACAAAACCCCGACTG R：CGTGATGGCAAAAAGAAG F：AACAACAACATGGAAACACCT R：TCAACAAAGAAACACATCCTG F：GAGGGCAAGATCAAAGTAGAAA R：ATGCCCAATCACAAGACA F：GATTCAGCATTTCAAAGATACCC R：ACCTCCTGTTCCCCCTGTT F：CCTTCCTCTCATCATCATCATCAC R：GAAGAGGGAAGAGGAGGAGAAGA BG467434 BQ426912 AJ565533 BQ426867 CX068956 BQ426922 AJ565768 CK172355 CX069289 50 50 51 50 45 50 48 50 55  (TTTC)⁵  (TATT)⁵  (TAT)⁵  (ACC)⁵  (TCT)⁶  (CT)¹⁸  (AGA)⁵  (GAA)⁵  (TCA)⁵  Transmembrane  rcccptor  MHC class I  Unknown mRNA  VrrB mRNA  unidentified  Unknown mRNA  Full-length cDNA  LRNA splicing 2′  phosphotransferase 1  calreticulin

实施例二：应用实例

1、提取太平洋牡蛎的DNA

本实验所取的太平洋牡蛎材料是随机提取13个DNA样品，从冷冻的肌肉组织中提取DNA。剪取100mg肌肉组织，剪碎后置于0.7ml的抽提缓冲液(6M Urea(尿素)，10mMTris-HCI.125mM NaCI(氯化钠)，1％SDS(十二烷基肌硫酸钠)，10mM EDTA(乙二胺四乙酸)，pH＝7.5)中，加入终浓度为0.1mg/ml的蛋白酶K(20mg/ml)，37℃消化一夜。用苯酚∶氯仿(1∶1)抽提反应物三次，提取上清液用等体积的氯仿抽提一次。取上清液用异丙醇进行沉淀，然后溶解于5001μl×TE(10mM Tris.HCI，1mM EDTA，pH＝8.0)中。用RNase(20μg/ml)37℃处理DNA样品1小时，然后用苯酚/氯仿提取液进行DNA纯化用苯酚/氯仿抽提一次、氯仿抽提一次。然后提取上清液加入两倍体积的无水乙醇和十分之一倍体积的3M NaAc(醋酸钠)，摇匀之后12000rpm离心收集DNA，再用70％乙醇洗涤两次，待乙醇完全蒸发之后，加入50μl1×TE于-20℃保存待用。

2、PCR扩增

PCR的反应条件是：50ng太平洋牡蛎基因组DNA，引物1μM、0.2mMdNTP、1×PCRbuffer、1.5mM的Mg²⁺、Taq酶。PCR的反应程序是94℃变性10分钟之后进入循环，94℃变性30，Tm退火30秒，72℃延伸1分钟，反应进行35个循环。4℃保存PCR产物。

3、电泳检测

PCR扩增产物用8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压是8V/cm，电泳完毕之后用EB(终浓度是0.5μg/ml)染色30分钟，在凝胶成像系统下观察记录成像结果如图1、图2所示。