鉴定调节钠/钙交换转运蛋白活性的化合物的方法

摘要

本发明涉及通过无细胞电生理传感器芯片测定Na

说明书

本发明涉及通过无细胞电生理传感器芯片测定Na⁺/Ca²⁺交换(NCX)蛋白活性或活性的调节的无细胞测定法、包含传感器芯片与NCX蛋白质的试剂盒以及试剂盒的生产方法和用途。

发明概述

生命的一种基本要求是区室化——生物膜是实现该原则的天然工具。然而，细胞膜下的结构——脂双层对大部分离子和化合物都是不可通透的，所述离子和化合物的转运对于维持细胞和生物的重要功能是必要的。该矛盾的答案在于细胞膜的半透特性——必须穿过膜的溶质由特定膜蛋白转运。这些转运蛋白负责建立并维持离子梯度、吸收营养、转运代谢物、重吸收信号分子和处理有毒和废弃的化合物。因此，转运蛋白是潜在的药物靶标，其允许直接影响本文中的疾病相关的异常。

大部分膜转运蛋白在进行其转运循环时改变电荷。该改变可始于带电底物的移动或始于带(部分)电荷的蛋白质部分的移动。

监测转运蛋白相关电流

在一些情况下，转运蛋白相关电流可在生理环境中通过膜片钳实验或在人造“黑质膜”中直接监测。在后一种情况下，在两种缓冲液储存器(各含有Ag/AgCl电极)间的小孔中产生脂双层。将蛋白质参入双层后，生物活性(例如酶活性)可通过例如光活化ATP衍生物触发。然而，由于其缺乏稳定性，用该系统不能进行快速缓冲液交换实验，将该体系限制于可光活化的底物。稳定性的缺乏可通过在传感器表面固定含蛋白质颗粒来克服。该事实为IonGate Biosciences GmbH，Frankfurt/Main的称为SurfE²R^(表面生电事件读数器)的无细胞电生理学技术的原理，该技术检测产生的转运蛋白相关电流。

类似的，还根据本发明，由带有转换器的基质和有孔盖板组成传感器芯片，形成类似滴定板孔的孔。玻璃或聚合物板作为合适的基质。就玻璃平板而言，转换器由薄的石印结构的表面被化学修饰的(例如通过硫醇)金膜组成，然而对于修饰的聚合物基质，也可使用厚膜金电极。由于合适基质的范围，可生产单传感器芯片以及传感器条或甚至具有96或384个传感器的传感器阵列板。特别是基于聚合物的传感器具有低成本大规模生产的潜力。具体的实例公开于WO02/074983和DE10244129。

对所有传感器类型适用的是进行表面修饰后将金表面转化为电容器并用水溶液充满孔。该电容器的性质可借助于载流的参考电极如Pt/Pt或Ag/AgCl或氧化铟锡(ITO)或引入与溶液接触的其他电极确定。另外，传感器表面非常亲水，即对膜碎片和囊泡是粘性的。生电蛋白质保持在它们的天然或天然样环境，即容易吸附在亲水传感器表面的生物膜片、囊泡或脂蛋白体中，形成区室，其带有溶液的内部空间与金表面以及孔中周围溶液电隔离。如果插入小池，芯片的孔(图2A)限定了流动小室的内部体积，使得传感器表面上的快速溶液交换成为可能。

从不含研究的蛋白质底物的溶液转换到含有的研究蛋白质的底物导致上述电容器的可测量的、瞬时充电电流，其通常在100pA到4nA范围内。

在使用的工作站中，所有进行溶液交换实验必需的部件适应以PC或以其他方式控制的工作站。在常规系统中，非激活(即不含底物的)的溶液以及激活的溶液储藏在玻璃瓶中。应用于瓶上的气压驱动溶液穿过电机控制的阀门系统并穿过流动小室。另外，可使用自动采样器以自动化方式处理若干溶液。

Na⁺/Ca²⁺交换蛋白(NCX)

术语“NCX蛋白质”或“NCX”在本发明上下文中应指下列Na⁺/Ca²⁺交换蛋白质列表中任一种单独或彼此组合：NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6、NCX7。特别优选的是NCX1、NCX2和/或NCX3。这类NCX蛋白质可来自任何脊椎动物，特别是哺乳动物物种(例如狗、马、牛、小鼠、大鼠、犬、兔、鸡、类人猿、人或其他动物)。NCX可分离自这类脊椎动物生物的组织探针或可通过能够表达NCX蛋白质的重组生物材料生产。

术语“生物材料”是指含有遗传信息并能够自我复制或在生物系统中复制的任何材料。重组生物材料是通过本领域技术人员公知的重组技术产生、改变或修饰的任何生物材料。

下列参考文献为克隆具体NCX蛋白质的实例：犬Na⁺/Ca²⁺交换蛋白NCX1由Nicoll，DA.等克隆(Science.250(4980)：562-5，1990；标题：Molecular cloning and functional expression of the cardiac sarcolemmalNa(+)-Ca²⁺exchanger.)。人Na⁺/Ca²⁺交换蛋白NCX1由Komuro，I.等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89(10)，4769-4773，1992；标题：Molecular cloningand characterization of the human cardiac Na⁺/Ca²⁺exchanger cDNA)和Kofuji，P.等(Am.J.Physiol.263(Cell Physiol.32)：C1241-C1249，1992；标题：Expression of the Na-Ca exchanger in diverse tissues：a study using thecloned human cardiac Na-Ca exchanger)克隆。人Na⁺/Ca²⁺交换蛋白NCX2由Li，Z.等克隆(J.Biol.Chem.269(26)：17434-9，1994；标题：Cloning of the NCX2 isoform of the plasma membrane Na(+)-Ca²⁺exchanger)。大鼠Na⁺/Ca²⁺交换蛋白NCX3由Nicoll，DA.等克隆(J.Biol.Chem.271(40)：24914-21.1996；标题：Cloning of a third mammalianNa⁺-Ca²⁺exchanger，NCX3)。人Na⁺/Ca²⁺交换蛋白NCX3由Gabellini，N.等克隆(Gene.298：1-7，2002；标题：The human SLC8A3 gene and thetissue-specific Na⁺/Ca²⁺exchanger 3 isoforms)。

钠/钙交换蛋白为从不同细胞去除Ca²⁺的重要机制。在心脏中，它排出通过Ca²⁺通道进入的Ca²⁺以起始收缩。其与心血管疾病的关联在例如Hobai，JA & O’Rourke，B(2004)Expert Opin.Investig.Drugs，13，653-664中说明。因此，制药工业已发展了抑制NCX的化合物，如Iwamoto，T.等(2004)J.Biol.Chem.，279，7544-7553中所述。如Hinata，M.等(2002)J.Physiol.545，453-461中通过电生理学方法所示，Na⁺/Ca²⁺交换蛋白对每个反方向移动的Ca²⁺生电转运三到四个Na⁺。NCX能够将细胞质Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_内)维持在比细胞外Ca²⁺浓度([Ca²⁺]_外)低三到四个数量级。然而，净Ca²⁺转运的方向依赖于Na⁺的电化学梯度。对Na⁺和Ca²⁺转运已提出了同时和连续转运模型，大量证据倾向于后者。

本领域技术水平公知NCX蛋白质的活性可通过活细胞测定。对该目的而言，蛋白质必须在细胞中表达且细胞必须增殖。这类系统已由AxxamS.r.l.(Mailand，Italy)在“Pharmaconference 2003”in Pontresina on PosterNr.P25中公开(标题：Application of FLIPR platform to study K⁺dependent Na⁺/Ca²⁺exchangers)。这些依赖于K⁺的Na⁺/Ca²⁺交换蛋白与NCX蛋白质是不同的，因为它们已从眼组织中分离，显示不同的转运机制并且未发现在心组织中表达。已知其他测量方法用于在细胞中或细胞测定中电化学测定Na⁺/Ca²⁺同向转运体系。这类体系的缺点在于蛋白活性必须在复杂的生物学背景下测定，所述背景含有可能干扰将使用的测定法的所有类型大分子的混合物。Na⁺和Ca²⁺流出和流入电流由若干和不同的蛋白质驱动。从而关于单一蛋白质的测量被大背景破坏。没有该缺点的方法为在蛋白质-脂质体中电化学测定Na⁺/Ca²⁺同向转运系统的方法(Eisenrauch，A.等；J.Membrane Biology(1995)145：151-164；标题：Electrical Currents generated by a partially purified Na/Ca exchangerfrom lobster muscle reconstituted into liposomes and adsorbed on blacklipid membranes：activation by photolysis of Ca²⁺)。该方法的明显缺点将是不会发生溶液快速交换。

本发明的体系通过将蛋白质固定在细胞背景外的装置，允许快速溶液交换来避免关于NCX蛋白质的这类缺点。然后通过测量电流确定蛋白质活性。另外，快速溶液交换是可能的。

因此，本发明的一个主题涉及用于测定NCX蛋白质活性的测定法，其中包含NCX蛋白质的传感器芯片通过洗涤、非激活和激活连续地逐步处理，然后当从非激活变为激活处理时测量电流。

术语“传感器芯片”是指无细胞电生理传感器芯片，如WO02/074983中所述，特别是所述PCT申请的权利要求书和/或图1和/或图2(包括图中的说明)所述，如未在本发明中另作说明，本文将其引用作为参考。

具体的，该测定法包括允许有效制备含NCX蛋白质的膜的方案、用于有效制备含NCX蛋白质的传感器芯片的方案及允许测量NCX活性的溶液交换方案。

通常，使用的NCX蛋白质为如上所述的哺乳动物来源的，特别是人来源的。NCX蛋白质选自NCX1、NCX2、NCX3、NCX4、NCX5、NCX6和/或NCX7，特别是NCX1、NCX2和/或NCX3。在优选的实施方案中，NCX蛋白质为人NCX1蛋白。这类NCX蛋白质可通过本领域技术人员公知的重组方法制备(下文中称为“重组NCX蛋白质”)或从天然组织探针中收集(下文中称为“天然NCX蛋白质”)。

在优选的实施方案中，传感器芯片含有带金结构的borofloate玻璃基质(basic body)。传感器芯片还可优选地被硫醇层覆盖并具有一层或若干层绝缘层。这样的传感器芯片(例如具有圆形金结构(直径1-3mm)和接触区的Borofloate玻璃芯片)可从IonGate Biosciences GmbH，Industriepark Hchst，D 528，D-65926 Frankfurt am Main，Germany购得。

特别优选的方案如下：

例如10-30μl含NCX膜碎片点样并循环(circulate)在传感器芯片上并优选在4℃温育至少12小时。在优选的实验案例中，NCX蛋白质为人NCX1蛋白。装有蛋白质的传感器芯片的电容优选为100nF cm^-2左右且电导率G1s优选在10nS cm^-2左右。该测定法的原理为不存在抑制剂时和随后存在抑制剂时检测NCX蛋白质的电活性。为此，用一系列激活NCX的溶液冲洗NCX传感器芯片。通常存在检测抑制剂是否可逆的可能性。在这种情况下，使用抑制剂后，将溶液改变回无抑制剂的条件。在实验前，将芯片的溶液储存器用下列优选的溶液充满：洗涤缓冲液：40mM KCl、100mM NaCl、4mM MgCl₂、30mM HEPES/NMG pH 7.4；非激活溶液：140mM KCl、4mM MgCl₂、30mM HEPES/NMG pH 7.4；激活溶液：140mM KCl、4mM MgCl₂、30mM HEPES/NMG pH 7.4、0.5mM CaCl₂。为了在有抑制剂时测量，所有三种溶液含有相同浓度的抑制剂。从非激活到激活溶液的改变导致引起负电流的NCX激活，其衰减至基线。如果三个测量周期中NCX信号的平均振幅不变，将溶液换为含抑制剂溶液并重复相同的方案。然后可将溶液换回无抑制剂条件，以检测抑制剂是否可逆。

术语“电流”在本发明上下文中是指响应用激活溶液代替非激活溶液的峰电流，包括但不仅限于最大峰电流。电流振幅在10到100ms内上升，然后在2秒内较慢衰减。电流的极性可以是正或负的，取决于转运的离子的极性和/或蛋白质偏移部分的极性和它们转运或移动穿过区室膜或进入区室的矢量方向。用非激活溶液代替激活溶液或用洗涤溶液代替非激活溶液产生的电流在NCX活性测定时未纳入考虑。选择流动速率和时间间隔，使响应激活溶液替换非激活溶液的电流保持不被由其他替换步骤刺激的电流响应偏压。

用非激活溶液替换洗涤溶液将优选地引起跨含有NCX蛋白质的膜的Na⁺梯度。此后，用激活溶液(即含Ca²⁺溶液)替换非激活溶液将选择性地激发NCX活性。接着以相反顺序替换溶液将传感器芯片还原为初始状态。

洗涤传感器芯片一般是指在含钠、不含钙的缓冲液(洗涤液)中温育传感器芯片，优选地引起囊泡区室中Na⁺的蓄积。另外，跨膜建立Na⁺梯度优选通过用非激活溶液替换洗涤溶液进行，从而将传感器芯片暴露于Na⁺浓度的快速变化中。NCX激活优选通过用激活溶液替换非激活溶液进行，从而将传感器芯片暴露于Ca²⁺浓度的快速变化中。

在另一优选的实施方案中，本发明涉及测定NCX蛋白质活性的测定法，其中第一次溶液替换通过用非激活溶液替换洗涤溶液进行，和/或第二次溶液替换通过用激活溶液替换非激活溶液进行，和/或第三次溶液替换通过用非激活溶液替换激活溶液进行，和/或第四次溶液替换通过用洗涤溶液替换非激活溶液进行。

本发明还涉及用于鉴定调节NCX蛋白质活性的化合物的测定法(筛选测定法)，其中

a]提供含有NCX蛋白质的传感器芯片；

b]提供洗涤溶液、非激活溶液和激活溶液；

c]提供洗涤溶液、非激活溶液和激活溶液，其中所有这三种溶液另外含有在所有三种溶液中浓度相同的化合物；

d]用来自b]的洗涤溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗涤溶液连续逐步处理来自a]的传感器芯片；

e]当将d]中的非激活溶液改变为激活溶液时，测定电流；

f]用来自c]的洗涤溶液、非激活溶液、激活溶液、非激活溶液和洗涤溶液连续逐步处理来自e]的传感器芯片；

g]当将f]中的非激活溶液替换为激活溶液时，测定电流；从而证明在e]的电流与g]的电流强度不同时，NCX蛋白质活性的调节。

步骤d]、e]、f]中的连续逐步处理可以连续流动或几乎连续流动进行。

NCX蛋白质活性的修饰可由刺激或抑制NCX蛋白质活性组成。

当来自e]的电流大于来自g]的电流时，证明了活性的刺激。

当来自e]的电流小于来自g]的电流时，证明了活性的抑制。

该方案的优选实施方案已在上文、下列实施例和权利要求书中描述。

本发明还涉及包含下列部分的试剂盒

a]含有NCX蛋白质的传感器芯片、

b]洗涤溶液、

c]非激活溶液、

d]激活溶液。

该试剂盒优选的实施方案也已在上文、下列实施例和权利要求书中描述。

本发明还涉及上述试剂盒的生产，其中生产传感器芯片，生产NCX蛋白质，将生产的NCX蛋白质固定在传感器芯片表面上，生产洗涤溶液，生产非激活溶液，生产激活溶液并将含有NCX蛋白质的传感器芯片、洗涤溶液、非激活溶液和激活溶液组合为一个试剂盒单元。

该试剂盒单元可由一个或若干个包含例如给使用者的说明书的部分组成。

本发明还涉及如上所述试剂盒用于鉴定修饰(＝抑制或激活)NCX蛋白质的活性的化合物或用于测定NCX1蛋白质活性的用途。

本发明还涉及测定NCX蛋白质活性的测定法，其中将包含含有吸附的NCX蛋白质的膜的传感器芯片暴露于至少一种NCX底物(例如Ca²⁺或Na⁺)的浓度快速变化中。

下列附图和实施例将更详细地描述本发明而不限制保护范围。

附图说明

图1：

图1显示含有人NCX1cDNA序列的载体pVL1393的多核苷酸序列。相应的可读框通过显示相关的氨基酸序列来标记。所示序列对应于SEQ IDNO.：1。含人NCX1 cDNA的pVL1393的DNA已经保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ)(Deutsche Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；Mascheroder Weg 1b；D-38124 Braunschweig)，保藏号为DSM 16588。

SEQ ID NO.：1：pVL1393的多核苷酸序列

保藏的生物材料：

DSM 16588：含人NCX1 cDNA的pVL1393的DNA。

DSM ACC2670：Flp-In-T-Rex-293-NCX1。

保藏根据布达佩斯条约规定通过将生物材料移交给DSMZ(DeutscheSammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH；MascheroderWeg 1b；D-38124 Braunschweig)完成。

图2：

A)带金结构和流体区室的3mm生物传感器芯片。

B-D)生物传感器夹层结构装配图解；B)金表面；C)具有化学接头和脂质的涂层；D)膜的吸附。

图3：

A)重组表达的Na⁺/Ca²⁺交换蛋白的离子转运活性诱导的充电电流。

B)用本发明的无细胞电生理传感器芯片获得的Na⁺/Ca²⁺交换蛋

白抑制剂的IC₅₀。所有的误差作为平均标准误(SEM)列出。

实施例

1.产生哺乳动物细胞系

使用Flp-In^TM T-Rex^TM表达系统(Invitrogen Corporation，1600Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California 92008，USA)完成稳定转染细胞系的快速产生。为此，将编码(人)心脏钠钙交换蛋白的cDNA(NCX-1，即SLC8A1 PDB-entry NM 021097)克隆进Flp-In^TMT-Rex^TM表达载体(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，PostBox 6482 Carlsbad，California 92008，USA)然后转染进HEK-293细胞中。细胞在标准条件(37℃，补充有8％CO₂的空气)下在添加10％胎牛血清(Biochrom AG，Post Box 46 03 09，12213 Berlin，Germany)、50mg/ml潮霉素(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482Carlsbad，California 92008，USA)和10mg/ml杀稻瘟素(InvitrogenCorporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California92008，USA)的D-MEM(Invitrogen Corporation，1600 Farraday Avenue，Post Box 6482 Carlsbad，California 92008，USA)中培养。

每3到4天传代细胞，用胰蛋白酶/EDTA溶液(Biochrom AG，Post Box46 03 09，12213 Berlin，Germany)脱附细胞。制备膜之前至少12到24小时，用1μg/ml多西环素(Doxicycline)(Beckton Diccinson Bioscience Clontech，1290 Terra Bella Avenue Mountain View，CA 94043，USA)处理细胞以促进NCX表达。

表达NCX-1的Flp-In-T-Rex-293-NCX1细胞系以DSM ACC2670保藏于DSMZ(Deutsche Gesellschaft von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig)。

2.产生昆虫细胞系

使用Bac3000表达体系(EMD Biosciences，Inc.，Novagen Brand，441Charmany Drive，Madison，WI 53719，USA)完成瞬时转染的细胞系的快速产生。为此将编码(人)心钠钙交换蛋白的cDNA(NCX-1，即SLC8A1PDB-entry NM_021097)克隆进Bac3000表达载体(EMD Biosciences，Inc.，Novagen Brand，441Charmany Drive，Madison，WI 53719，USA)。根据生产商规程产生病毒后，使用三倍超量的病毒原种转染Sf9昆虫细胞。细胞在标准条件(27℃)下合适的培养基中保持培养。转染后3天收集膜。原种细胞培养物根据生产商规程保存。

特别地，该方法可如下进行：

2.1共转染制备重组病毒

为了共转染，应制备约10μg高度纯化且无菌的质粒DNA。为了为共转染提供细胞，建立6孔板用于每个转染以及阳性和阴性对照。每个孔中接种无血清培养基中1×10e6个Sf9细胞。通常允许细胞贴壁一小时。细胞贴壁时可制备转染混合物，其由15μl来自Novagen[0，02μg/μl]的BacVector3000、30μl Cellfectin(InVitrogen)、0.4μg重组供体质粒DNA pVL_NCX1和添加至50μl的蒸馏水组成。培育时间为室温下20分钟。该时段后每种混合物加入0.5ml培养基。如果细胞已贴壁，去除旧培养基并将转染混合物滴加入孔中。27℃培育4小时后加入1ml新鲜培养基(含10％血清)并随后在27℃再次培育4-5天。

2.2噬菌斑纯化以分离单克隆重组病毒克隆

5天后收集共转染平板的上清液(称为病毒原种VS0)。为了通过噬菌斑筛选鉴定重组病毒，建立每孔1×10E-6 Sf9细胞的另一六孔板。细胞应沉降至少30分钟。同时将病毒以10E-3、10E-4、10E-5、10E-6和10E-7的稀释度稀释至1ml等分试样。细胞良好附着在平板上后吸去培养基。向6孔板的每个孔中快速加入1ml稀释的病毒。将平板转移至摇动平台上并缓慢摇动至少2小时。此时制备低熔点琼脂糖的覆盖琼脂糖(临使用前)。使用下列混合物：添加20％胎牛血清的1份2X Grace′s培养基和1份溶于双蒸水的3％SeaPlaque琼脂糖。琼脂糖在微波炉中完全熔化。将1∶1混合物置于38℃水浴中。此时从孔中吸出所有培养基并向每孔中加入1ml覆盖混合物，使其从孔的远端壁上滑下并滑至平板上。覆盖细胞后，将平板在通风厨中30分钟。之后向每孔中加入1ml培养基以防止干涸。将平板置于27℃，98％湿度控制的培养箱中至少3天。

之后6孔板的每孔用1ml 1％中性红(neutral red)溶液染色噬菌斑。将平板放回培养箱至少4小时。在此期间，噬菌斑将开始显示为染色细胞中的透明点。用无菌的巴斯德吸管挑取一个(或更多)噬菌斑并转移进25cm2T-瓶中，总共2e6个Sf9细胞和有5％FCS的4ml培养体积。在27℃培育5-6天。收集培养物上清液(所谓的病毒原种VS1)并用于下一步骤：确定病毒效价。

2.3.用于确定病毒效价的噬菌斑测定

与2.2.下描述的方法相同。

计数噬菌斑并通过使用下列等式计算效价(例如计数20个噬菌斑)

效价(pfu/ml)＝2×10e7pfu/ml(噬菌斑形成单位/ml)

2.4.大规模(即1L)扩增重组病毒

对于病毒扩增通常使用0.1的M.O.I.(感染复数)，这意味着10个Sf9细胞1个病毒的比例。由于病毒具有继发感染周期的可能性，扩增时间应为约7天。在这期间，病毒将指数扩增且细胞培养物的生活力可降低到20-30％。为了产生高病毒效价，推荐补充5％FCS和使用具有无气泡通气的super-spinner培养容器。一周后收集培养物上清液(所谓的病毒原种VS2)。这是更大体积的病毒原种，其足够进行若干表达研究并可在4℃避光下保存若干月(高达一年)。

2.5.表达重组蛋白质NCX1

对于所有的表达实验推荐3的M.O.I(比例：3个病毒颗粒对1个Sf9细胞)和27℃下72小时的培育时间。

3.膜/蛋白质制备

通过从周围环境(瓶或身体)表面机械分离从天然组织或重组表达体系收获细胞。通过细胞破裂和随后的离心步骤和/或蔗糖梯度离心制备膜碎片。

特别地，该方法可如下进行：

3.1昆虫细胞膜/蛋白质制备

通过离心收获细胞后在液氮中快速冰冻来自Sf9悬浮培养物的约2g湿重的细胞并保存在-80℃用于进一步制备。

冰上解冻细胞沉淀并转移至冰预冷的缓冲液(0.25M蔗糖、5mM TrispH 7.5、2mM DTT，每50ml一片完整的蛋白酶抑制剂混合物片剂(RocheDiagnostics GmbH，Mannheim，Germany))中。

通过细胞破裂制备膜碎片。通过氮细胞破碎方法使用Parr CellDisruption Bomb(Parr Instrument Company，Illinois，USA)或通过Dounce匀浆方法使用Dounce Homogenisator(7ml，来自NovodirectGmbH，Kehl/Rhein，Germany)将细胞匀浆，并将混悬液在4℃和680g离心10分钟。收集上清液并再次在SW41甩平式转头上以4℃和100000g离心。

将沉淀重悬于约2ml的5mM Tris pH 7.5中。将悬浮液用(5mM Tris中)87％蔗糖调节到56％。然后建立以底部2ml 56％级分开始，然后是3ml 45％蔗糖，3ml 35％和2ml 16％蔗糖的蔗糖梯度。

再次在4℃和100000g离心2.5小时(或甚至更多)并用巴斯德吸管小心吸取梯度条带并收集在有5ml 100mM NaCl、1.5mM EDTA、40mMHepes pH 7.5的新管中。

然后进行另一离心步骤：30min 150000g，4℃。

产生的沉淀重悬于100mM NaCl、1.5mM EDTA、2mM DTT、40mMHepes pH 7.5、10％丙三醇。

4.传感器芯片制备

芯片包含NCX蛋白质，在所有情况下蛋白质粘附或附着在芯片上。这可通过例如疏水的、亲水的、离子的或共价的力发生。

这种测定的传感器芯片由例如带有金结构的borofloate玻璃基质组成。该装置可进一步被硫醇层覆盖并具有一个或若干个绝缘层。

在优选的实施方案中，带有金结构的borofloate玻璃用硫醇层和脂质膜覆盖，所述脂质膜由60重量单位的1，2-二植烷酰基(Diphytanoyl)-sn-甘油-3-磷酸胆碱(AVANTI 850 356)和1重量单位的十八胺(FLUKA)溶于800重量单位的正癸烷(详细地：50μl PC(AVANTI销售的己烷或CHCl₃中原液20mg/ml+10μl十八胺(5mg/ml己烷中))用氮蒸发，并吸收进400μl正癸烷中)组成。为此，将传感器芯片与30μL硫醇温育15分钟然后用异丙醇洗涤(3×70μL)并真空干燥。若干小时后将2μL脂质+30μL DTT-缓冲液(2mM，1.542mg DTT/50mL Puffer C)移液到传感器芯片上部并温育20分钟。为了产生功能性传感器芯片，将10μL目的膜+120μLDTT-Puffer混和并在冰上以30s间断超声粉碎2×10单位(0，5/30)。然后将缓冲液从传感器芯片上去除并用30μL含膜缓冲液代替，将缓冲液上下吸打并在4℃储藏至少12小时。

5.溶液交换方案

为了测定NCX蛋白质的活性，将其用洗涤、非激活和激活溶液连续处理并在从充电改变到激活处理时测量电流。用充电溶液(少钠、无钙的缓冲溶液)替换预温育溶液(含钠、无钙缓冲溶液)诱导跨含NCX蛋白质膜的Na⁺梯度。此后，用激活溶液(含Ca²⁺溶液)替换所述溶液触发NCX活性。随后以相反顺序替换溶液将传感器芯片还原为原始状态。

生物传感器系统的缓冲液容器A、B和C分别用“激活”缓冲液(30mMHEPES/NMG pH 7.4，140mM KCl，4mM MgCl₂，0.5mM CaCl₂)、“非激活”缓冲液(30mM HEPES/NMG pH 7.4，140mM KCl，4mM MgCl₂)和“洗涤”缓冲液(30mM HEPES/NMG pH 7.4，40mM KCl，100mM NaCl，4mM MgCl₂)充满后，将对照剂装在传感器支架上并用所有的缓冲液冲洗系统以从整个流体系统去除气泡。然后将空的或无效的(blind)传感器用预载有含NCX1 HEK膜碎片的基于标准玻璃的传感器替换(3mm直径的化学修饰金表面；IonGate Biosciences GmbH，Frankfurt/M.，Germany)。通过流体系统(包括传感器流动小室)的液体转运通过对缓冲液容器加压来实现。

通常在200mbar超压下进行测量，产生约300μl s^-1的流速。为了测量其活性，含NCX蛋白质的膜用“洗涤”、“非激活”和“激活”溶液连续处理。用“非激活”溶液替换“洗涤”溶液诱导跨含NCX蛋白质膜的Na⁺梯度。此后，用激活溶液替换“非激活”溶液触发NCX活性并在从“非激活”变为“激活”处理时测量从而诱导的电流。随后以相反顺序替换溶液将传感器芯片还原为原始状态。通过控制软件定义顺序，其中“洗涤”缓冲液流过传感器表面0.5s，然后是“非激活”缓冲液(2.0s)，“激活”缓冲液(2.0s)，“非激活”缓冲液(2.0s)和“洗涤”缓冲液(2.0s)。整个顺序中，数字化电流响应(2000个样品s^-1)并存为数据文件。对于剂量应答实验，将抑制剂分别溶解在“激活”、“非激活”和“激活”缓冲液中。所有的化学品为分析级或更高。

下列设置用于测量NCX1：

循环1：

  洗涤缓冲液  非激活溶液  激活溶液  非激活溶液  洗涤缓冲液  间断  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  1

5分钟间断

循环2：

  洗涤缓冲液  非激活溶液  激活溶液  非激活溶液  洗涤缓冲液  间断  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  1

5分钟间断并添加待分析的化合物

循环3：

  洗涤缓冲液  非激活溶液  激活溶液  非激活溶液  洗涤缓冲液  间断  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  1

5分钟间断

循环4：

  洗涤缓冲液  非激活溶液  激活溶液  非激活溶液  洗涤缓冲液  间断  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  42  0.5s  2s  2s  2s  4s  1

5分钟间断并添加另一浓度的相同化合物或另一化合物，等等。

6.实验

根据方案，结合在生物传感器表面的含NCX的膜碎片暴露于快速Ca⁺浓度跳变中，引起瞬时充电电流(图3a)。应再次说明，该实验结果特别优选实验前对生物传感器直接应用囊泡外Na⁺减少以产生钠梯度。电流快速衰减的原因是由于转运蛋白与膜碎片表面的失活和/或电容性偶联。实际上，稳定的电流为生物传感器夹层结构充电并从而产生仅允许对有限状态充电的电场——类似充电电容器的DC电源。

图3A显示典型的无细胞电生理NCX生物传感器在NCX特异抑制剂抑制前(黑线)和后(灰线)的记录。在所有溶液中不存在或存在10μM抑制剂A时经受快速Ca浓度跳变的生物传感器分别产生300pA或20pA的NCX峰电流，显示信号的特异性。应用10μM抑制剂导致NCX特异信号下降90.5％±5.1％(n＝5)。产生的剂量反应曲线在图3B中显示。记录应用0.01、0.1、1、5和10μM浓度抑制剂时的IC₅₀值(n＝5)。50％抑制的值可计算为0.86μM±0.22μM。Hill系数可计算为0.7±0.03。随后在没有抑制剂时的实验产生高达原始信号100％振幅的NCX峰电流，证明抑制剂的可逆性。

在对照实验中，可通过减少施加的Ca²⁺跳变和通过使用Ni²⁺的非特异性NCX1阻滞剂(5mM)减小电流。此外，不表达NCX1的细胞膜在类似的实验条件下不产生电流。

                            序列表

<110>塞诺菲-安万特德国有限公司

<120>鉴定调节钠/钙交换转运蛋白活性的化合物的方法

<130>DEAV 2004/0052

<160>1

<170>PatentIn版本3.2

<210>1

<211>25773

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<400>1

aagctttact cgtaaagcga gttgaaggat catatttagt tgcgtttatg agataagatt    60

ttcgaaatga gcatttcgct caacttccta gtataaatca acgcaaatac tctattctaa    120

gaaagcacgt gtaaaatgtt tcccgcgcgt tggcacaact atttacaatg cggccaagtt    180

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gtgactagcg aagaagatgt gtggaccgca gaacagatag taaaacaaaa ccctagtatt    420

cactgatcgc ttcttctaca cacctggcgt cttgtctatc attttgtttt gggatcataa    480

ggagcaataa tcgatttaac caacacgtct aaatattatg atggtgtgca ttttttgcgg    540

cctcgttatt agctaaattg gttgtgcaga tttataatac taccacacgt aaaaaacgcc    600

gcgggcctgt tatacaaaaa aattcaagta cctggccaga ctttgccgcc tgaaagcata    660

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caagttctta aataactgtg ccattttctt aaatgtcttt tcacagggcc gtacaaccac    840

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tttaacaaat actttatcct attttcaaat tgttgcgctt cttccagcga accaaaacta    1260

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acgaagcgaa cgaggcaaat cgaacatcgg ctagtcaccg caacaaggtt agctgccatc    1440

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ggttttccac gtacgtcttt tggccggtaa tagccgtaaa cgtagtgccg tcgcgcgtca    1620

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cgcacaacac cggatgtttg cgcttgtccg cggggtattg aaccgcgcga tccgacaaat    1740

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tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt acatgcggtt tagatcagtc atgacgcgcg    1980

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actggacgtt tagaaaccgg agctagacga acaggaacta ccgttgctac gcaagttatt    2160

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cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tggtctgctc aaataacgat ttgtatttat    2820

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tgtctacatg aacacgtata gctttatcac aaactgtata ttttaaactg ttagcgacgt    2940

acagatgtac ttgtgcatat cgaaatagtg tttgacatat aaaatttgac aatcgctgca    3000

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ggaaccggtg cttggcctgg acaaccagcg cgagatcgtg catggcgtcc aacttgcata    3120

cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa cgcgagccat tttgatacac gtgtgtcgat    3180

gaagaggttt aaatttaaga ggttaaaatt gcgctcggta aaactatgtg cacacagcta    3240

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ccgcgttcgc cgattttgca caacgcgcaa gttgcgccgt ttgtagcgtt ttcggttatc    3600

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atgtcaaaac taaacgtata attgccgcta aaaaatttaa tagaataaat tatttatcaa    3720

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gcaacccgta catgcaggct tgcaactaaa cgtacgttcg gctttaattt agtaacgcta    4320

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ttattatata atacatagcg tgcagttctt aattgttacg cgggcaacag cgtagagttg    4800

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gacaaaatgt tcatacagat gttctccata gctcgaccgt tcgtctcccc ctactaatab    10140

ykyvykryra gkrgmtgaac atgaaggaga caggccatct tctaagactg aaattgaaat    10200

ggacgggaaa gtggtacttg tacttcctct gtccggtaga agattctgac tttaacttta    10260

cctgcccttt caccabhgdr ssktmdgkvv caattctcat gttgaaaatt tcttagatgg    10320

tgctctggtt ctggaggtgg atgagaggga gttaagagta caacttttaa agaatctacc    10380

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ctttcctttt ctcttctaca gggaaacttg gacccgcttc atggaagaca gcttccccat    15120

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