抗组蛋白H1单克隆抗体及用于产生其的杂交瘤

摘要

本发明公开了用于器官移植中抑制、预测或诊断移植排斥反应的抗组蛋白H1单克隆抗体、用于产生其的杂交瘤和多肽。

说明书

相关申请的交互参考

本申请要求先前2004年9月3日申请的日本专利申请号2004-257528的优先权，其中所述日本专利申请号2004-257528以其全部公开内容引入本文作为参考。

发明背景

发明领域

本发明涉及抗组蛋白H1单克隆抗体、用于产生其的杂交瘤和抗组蛋白H1抗体特异识别的多肽。更加具体地，本发明涉及对于在器官移植中抑制、预测或者诊断移植排斥反应有用的单克隆抗体、产生其的杂交瘤和多肽。

背景技术

在器官移植的医疗中，为了抑制器官移植后的移植排斥反应，到目前为止已经使用了多种免疫抑制剂。该类免疫抑制剂的实例包括他克莫司(FK506)和环孢菌素A(Jpn J Pharmacol，71，89-100，1996)。然而，常规的免疫抑制剂具有诸如强副作用的问题，其中所述强副作用包括促进癌细胞生长和抑制骨髓功能、感染以及需要长期服药(Transplantation，58，170-178，1994)。

此外，通常难以估计中止使用免疫抑制剂的时间。例如，经移植的组织在未持续施用免疫抑制剂时有时会存活。在这种情况下，如果不经意地继续施用免疫抑制剂，那么就会可能仅因为其毒性而对患者造成损害。在另一方面，存活的组织也有可能由于中止施用免疫抑制剂而变得受排斥。在这种情况下，排斥反应通常不能通过重新施用免疫抑制剂而避免。

在另一方面，进行了多种关于器官移植的研究。例如，在同位肝移植(OLT)体系中，已经报道，当将具有高移植存活率的供体DA大鼠肝(MHC单元型，RT1a)移植进入受体PVG大鼠(RT1c)时，移植物存活而不需要施用免疫抑制剂(Transplantation，35，304-311，1983)。

此外，据报道，将移植了DA大鼠肝的受体PVG大鼠的血清(OLT后血清)于手术前单次施与产生了移植排斥反应的组合的移植模型体系，可抑制移植物的排斥反应(J.Surg.Res.，80，56-61，1998)。

此外，已经公开了，通过在手术后向总是产生移植排斥反应的DA大鼠(RT1a)和LEWIS大鼠(RT1l)心移植体系中(活体内)施用抗组蛋白H1多克隆抗体可抑制移植排斥反应，并使受体存活(Transplantation，77，1595-1603，2004)。

此外，一些本发明者公开了通过使用来自移植后早期阶段PVG大鼠的血清使混合淋巴细胞反应(MLR)受到抑制，并且抗组蛋白H1抗体具有MLR抑制活性(特开2004-149507号公报)。

但是，仍然期待研制出能够抑制器官移植中的移植排斥反应、并在安全性及其免疫抑制活性上优良的新型免疫抑制剂。此外，由于需要监视患者的预后或者需要在器官移植中防止不必要地施用免疫抑制剂，所以也期待研发出具有优良的预测或者诊断移植排斥发生准确度的新型药物。

发明概述

本发明者现在已发现具有显著免疫抑制活性、并且在抑制、预测以及诊断移植排斥反应中有用的抗组蛋白H1单克隆抗体及产生这种抗体的杂交瘤。此外，本发明者发现上述抗组蛋白H1单克隆抗体特异识别的特定氨基酸序列。本发明基于这些发现。

因此，本发明的目的是提供具有显著免疫抑制活性、并且在抑制、预测或诊断移植排斥反应中有用的抗组蛋白H1单克隆抗体以及产生这种抗体的杂交瘤。

此外，本发明的目的是提供包含被上述抗组蛋白H1单克隆抗体特异识别的特定氨基酸序列的多肽。

根据本发明的单克隆抗体识别组蛋白H1或存在于脾细胞细胞膜中的组蛋白H1样抗原。

此外，根据本发明的杂交瘤产生上述单克隆抗体。

此外，根据本发明的多肽包含被根据本发明的单克隆抗体识别的特定氨基酸序列。

根据本发明的单克隆抗体具有显著的免疫抑制活性和安全性，并且可以有利地用作优良的免疫抑制剂。此外，根据本发明的单克隆抗体具有针对哺乳动物中的自身抗原性蛋白质优良的特异性，其中所述自身抗原性蛋白质为移植排斥反应的指标，所以本发明的单克隆抗体可以有利地在哺乳动物器官移植中用来预测或者诊断移植排斥反应。

此外，由于当根据本发明的多肽用作抗原时其可以在生物体内诱导产生抗组蛋白H1抗体，所以所述多肽可以有利地用作免疫抑制剂。此外，根据本发明的多肽可以用来测定哺乳动物中产生的抗组蛋白H1抗体数量，因此其可以有利地用来在器官移植中预测或者诊断移植排斥反应。

附图简述

图1显示用包含抗组蛋白H1单克隆抗体的培养上清评估MLR抑制活性的结果。

发明详述

保藏

根据本发明的杂交瘤即杂交瘤1F5、杂交瘤3F2、杂交瘤15F11、杂交瘤17C2和杂交瘤16G9最初已于2004年8月19日分别以保藏号FERMABP-10409、FERM ABP-10410、FERM ABP-10411、FERM ABP-10412和FERM ABP-10413保藏于独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心(地址：日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6)。

单克隆抗体和杂交瘤

根据本发明的单克隆抗体识别组蛋白H1或脾细胞中的组蛋白H1样抗原。此外，根据本发明的单克隆抗体识别优选由SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列中的表位。此外，根据本发明的另一优选实施方案，抗组蛋白H1单克隆抗体识别包含由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ IDNO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列的多肽。所述多肽优选由大约12-150个氨基酸残基组成。此外，根据本发明的另一优选实施方案，抗组蛋白H1单克隆抗体识别由SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列组成的多肽。此外，根据本发明的另一优选实施方案，抗组蛋白H1单克隆抗体通过一种或多种选自杂交瘤1F5、杂交瘤3F2、杂交瘤15F11、杂交瘤17C2和杂交瘤16G9的杂交瘤产生。

术语“组蛋白H1”指的是存在于真核细胞中并且结合核小体连接DNA以形成核小体的碱性蛋白质。该组蛋白H1的实例包括来自人并且包含SEQ ID NO：1代表的氨基酸序列的组蛋白H1、来自牛并且包含SEQ IDNO：2代表的氨基酸序列的组蛋白H1以及来自小鼠并且包含SEQ ID NO：3代表的氨基酸序列的组蛋白H1。

术语“组蛋白H1样抗原”指的是脾细胞细胞膜中被由杂交瘤1F5、杂交瘤3F2、杂交瘤15F11、杂交瘤17C2或杂交瘤16G9产生的单克隆抗体识别的抗原。这种组蛋白H1样抗原优选组成在SDS-PAGE上具有31kD分子量的蛋白质的部分。该组蛋白H1样抗原的实例为具有至少部分来自哺乳动物组蛋白H1的氨基酸序列的蛋白质。

此外，根据需要，根据本发明的单克隆抗体可以是嵌合抗体、人源化抗体或完全的人源化抗体。更加具体的实例包括其中将小鼠单克隆抗体的抗原结合结构域Fv备选地引入人抗体的嵌合抗体(Morrison，S.L.，Oi，V.T.，“Immunoglobulin Genes”Academic Press(London)，260-274(1989))和其中使用CDR移植技术将互补决定区(COR)嵌入人抗体框的人源化抗体，所述互补决定区为直接参与小鼠单克隆抗体抗原结合的Fv结构域上的序列(Roguska，M.L.等人，Humanization of murine monoclonalantibodies through variable domain resurfacing，Proc.Natl.Acad.Sci.美国，91，969-973(1994))。此外，完全的人源化抗体的实例包括通过移植了人抗体基因的TransChromo小鼠产生的抗体(Tomizuka，K.等人，Functional expression and germline transmission of a human chromosomefragment in chimaeric mice，Nature Genet.，16，133-143(1997))、或由人抗体噬菌体文库产生的抗体(Winter，G等人，Making antibodies by phagedisplay technology，Ann.Rev.Immunol.，12，433-455(1994)；Griffiths，A.D.等人，Isolation of high affinity human antibodies directly from largesynthetic repertoires，EMBO.J.，13，3245-3260(1994))。

此外，根据本发明的另一实施方案，提供了杂交瘤1F5、杂交瘤3F2、杂交瘤15F11、杂交瘤17C2和杂交瘤16G9。

根据本发明的单克隆抗体和杂交瘤可以例如如下制造。即，首先，通过使用组蛋白H1或组蛋白H1样抗原或包含其表位的多肽作为致敏抗原、将免疫了该致敏抗原的哺乳动物的浆细胞(免疫细胞)与哺乳动物骨髓瘤细胞融合、克隆所得杂交瘤、并从中筛选期望的杂交瘤来获得根据发明的杂交瘤。根据本发明的单克隆抗体可以通过培养根据本发明的杂交瘤以便回收由其产生的抗体来获得。

用作致敏抗原的包含组蛋白H1或组蛋白H1样抗原或其表位的多肽可以得自例如人白血病骨髓细胞、人子宫颈癌Hela细胞、牛胸腺、牛肝脏、鸟红细胞等。如在PBS或生理盐水中悬浮这种致敏抗原，并将悬浮物根据需要与佐剂例如FCA(弗氏完全佐剂)和KLH(匙孔血蓝蛋白)一起用来免疫哺乳动物。

该技术领域中的常规施用方法都可以用来作为免疫哺乳动物的方法。施用方法的特定实例包括腹膜内注射、脾内注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜施用和经皮施用，优选腹膜内注射和脾内注射。施用致敏抗原的间隔根据致敏抗原的剂量、哺乳动物的种类等来适当地确定，例如其可以一个月施用数次。

虽然待免疫的哺乳动物不具体限制，但考虑它们与细胞融合中所用骨髓瘤的兼容性而进行优选；实例包括小鼠、大鼠和仓鼠，优选小鼠。

此外，优选用脾细胞作为免疫细胞。

本发明中所用的骨髓瘤细胞的实例包括P3(P3X63Ag8.653)(J.Immunol.，123，1548，1978)、p3-Ul(Current Topics in Microbiology andImmunology，81，1-7，1978)、NS-l(Eur.J.Immunol.，6，511-519，1976)、MPC-11(Cell，8，405-415，1976)、Sp2/0-Ag14(Nature，276，269-270，1978)、FO(J.Immunol.Meth.，35，1-21，1980)、S194(J.Exp.Med.，148，313-323，1978)和R210(Nature，277，131-133，1979)，优选P3或p3-Ul，并且更加优选P3。

免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合可以例如根据Milstein等人的方法(Methods Enzymol.，73，3-46，1981)进行。更加具体而言，细胞融合可以例如通过在存在融合促进剂的培养基中混合免疫细胞和骨髓瘤细胞来进行。在细胞融合中，杂交瘤可以通过适当地重复加入培养基和离心来产生。

用于细胞融合的培养基可以是例如通常用于细胞融合的培养基，例如RPMI-1640培养基和MEM培养基。此外，血清补充液(serumsupplements)例如胎牛血清(FBS)可以适当地一起使用。

此外，细胞融合优选在25-37℃、更加优选在30-37℃进行。

骨髓瘤细胞和免疫细胞的混合比率优选大约1∶1至1∶10。

融合促进剂的实例包括聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)，优选PEG。PEG的分子量可以适当选择；例如，PEG的平均分子量可以为大约1,000-6,000。此外，培养基中的PEG浓度优选为大约30-60％(W/V)。

此外，如果需要的话，可以适当地向培养基中加入辅助试剂，例如二甲基亚砜。

根据本发明的杂交瘤的筛选可以通过在常规的选择培养基例如HAT培养基中培养由细胞融合获得的杂交瘤、并通过常规的有限稀释法、例如用对组蛋白H1的抗体效价作为指标进行筛选来进行。在HAT培养基中培养的时间是足以杀死除靶杂交瘤之外的细胞(非融合细胞)的时间，并且通常可以是几天至几周。如此获得的根据本发明的杂交瘤可以在常规培养基中传代培养，并且可以在液氮中长时间储存。

此外，回收根据本发明的单克隆抗体的方法实例包括通过常规方法培养杂交瘤来从所得培养上清中获得单克隆抗体的方法以及将杂交瘤施与可兼容的哺乳动物进行增殖来从该哺乳动物腹水(abdominal fluid)中获得单克隆抗体的方法。优选前一种方法来获得高纯度的抗体，而优选后一种方法来产生大量抗体。

此外，根据本发明的单克隆抗体可以用盐析法、凝胶过滤法、亲和层析法等纯化为高纯度。

根据本发明的单克隆抗体具有如上所述的显著免疫抑制活性。根据本发明的单克隆抗体可以原样地用作免疫抑制剂；此外，其也可以与可药用载体等一起用作药物组合物，尤其是用作抑制免疫的组合物。因此，根据本发明的实施方案，提供了包含根据本发明的单克隆抗体作为活性成分的抑制免疫的组合物。根据本发明的另一实施方案，还提供了根据本发明的单克隆抗体在制备抑制免疫的组合物中的用途。

根据本发明的抑制免疫的组合物可以用于治疗和预防器官移植例如心脏、肾、肝、骨髓和皮肤移植中的移植排斥反应，进一步可以用来治疗和预防自身免疫疾病。根据本发明的抑制免疫的组合物可以通过例如在注射用生理盐水、注射用蒸馏水、注射用缓冲溶液等中溶解根据本发明的单克隆抗体来制备。此外，根据本发明的抑制免疫的组合物可以包含适当的溶剂、增溶剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、止痛剂、等渗剂、缓冲试剂、填充剂、增稠剂、着色剂以及已知的载体(例如多种脂质体、聚氨基酸载体、合成的多聚体、天然的多聚体)。

根据本发明的抑制免疫的组合物可以全身或者局部施用。施用方法的特定实例包括滴注、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经口施与、经粘膜施与、经皮施与。因此，根据本发明的另一实施方案，提供了治疗需要抑制免疫的哺乳动物的方法，其中包括向哺乳动物施用治疗有效量的根据本发明的单克隆抗体。根据本发明的单克隆抗体的剂量取决于病症和哺乳动物的年龄等等；然而，一般地，其可以在单次或几次分开剂量中施用0.05-40毫克/千克体重/天、优选0.1-1.0毫克/千克体重/天的剂量。此外，施用可以是单次或者例如重复超过四周。

此外，由于根据本发明的单克隆抗体特异地与自身抗原性蛋白质起作用，其中所述自身抗原性蛋白质是器官移植后移植排斥反应的指标，所以其可以用来预测或诊断哺乳动物中的移植排斥反应。此处的自身抗原性蛋白质表示存在于哺乳动物中、并且优选被杂交瘤1F5、杂交瘤3F2、杂交瘤15F11、杂交瘤17C2或杂交瘤16G9产生的单克隆抗体识别的蛋白质。因此，根据本发明的另一实施方案，提供了在哺乳动物中预测或诊断移植排斥反应的组合物，其包含根据本发明的单克隆抗体作为活性成分。可以根据需要向上述组合物中加入可药用载体。此外，上述移植排斥反应优选为器官移植后发生的移植排斥反应，更加优选为中止施用免疫抑制剂后发生的移植排斥反应。此外，根据本发明的另一实施方案，提供了根据本发明的单克隆抗体作为在哺乳动物中预测或诊断移植排斥反应的试剂的用途。此外，根据本发明的另一实施方案，提供了在哺乳动物中预测或诊断移植排斥反应的方法，其中包括测定得自哺乳动物的生物学样品和根据本发明的单克隆抗体之间的免疫反应性水平。在上述方法中，当所测定的免疫反应性水平高于预先根据患有移植排斥反应的哺乳动物的生物学样品与根据本发明的单克隆抗体之间的免疫反应性水平设定的阀值时，就将移植排斥反应预测或诊断为高风险。这个阀值由本领域技术人员适当地根据哺乳动物和供体的物种和性别、移植的器官种类、测定方法等进行确定。根据本发明的预测和诊断的方法，通过避免施用不必要的免疫抑制剂而减少患者身体和经济上的负担。

此外，上述生物学样品的实例优选血液，更加优选血清。

对上述免疫抑制剂并无特定限制，只要它为在器官移植中使用的免疫抑制剂即可。它们可以是烷化剂例如环磷酰胺(cyclophosphamide)、抗代谢物例如硫唑嘌呤(azathiopurine)、氨甲喋呤(methotrexate)和咪唑立宾(mizoribine)、T细胞活性抑制剂例如环孢菌素(cyclosporin)和他可莫司(tacrolimus)、类固醇类药剂例如泼尼松龙(prednisolone)、甲强龙(methylprednisolone)、霉酚酸酯(mycophenolate mofetil)和硫唑嘌呤(azathiopurine)以及淋巴细胞表面功能抑制剂例如巴利昔单抗(basiliximab)和莫罗莫那(muromonab)或其组合。

上述哺乳动物和移植器官的供体可以是例如人、猪和狒狒，优选人。待移植器官的实例为肝脏、心脏、肾脏和皮肤。

对测定上述免疫反应性水平的方法并无特定限制，只要它为利用抗原-抗体反应的方法即可；方法的特定实例包括荧光抗体法、化学染色法、酶-抗体法、ELISA法、放射免疫测定法、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、改良的蛋白质印迹法(例如Western法、Southwestern法、Northwestern法和West-western法)和蛋白质芯片法。因此，根据本发明的另一优选实施方案，上述免疫反应性水平通过荧光抗体法、化学染色法、酶-抗体法、ELISA法、放射免疫测定法、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、改良的蛋白质印迹法或蛋白质芯片法测定。

此外，根据本发明的另一实施方案，提供了预测或诊断哺乳动物中移植排斥反应的试剂盒，其至少包含抗组蛋白H1单克隆抗体。上述移植排斥反应优选为器官移植后发生的移植排斥反应，更加优选地为中止施用免疫抑制剂后发生的移植排斥反应。

多肽

根据本发明的多肽在其氨基酸序列中包含上述被根据本发明的抗组蛋白H1单克隆抗体识别的表位。此外，根据本发明的优选实施方案，多肽由SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQID NO：8代表的氨基酸序列组成。

同样地，根据本发明的另一优选实施方案，多肽由经修饰的氨基酸序列组成，其中所述经修饰的氨基酸序列包括在SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列中替代、缺失或者添加一个或几个氨基酸。如本文所用，“一个或几个”一般优选大约从1个至3个的范围，更加优选大约1个至2个。

此外，根据本发明的另一优选实施方案，多肽由SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列的部分序列组成。上述部分序列的实例优选包括SEQ ID NO：4中第6-9位氨基酸代表的部分序列、SEQ ID NO：5中第5-9位氨基酸代表的部分序列、SEQ ID NO：6中第2-5位氨基酸代表的部分序列、SEQ ID NO：7中第2-5位氨基酸代表的部分序列以及SEQ ID NO：8中第7-9位氨基酸或第11-12位氨基酸代表的部分序列。

此外，根据本发明的另一实施方案，多肽包含SEQ ID NO：4、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8代表的氨基酸序列或其部分序列。此外，这个多肽优选由大约3-300、更加优选大约12-150个氨基酸残基组成。

根据本发明的多肽的氨基酸序列基于使用具有根据本发明的单克隆抗体的噬菌体展示肽文库试剂盒进行的分析来确定。根据本发明的多肽可以基于这个氨基酸序列用已知的肽合成装置等合成。

此外，根据本发明的多肽可以以其自身或通过已知方法对其进行衍生之后用来在身体中诱导产生抗组蛋白H1抗体。此外，组蛋白H1或组蛋白H1样抗原通过作为致敏性抗原向身体施用来产生抗组蛋白H1的抗体，也可以呈现免疫抑制活性。因此，根据本发明优选的实施方案，提供了抑制免疫的组合物，其包含组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽作为活性成分。此外，根据本发明的另一实施方案，提供了组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽在制备抑制免疫用的组合物中的用途。

上述抑制免疫的组合物可以与可药用载体一起制备成适合其施用方法的剂型。例如，当其剂型为液体时，可以适当地包含合适的溶剂、增溶剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、止痛剂、等渗剂、缓冲剂、填充剂、增稠剂、着色剂、已知的载体(例如多种脂质体、聚氨基酸、载体、合成的多聚体、天然的多聚体)、佐剂等等。

施用上述抑制免疫的组合物的方法可以是该技术领域中任意可用的方法，其中包括动脉内注射、滴注、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、皮内注射、经口施用、经粘膜施用和经皮施用。因此，根据本发明的另一实施方案，提供了治疗需要抑制免疫的哺乳动物的方法，其包括向哺乳动物施用治疗有效量的根据本发明的组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或者多肽。治疗有效量依据哺乳动物的症状严重性、性别、年龄、体重、习惯而不同；但是，活性成分量可以是每千克体重每天0.005微克至2克。此外，其施用方案可以由本领域技术人员适当地通过确定哺乳动物中产生的抗体来制定。

此外，由于组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽特异地与哺乳动物中产生的抗组蛋白H1的抗体起作用，所以它们可以用来测定哺乳动物中的抗组蛋白H1抗体的数量。因此，根据本发明的另一实施方案，提供了测定得自哺乳动物的生物学样品中抗组蛋白H1的抗体数量的组合物，其包含组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽作为活性成分。由于上述抗组蛋白H1的抗体具有上述抑制移植排斥反应的功能，所以哺乳动物中抗组蛋白H1的抗体数量成为预测和诊断移植排斥反应的指标。因此，根据本发明的另一优选实施方案，上述组合物可以用来预测和诊断哺乳动物中的移植排斥反应。此外，根据本发明的另一实施方案，提供了根据本发明的组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或者根据本发明的多肽作为预测或诊断哺乳动物中的移植排斥反应的试剂的用途。上述移植排斥反应为器官移植之后发生的移植排斥反应，更加优选地为中止施用免疫抑制剂之后发生的移植排斥反应。此外，根据本发明的另一实施方案，提供了预测或诊断哺乳动物中移植排斥反应的方法，其包括测定哺乳动物生物学样品中的抗组蛋白H1的抗体和组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽之间的免疫反应性水平。在上述方法中，当所测定的免疫反应性水平高于预先根据得自患有移植排斥反应的哺乳动物的生物学样品的抗组蛋白H1的抗体与组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽之间的免疫反应性水平设定的阀值时，就将移植排斥反应预测或诊断为低风险。这个阀值由本领域技术人员适当地根据哺乳动物和供体的物种和性别、移植器官的种类、测定方法等确定。根据本发明的预测和诊断的方法，通过避免施用不必要的免疫抑制剂而减少患者身体和经济上的负担。

对测定上述免疫反应性水平的方法并不特别地限制，只要其利用抗原-抗体反应即可；方法的特定实例包括荧光抗体法、化学染色法、酶-抗体法、ELISA法、放射免疫测定法、免疫沉淀、蛋白质印迹法、或改良的蛋白质印迹法(例如Western法、Southwestern法、Northwestern法和West-western法)和蛋白质芯片法。上述免疫反应性水平优选通过荧光抗体法、化学染色法、酶-抗体法、ELISA法、放射免疫测定法、免疫沉淀法、蛋白质印迹法、改良的蛋白质印迹法或蛋白质芯片法、更加优选蛋白质芯片法测定。在蛋白质芯片法中，通过将根据本发明的多肽加载到蛋白质芯片上可以快速并且精确地预测或诊断哺乳动物中的移植排斥反应。

此外，根据本发明的另一实施方案，提供了测定得自哺乳动物的生物学样品中的抗组蛋白H1的抗体数量的试剂盒，其至少包含组蛋白H1、组蛋白H1样抗原或根据本发明的多肽。此外，根据本发明的另一优选实施方案，上述试剂盒可以用来预测或诊断哺乳动物中的移植排斥反应。上述移植排斥反应优选为器官移植后发生的移植排斥反应，更加优选地为中止施用免疫抑制剂后发生的移植排斥反应。

上述生物学样品、免疫抑制剂、移植器官、哺乳动物、移植器官供体等与使用根据本发明的单克隆抗体的治疗方法和预测或诊断移植排斥反应的方法一样。

实施例

下列实施例具体地解释本发明；但是，不能将它们解释为本发明范围的限制。

除非另外说明，否则所用试剂和抗体均为分析级。此外，DA大鼠和PVG大鼠(雄性、7-8周龄)分别购自日本SLC有限公司和Seac Yoshitomi有限公司。BALB/c小鼠(雄性、5-6周龄)购自Charles River Japan有限公司。

参考例1

混合淋巴细胞反应(MLR)：大鼠细胞

使用得自未经处理的PVG大鼠脾淋巴细胞(应答细胞)和得自用丝裂霉素C处理的DA大鼠的脾淋巴细胞(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)(刺激细胞)。用10％FCS-RPMI培养基将应答细胞调整为5×10⁵个细胞/毫升，并用10％FCS-RPMI培养基将刺激细胞调整为8×10⁶个细胞/毫升。将如此制备的应答细胞悬浮液和刺激细胞悬浮液各自以100微升接种至96孔圆底板上(Nunc Brand产品)，此后在开始混合培养时加入抗组蛋白H1的多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology，0.1、0.2、0.4、0.8或1.6微克/孔)或兔IgG(常规的兔IgG，Santa Cruz Biotechnology，0.1、0.2、0.4、0.8或1.6微克/孔)，并在37℃、5％CO₂/95％空气的大气下进行培养3.5天以上。此处，加入他克莫司(FK506、Fujisawa Pharmaceutical有限公司)作为阳性对照。此外，结束培养前15小时，加入10微升的溴脱氧尿苷(BrdU)。然后，使用BrdU标记及检测试剂盒III(Roche Diagnostics)，通过用掺入细胞内DNA的BrdU数量作为指标来测定细胞增殖程度。此处，细胞增殖程度越高，掺入的BrdU就越多。

因此，当加入抗组蛋白H1的多克隆IgG时，MLR受到显著抑制，并且抑制的水平与加入他克莫司的水平相同。

参考例2

混合淋巴细胞反应(MLR)：人细胞

淋巴细胞的制备

从两人(A和B)各取10毫升外周血，并离心(1500转/分、30分钟)，之后移去血浆。接着向残余物中加入与移去的血浆相同体积的PBS(3毫升)，并搅拌混合物。向这个混合物中加入3毫升菲可帕克溶液(AmershamBiosciences)，并对所得混合物进行密度梯度离心(1500转/分、30分钟)以获得包含淋巴细胞的白色中间层。通过向这个白色层中加入已灭菌的PBS来制备总体积12毫升的细胞悬浮液，并进行离心(1500转/分、5分钟)。重复这个步骤两次之后，将所得淋巴细胞悬浮在1毫升的10％FCS-AIM-V培养基中(GIBCO)。

下列测试使用得自B的淋巴细胞(应答细胞)和得自用丝裂霉素C(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)处理的A的淋巴细胞(刺激细胞)进行。用10％的FCS-AIM-V培养基将应答细胞调整为5×10⁵个细胞/毫升，并用10％的FCS-AIM-V培养基将刺激细胞调整为8×10⁶个细胞/毫升。将如此制备的应答细胞悬浮液和刺激细胞悬浮液各自以100微升接种至96孔圆底板上(Nunc Brand产品)，此后在开始混合培养时加入抗组蛋白H1的多克隆IgG(Santa Cruz Biotechnology，0.1、0.2、0.4、0.8或1.6微克/孔)或兔IgG(常规的兔IgG，Santa Cruz Biotechnology，0.1、0.2、0.4、0.8或1.6微克/孔)，并在37℃、5％CO₂/95％空气的大气下培养2.5天。此处，加入他克莫司(FK506，Fujisawa Pharmaceutical有限公司)作为阳性对照。此外，在培养过程中向每孔中加入终浓度为10微升/毫升的ConA来证实刺激细胞终止增殖而应答细胞通过抗原刺激得到增殖。然后，以与参考例1中相同的方式并用BrdU标记及检测试剂盒III(RocheDiagnostics)处理每个孔，用掺入细胞内DNA的溴脱氧尿苷(BrdU)的数量作为指标来测定细胞增殖程度。

在得自B的应答细胞与得自用丝裂霉素C处理的A的刺激细胞的组合中，通过MLR确定细胞增殖。此外，抗组蛋白的多克隆抗体呈浓度依赖性地抑制MLR。在另一方面，兔IgG(常规的兔IgG)不抑制MLR。

实施例1

杂交瘤的制备

免疫法

通过混合0.8毫升在PBS中的抗原(组蛋白H1组蛋白F1组蛋白KAP，Roche)溶液(抗原浓度：0.5毫克/毫升)和0.8毫升弗氏完全佐剂(WakoPure Chemical Industries)得到悬浮液(抗原浓度：0.25毫克/毫升)。接着，将0.2毫升这种悬浮液腹膜内地施与BALB/c小鼠。此后，每两周向小鼠施用相同数量的这种悬液。然后，在开始施用16周之后，最后向小鼠腹膜内地施用0.2毫升在PBS中的抗原溶液(抗原浓度：600-1000毫克/毫升)。施用之后，从眼底静脉收集血液并通过ELISA测定抗体效价。在最后施用4天之后，收集全血并离心所得血液(2000转/分、20分钟)来获得抗血清，该抗血清在下面实验中作为对照抗血清使用。此外，在收集全血之后，从大鼠解剖出脾脏并将所得脾细胞用于下面的细胞融合。

细胞融合

将上述脾细胞和骨髓瘤细胞(P3X63-Ag.8.653)以10∶1-10的比率混合，并离心混合物(1500转/分、5分钟)。离心之后，用吸出器移去上清，并在37℃向所得细胞沉淀中以1分钟的期间加入1毫升的聚乙二醇4000(在PBS中的50％溶液)以获得混合溶液。将这个混合溶液在37℃维持1分钟，然后以1毫升每30秒的速率加入37℃的IMDM培养基(共9毫升)，然后离心混合物(1500转/分、5分钟)。离心后，通过抽吸移去上清并在37℃加入适量的添加了15％FCS(JRH BIOSCIENCES)的IMDM培养基(GIBCO)。将100毫升所得悬浮液等份分别加到96孔培养板上，并在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育一天。此外，加入100毫升HAT培养基(其通过在10毫升无血清IMDM培养基中溶解HAT粉末(HAT培养基添加物(×50，Sigma))、并用包含10％FCS的IMDM培养基将溶液稀释50倍来制备)，并在37℃、5％CO₂的培养箱中进行孵育。每2-3天更换HAT培养基。10天以后，将培养基更换为HT培养基(其通过在10毫升的无血清IMDM培养基中溶解HT粉末(HT培养基添加物，Sigma)、并用包含10％FCS的IMDM培养基将溶液稀释50倍来制备)，并在37℃、5％CO₂的培养箱孵育3天。然后，每2-3天更换培养基(HT培养基)。在显微镜下确定细胞增殖后，回收培养上清(大约100毫升)。使用这个培养上清通过如下文所示地测定对组蛋白H1的抗体效价来筛选杂交瘤。

杂交瘤细胞的筛选

抗体效价的测定

将包含组蛋白H1(5mg、小牛胸腺组蛋白H1、Roche Diagnostics)的缓冲液以每孔50微升的等份(碳酸氢盐缓冲液：100mM NaHCO₃-NaOH、pH 9.2-9.5；组蛋白H1浓度：1毫克/毫升)加到96孔平底板上，并将平板在室温维持2小时以便包被。用洗涤缓冲溶液(PBST)洗涤平板三次，每孔加入200-250微升封闭缓冲溶液(在PBS中的3％脱脂奶和1％BSA)，在4℃反应24小时后，洗涤平板三次。接下来，每孔加入100微升等份的杂交瘤培养上清，并在37℃反应4小时或在4℃反应24小时。洗涤平板3次后，每孔加入50微升等份的用稀释缓冲液(10mM Tris-HCI(pH 8.0)、0.9％(W/V)NaCl、0.05％(W/V)Tween 20)稀释了10000倍的生物素标记的抗小鼠IgG(Sigma)，并在室温反应2小时。洗涤6次后，每孔加入50微升等份的用稀释缓冲液稀释了1000倍的碱性磷酸酶标记的链亲和素，并在室温反应1到2小时。洗涤6次后，每孔中加入50微升等份的荧光底物缓冲液(Attophos底物缓冲液，Roche Diagnostics)来显色，同时使平板避光。荧光通过CytoFlour II(PerSeptive)测定。

杂交瘤的筛选

向在上述抗体效价测定(1×10⁵个细胞/毫升)中显示阳性反应的孔中加入添加了15％FCS和10％HCF(杂交瘤克隆因子，Origen)的IMDM培养基，将所得悬浮液加至96孔培养平板上以使细胞浓度为大约200个细胞/孔，并在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育。然后，以上述相同的方式进行抗体效价的测定来筛选具有高抗体产率的杂交瘤。

此外，用添加了15％FCS和10％HCF的IMDM培养基进行有限稀释使筛选的杂交瘤浓度为0.5-1个细胞/孔，并在37℃、5％CO₂的培养箱中孵育3-4天，之后以上述相同的方式测定抗体效价来筛选具有高抗体产率的杂交瘤。此外，进一步重复有限稀释来获得38个可产生抗H1单克隆抗体的杂交瘤。从这些杂交瘤中筛选出10个显示高于对照抗血清抗体效价的杂交瘤，并命名为1F5、3F2、15A11、15F11、16D1、16G9、17C2、17E2、21E3、和22A12。

试验例1：对包含抗组蛋白H1单克隆抗体的培养上清进行MLR抑制活性的评估测试

制备包含抗组蛋白H1单克隆抗体的培养上清液

每个杂交瘤用添加了15％FCS和10％HSF的IMDM培养基培养(1×10⁶个细胞/毫升)。用CENTRIPREP YM-10(MILLIPORE)离心15毫升该培养上清(2000g，2.5小时)，从而获得包含抗组蛋白H1单克隆抗体的培养上清的浓缩物。

MLR

用所得的培养上清的浓缩物(1000倍稀释液)以与参考例1中相同的方式进行MLR抑制活性评估测试。用免疫前的大鼠血清(1000倍稀释液)、1.6微克/孔的兔IgG(常规的兔IgG、1.6毫克，Santa Cruz Biotechnology)、1.6微克/孔的抗组蛋白H1的多克隆IgG(200微克，Santa CruzBiotechnology)和1.6微克/孔的他克莫司作为对照。用IMDM培养基进行稀释。

结果如图1中所示。8个杂交瘤1F5、3F2、15A11、15F11、16D1、16G9、17C2、和17E2的培养上清显示出等同于抗组蛋白H1多克隆抗体和他克莫司的MLR抑制活性。在图1中，PVG/PVG代表通过丝裂霉素C刺激而丧失增殖能力的PVG淋巴细胞和作为应答细胞的PVG淋巴细胞的混合培养物，而DA/PVG代表同样丧失增殖能力的DA淋巴细胞和作为应答细胞的PVG淋巴细胞的混合培养物。

试验例2：确定抗组蛋白H1单克隆抗体的识别位点-1-

制备用于测定的样品

从PVG大鼠解剖出脾细胞，并根据Weissman的方法(Weissman等人，Science 239，1018-1021，1988)裂解细胞。用1毫升的PBS离心(1500转/分，5分钟)脾细胞，然后回收。用注射器将这些细胞制成悬浮液，并加入等体积的150mM NaCl溶液。离心所得细胞悬浮液(300×g，10分钟)，获得沉淀和上清。将沉淀称为不可溶部分(包含核部分)，而将上清液称为包含细胞膜的可溶性部分。向不可溶部分中加入5倍体积(v/v)的电泳用的样品缓冲液(25毫升0.25M的Tris-HCl(pH 6.8)、2.0克SDS、9毫升超纯水、10毫升甘油、5毫克BPB)。煮沸所得混合物5分钟，然后离心，从而获得用作测定样品的上清。此外，向含有细胞膜的可溶部分中加入终浓度为5mM的EDTA。从这个含有细胞膜的可溶部分中回收100-200微升等份。将剩余的包含细胞膜的可溶部分进行超速离心(4℃、200000×g、45分钟)。将所得的沉淀称为细胞膜部分，而将所得上清称为无细胞膜的可溶部分。将细胞膜部分与5倍体积(v/v)的电泳用样品缓冲液一起煮沸5分钟，然后离心。如此获得的上清用来作为测定的样品。

此外，用结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4)稀释试验例1中获得的包含抗组蛋白H1单克隆抗体的10毫升培养上清，从而获得50毫升溶液。将该溶液以0.2-1毫升/分钟的流速上样于HiTrap蛋白G柱上(H1Trap Protein G HP，Amersham Biosciences)，并在4℃循环24小时。然后，以1-2毫升/分钟的流速通过5毫升结合缓冲液来洗涤柱子。洗涤柱子后，将上述含有细胞膜的可溶部分的溶液以0.2-1毫升/分钟的流速上样，并在4℃循环24小时。接下来，以1-2毫升/分钟的流速通过2毫升结合缓冲液来获得流通部分(flow-through fraction)。这个流通部分用来作为测定的样品。

纯化抗组蛋白H1单克隆抗体

将1mM HCl溶液以1-2毫升/分钟的流速上样于H1Trap NHS柱上(HiTrap NHS-活化的HP，Amersham Biosciences AB)，然后以1毫升/分钟的流速上样1毫升组蛋白H1溶液(10.5毫克组蛋白H1(RocheDiagnostics)、偶联缓冲液(0.2M NaHCO₃、0.5M NaCl、pH 8.3))，在此之后立即密封柱子来进行偶联(15-30分钟)。偶联之后，用缓冲液A(0.5M单乙醇胺、0.5M NaCl，pH8.3)、缓冲液B(0.1M乙酸钠、0.5MNaCl，pH 4.0)和中性缓冲液(1.0M Tris-HCl，pH 9.0)洗涤柱子内部。接着，将在试验例1中获得的包含抗组蛋白H1单克隆抗体的培养上清以1毫升/分钟的流速上样，并进行循环(4℃、过夜)。接着，在用5毫升磷酸缓冲液洗涤柱子后，以0.2-1毫升/分钟的流速通过5毫升洗脱缓冲液，并从洗脱部分中获得纯化的抗组蛋白H1单克隆抗体。

SDS-PAGE

在根据Laemmli(Nature，227，680-685，1970)的不连续缓冲体系中进行电泳，每个测定用的样品通过SDS-PAGE处理。使用组蛋白H1(5毫克，Roche Diagnostics)作为对照。SDS-PAGE之后，对所得胶进行下列考马斯染色或蛋白质印迹。

考马斯染色

将SDS-PAGE后的胶浸入染色液(0.25％的考马斯亮蓝R/乙醇∶乙酸∶蒸馏水＝9∶2∶9)中，并摇动大约1小时，在此之后将胶浸入脱色液(乙醇∶乙酸∶蒸馏水＝25∶8∶65)中约1小时进行脱色。然后，将胶浸入保存液(甲醇∶乙酸∶蒸馏水＝10∶15∶175)中以脱去背景。

蛋白质印迹

使用半干型转移装置(AE-6675，ATTO)将SDS-PAGE之后凝胶上的蛋白质转移至PVDF膜上。接着，将转移后的PVDF膜浸入封闭液(在PBST溶液中的5％脱脂牛奶和1％BSA)中，并摇动(4℃24小时或室温1小时)。接着，将包含经纯化的抗组蛋白H1单克隆抗体的溶液(用封闭液稀释500倍)作为一级抗体加至PVDF膜，并在室温摇动1小时后，用PBST洗涤膜15分钟×1次，然后5分钟×3次。洗涤后，向PVDF膜加入用封闭液稀释了20000倍的二级抗体(HRP标记的抗小鼠的IgG，Sigma)溶液，并在室温摇动膜1小时。摇动后，用PBST洗涤膜15分钟×1次，然后5分钟×3次。此外，用ECL Plus蛋白质免疫印迹检测系统(AmershamBiosciences，AB)检测特异性抗体的结合，并在曝光后用X射线胶片RX-U(FUJI PHOTO FILM，Tokyo，Japan)显影。

作为蛋白质印迹的结果，在细胞膜部分31kD的位置检测到特异条带。在考马斯染色中于相同位置检测到这条作为组蛋白H1的条带。

试验例3：确定抗组蛋白H1单克隆抗体的识别位点-2

在含有4％福尔马林的PBS溶液中悬浮PVG大鼠脾细胞，并在室温固定20分钟。此外，用染色缓冲液(包含1％(v/v)FCS和0.1％(w/v)叠氮化钠的PBS溶液，4℃)洗涤脾细胞三次，之后制备在100毫升染色缓冲液中包含2×10⁶个细胞的混合溶液。向该混合溶液中加入一级抗体(2毫升生物素标记的抗组蛋白H1单克隆抗体或5毫升生物素标记的常规小鼠IgG)，并在37℃进行反应1小时。这个反应之后，用染色缓冲液(4℃)洗涤脾细胞三次，进一步向脾细胞中加入100毫升染色缓冲液和1毫升FITC-标记的链亲和素(BD PharMingen)，并在室温进行反应30小时。反应后，用染色缓冲液(4℃)洗涤脾细胞三次，并向脾细胞中加入500毫升PBS来制成悬浮液。此外，向这个悬浮液中加入终浓度为5毫克/毫升的碘化丙啶(Sigma)，并在室温进行反应20分钟。用包含50％甘油的PBS溶液密封如此所得的细胞，然后在荧光显微镜下检测。

结果，只有脾细胞的外周部分(细胞膜)被特异地荧光染色。

试验例4：确定抗组蛋白H1单克隆抗体的识别位点-3

噬菌体展示

使用Ph.D.-12噬菌体展示肽文库试剂盒(购自New England BioLabs公司)对由杂交瘤1F5、3F2、15F11、17C2或16G9产生的抗组蛋白H1的抗体进行淘选实验。用每种溶解在0.1M NaHCO₃溶液(pH 8.6)中的纯化的单克隆抗体直接包被在微量滴定板上(Nunc，目录号430341)，并在4℃孵育过夜。向每孔中加入封闭缓冲液(0.1M NaHCO₃、5毫克/毫升BSA、0.02％NaN₃)，并在4℃孵育平板至少1小时，然后用TBST(50mMTris、150mM NaCl、0.1％Tween20)洗涤。在第一轮淘选中，将最初文库中的4×10¹⁰个噬菌体用于筛选。通过用TBTS反复洗涤移去未结合的噬菌体。用0.2M甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.2、1毫克/毫升BSA)洗脱结合的噬菌体。洗脱的噬菌体在20毫升大肠杆菌(E.coli)ER2738培养物中增殖。所得噬菌体用聚乙二醇沉淀，并用于第二轮淘选。进一步根据相同的方法进行第三轮淘选。将第三轮淘选获得的噬菌斑稀释100倍，并用ER2738培养物进行增殖。将含有所得产物的试管在37℃伴随摇动孵育4.5-5小时。用碘化物缓冲液(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、4M NaI)和乙醇沉淀并纯化单链的噬菌体DNA。将噬菌体DNA溶解在20微升TE缓冲液中(10mM Tris-HCl、pH 8.0、1mM EDTA)进行DNA序列分析。

DNA序列分析

对于所得的经纯化的噬菌体DNA，用上述Ph.D.-12噬菌体展示肽文库试剂盒和DYEnamic^TM ET终止子循环测序预混试剂盒(AmershamBiosciences)中附带的引物DNA进行测序PCR反应(PCR反应条件：由95℃30秒、50℃15秒和60℃1分钟组成的30个循环)。用AutoSeq^TM G-50(Amersham Biosciences)纯化PCR产物。进一步使用ABI PR1SM^TM 310遗传分析器(PE Biosystems)测定每个噬菌体肽的DNA序列。基于测定的DNA序列的氨基酸序列如下：

杂交瘤株系  氨基酸序列

1F5         NYQTYTPRPPHS    (SEQ ID NO：4)

3F2         VTNNQTSPRWEI    (SEQ ID NO：5)

15F11       WKPVSLTLHTHP    (SEQ ID NO：6)

17C2        HATGTHGLSLSH    (SEQ ID NO：7)

16G9        SSVLYGGPPSAA    (SEQ ID NO：8)

竞争性ELISA

每个具有自上述噬菌体DNA测定的氨基酸序列的肽根据常规方法合成。竞争性ELISA用获得的肽、各种纯化的单克隆抗体和组蛋白H1抗原(Roche，目录号1004875)进行。此处，用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotinylation kit(Pierce)生物素化组蛋白H1抗原，并且使用ABTS溶液(Sigma，A3219)作为发色试剂。用ELISA测定仪器(Thermo Labsystems，Multiskan Ascent)在405纳米处检测颜色形成。进行3次测定以获得平均吸收值。

结果，证实上述合成的肽可抑制每种经纯化的单克隆抗体与组蛋白H1抗原之间的结合。

                            序列表

<110>阿梅特拉斯法玛有限公司

<120>抗组蛋白H1单克隆抗体及用于产生其的杂交瘤

<130>156278

<160>8

<170>PatentIn版本3.1

<210>1

<211>50

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<223>组蛋白H1部分序列

<400>1

Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Ala Glu Lys

1               5                   10                  15

Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala Ala Lys Arg

            20                  25                  30

Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val Ala

        35                  40                  45

Ala Ser

    50

<210>2

<211>105

<212>PRT

<213>牛(Bos taurus)

<220>

<223>组蛋白H1部分序列

<400>2

Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Pro Ala Glu Lys

1               5                   10                  15

Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Arg Arg

            20                  25                  30

Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala Val Ala

        35                  40                  45

Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys Lys Ala

    50                  55                  60

Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg Ile Lys

65                  70                  75                  80

Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln Thr Lys

                85                  90                  95

Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys

            100                 105

<210>3

<211>221

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<220>

<223>组蛋白H1部分序列

<400>3

Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro Val Glu

1               5                   10                  15

Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Lys Lys Thr Gly Ala Ala Ala Gly

            20                  25                  30

Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys Ala

        35                  40                  45

Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu Lys

    50                  55                  60

Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser Arg

65                  70                  75                  80

Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val Gln

                85                  90                  95

Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys Ala

            100                 105                 110

Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala Lys

        115                 120                 125

Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr Gly

    130                 135                 140

Ala Ala Thr Pro Lys Lys Thr Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala Lys

145                 150                 155                 160

Lys Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Val Ser Lys Ser Pro Lys

                165                 170                 175

Lys Val Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Lys Ser Pro Ala Lys

            180                 185                 190

Ala Lys Ala Pro Lys Ala Lys Ala Ser Lys Pro Lys Ala Ser Lys Pro

        195                 200                 205

Lys Ala Thr Lys Ala Lys Lys Ala Ala Pro Arg Lys Lys

    210                 215                 220

<210>4

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白H1的表位

<400>4

Asn Tyr Gln Thr Tyr Thr Pro Arg Pro Pro His Ser

1               5                   10

<210>5

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白H1的表位

<400>5

Val Thr Asn Asn Gln Thr Ser Pro Arg Trp Glu Ile

1               5                   10

<210>6

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白H1的表位

<400>6

Trp Lys Pro Val Ser Leu Thr Leu His Thr His Pro

1               5                   10

<210>7

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白H1的表位

<400>7

His Ala Thr Gly Thr His Gly Leu Ser Leu Ser His

1               5                   10

<210>8

<211>12

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<223>组蛋白H1的表位

<400>8

Ser Ser Val Leu Tyr Gly Gly Pro Pro Ser Ala Ala

1               5                   10