一种验证性筛选目的结构域结合配体的方法

摘要

本发明公开了一种验证性筛选目的结构域结合配体的方法。该方法包括以下步骤：1)以目的结构域家族中结合特性有代表性的成员为诱饵蛋白筛选酵母双杂交文库；2)收集步骤1)筛选获得的结合配体克隆以及其它已知或可能的目的结构域结合配体克隆，得到目的结构域结合配体文库；3)以该结构域家族中的其它成员或步骤1)中的成员为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统验证性筛选步骤2)构建的结合配体文库，得到目的结构域的阳性和阴性结合配体；4)分析步骤1)和/或步骤3)筛选得到的目的结构域的阳性和阴性结合序列，总结结合特性和共有结合序列；5)预测目的结构域的配体蛋白；6)验证预测的相互作用，得到与目的结构域相互作用的配体蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种验证性筛选目的结构域结合配体的方法。

背景技术

目前，研究蛋白质结构域结合特性的方法有以下几种：

1)定向肽库(oriented peptide library)，最早的研究蛋白质结构域结合模体的方法，即将目的结构域与定向多肽库共同孵育，结合多肽以混合状态测序并用统计的方式确定共有结合序列。这种方法可以有效地揭示目的结构域对配体特定位点上的氨基酸的偏好性；缺点是不能确定配体特定位点上不能出现的氨基酸，也不能分离出独立的真实结合序列。

2)定向肽库芯片(oriented peptide array library)，此技术是定向肽库和芯片两种技术的结合，即先将数百个不同的、分别由多种定向多肽组成的定向肽库逐一合成在固相支持物上，然后用目的结构域进行筛选。这种方法能够从芯片上直接读出共有结合序列，无需测序；但也不能得到独立的真实结合序列，而且不能定量比较各种结合多肽与目的结构域的亲和力。

3)SPOT合成(synthesis of peptides on cellulose membranes)，即先用化学方法在纤维素膜上合成多种多肽，然后检测这些多肽与目的结构域的结合情况。此方法可以得到独立的真实结合序列。但是合成多肽的序列依赖于已知信息，因此无法发现新的、意想不到的结合序列；并且通量受限于膜上可合成多肽的数量。

4)噬菌体展示(phage display)，即多肽被展示在噬菌体表面，然后用目的结构域进行筛选。这种方法的筛选通量可以达到很高；但低亲和力配体往往被高亲和力配体掩盖，而无法有效地筛选获得。

上述方法都是体外实验方法，不仅需要纯化蛋白质，而且人为实验条件(如孵育温度、洗脱缓冲液pH值等)对结果影响很大。

酵母双杂交(yeast two-hybrid)是一种体内实验方法，已被广泛应用于蛋白质相互作用的的研究。该方法的优点是可以避免配体间亲和力的竞争，能够捕获弱的、瞬时的相互作用，而且可以得到独立的真实结合序列。但是传统的酵母双杂交方法通常用于筛选cDNA文库，文库中低丰度配体往往被高丰度配体所掩盖，因此想要全面地研究目的结构域的结合特性则需要反复筛选多种cDNA文库，同时需要进行大量测序工作。

上述方法都是针对某个特定的结构域进行的大规模筛选，费时费力。面对每种结构域家族中的数百个成员，如果逐一进行大规模筛选，工作量之巨大几乎不可能完成。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效的验证性筛选目的结构域结合配体的方法。

本发明所提供的验证性筛选目的结构域结合配体的方法，包括以下步骤：

1)用酵母双杂交系统，以目的结构域家族中结合特性有代表性的成员为诱饵蛋白筛选酵母双杂交文库，所述酵母双杂交文库包括随机多肽文库、或任一物种的细胞或组织的基因组文库或cDNA文库；

2)建立目的结构域结合配体文库：收集步骤1)筛选获得的结合配体克隆以及其它已知或可能的目的结构域结合配体克隆，得到目的结构域结合配体文库；

3)以该目的结构域家族中的其它成员或所述步骤1)中的结构域成员为诱饵蛋白，用酵母双杂交系统验证性筛选步骤2)构建的结合配体文库，得到目的结构域的阳性和阴性结合配体；

4)对步骤1)和/或步骤3)中筛选得到的每个目的结构域的阳性结合配体序列和阴性结合配体序列进行序列分析，总结每个目的结构域的结合特性，推测其共有结合序列；

5)用步骤4)中推测的共有结合序列检索蛋白质数据库，预测蛋白质数据库中所有可能与目的结构域结合的配体蛋白；再根据蛋白质的生物学信息，进一步预测最有可能的目的结构域的配体蛋白；

6)用常规的鉴定蛋白质相互作用的方法验证步骤5)预测的目的结构域结合配体蛋白，得到与目的结构域相互作用的配体蛋白。

所述步骤1)中的目的结构域的选择是多种多样的，该方法尤其适用于结合非修饰线形短肽的结构域，例如：PDZ结构域(识别S/T/Φ-x-Φ-COOH motif)、WW结构域(识别PPxY motif)、GYF结构域(识别PPG-F/I/L/M/V motif)、EVH1结构域(识别FPPPPxD/E motif)、SH3结构域(识别PxxP/RxxK motif)和VHS结构域(识别D/E-xxLL motif)等；选择目的结构域家族中结合特性有代表性的成员作为诱饵蛋白进行筛选，以使筛选获得的目的结构域结合配体能够涵盖所有的类型，如目的结构域为PDZ结构域时，可选择该结构域家族中的ZO-1 PDZ1，ZO-1 PDZ3，Erbin PDZ和GIPC PDZ结构域成员。

步骤2)中已知或可能的目的结构域结合配体克隆包括已知的目的结构域配体蛋白的cDNA克隆，预测的目的结构域配体蛋白的cDNA克隆，目的结构域结合多肽克隆以及目的结构域的潜在结合多肽克隆等。

若步骤3)没有筛选到足够数量的结合配体，则进行补充筛选，即以所述目的结构域为诱饵蛋白进行步骤1)的筛选，再将获得的结合配体克隆添加到步骤2)构建的结合配体文库中，扩充配体库，接着进行步骤3)-6)。

步骤5)中的蛋白质数据库可根据实际需要选择一个或/和多个蛋白质数据库，所述蛋白质数据库包括Swiss-Prot，Nr和IPI等；所述蛋白质的生物学信息，包括蛋白的亚细胞定位和已知功能等。

步骤6)中的验证方法可为酵母双杂交、蛋白质Pull-Down方法或免疫共沉淀方法等。

上述验证性筛选目的结构域结合配体的方法还包括将在步骤6)的验证实验中构建的天然蛋白克隆添加到步骤2)构建的结合配体文库的步骤，以扩充配体库。

本发明提供了一种验证性筛选目的结构域结合配体的方法。用该方法筛选目的结构域结合配体具有以下优点：一、高效性：由于一个结构域可以结合多个配体，一个配体可以被多个结构域识别；因此与某个结构域家族中的有代表性的成员结合的多肽，较完全随机的多肽，更有可能与该家族中的其它成员结合。所以，直接验证性筛选一个有针对性的、较小的配体库与传统筛选方法相比，可极大地提高筛选效率。本发明的配体库可由步骤1)的筛选、补充筛选获得的阳性结合配体克隆以及步骤6)中验证实验构建的配体克隆组成，随着整个体系的循环，配体库将逐渐扩大，验证筛选的效率还会不断提高。配体库中的配体序列都是已知的，因此步骤3)中验证筛选的结果—阳性序列和阴性序列，可直接读出，无需测序。二、实用性：目的结构域的阳性结合序列和阴性序列可通过本发明的验证性筛选方法快速获得。这些序列信息对准确分析结构域的结合特性是同等重要的，但是现有其它方法往往无法获得或忽略阴性结果。此外，精准结构域结合特性的获得有助于寻找和设计特定多肽，以用于科学研究和制备多肽类药物。鉴定出的特异性配体，即只被一个结构域家族成员识别而不与其它成员结合的配体，极有可能可作为阻断性多肽，用于蛋白相互作用的研究和相关疾病的治疗中。三、广泛适用性：本发明提供的验证性筛选目的结构域结合配体的方法适用于多种结合非修饰线形短肽的结构域，如：PDZ结构域、WW结构域、GYF结构域、EVH1结构域、SH3结构域和VHS结构域等。基于上述优点，本发明将在目的结构域结合配体的筛选及研制相关疾病的治疗性药物中发挥巨大作用。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为验证性筛选人类PDZ结构域结合配体的流程图

图2为PDZ结构域配体库配体类型分布图

图3为PDZ结构域配体库配体长度分布图

图4为验证性筛选实验(yeast mating assay)筛选效率

图5为验证性筛选实验(yeast mating assay)His⁺阳性克隆筛选结果

图6为验证性筛选实验(yeast mating assay)LacZ⁺阳性克隆筛选结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所有DNA合成和测序工作均由北京奥科生物技术有限公司完成。

实验材料：

1、菌株

E.Coli DH5α：基因型F^-，Φ80dlacZΔM15，Δ(lacZYA-argF)U169，deoR，end A1，recA1，hsdR17(r_k-，m_k+)，supE44，thi-1，gyrA96，relA1，phoA，λ^-。

酵母菌株(购自Clontech公司)：

  菌株基因型  报告基因  转化标记  CG1945MATa，ura3-52，his3-200，lys2-801，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4-542，gal80-538，cyh^r2，LYS2::GAL1_UAS-GAL1_TATA-HIS3，URA3::GAL4_17-mers(x3)-CyC1_TATA-lacZ  HIS3  lacZ     trp1  leu2  cyh^r2  Y187MATα，ura3-52，his3-200，ade2-101，trp1-901，leu2-3，112，gal4Δ，met^-，gal80ΔURA₃::GAl_UAS-GAL1_TATA-lacZ  lacZ  trp1  leu2

2、质粒载体(均购自Clontech公司)

pBridge：酵母双杂交GAL4 BD载体，含GAL4 DNA结合结构域(BD)编码序列；

pAS2-1：酵母双杂交GAL4 BD载体，含GAL4 DNA结合结构域(BD)编码序列；

pGADT7：酵母双杂交GAL4 AD载体，含GAL4激活结构域(AD)编码序列。

3、主要试剂和材料

限制性内切酶EcoR I和BamH I，T₄ DNA连接酶，T₄多核苷酸激酶，pfu DNA聚合酶均购自大连宝生物公司。DNA分子量标准购自北京天根生化科技有限公司。

各种培养基成分分别购自Clontech公司、Sigma公司及欣经科公司(日本进口分装)。

PEG4000，β-巯基乙醇，3-AT，LiAc，酸洗玻璃珠(Glass beads)购自Sigma公司。鲑精DNA购自北京博大泰克生物基因技术有限公司。

4、试剂盒

质粒小量制备试剂盒和DNA产物纯化试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒购自北京博大泰克生物基因技术有限公司。

5、主要溶液配制

1)50％PEG4000(100mL)

将50g PEG4000溶解于ddH₂O中至总体积100mL，高压灭菌，室温保存。

2)1M LiAc(100mL)

将10.2g LiAc溶解于ddH₂O中至总体积100mL，调节pH值至7.5，高压灭菌，室温保存。

3)1M 3-AT(100mL)

将8.4g 3-AT溶解于ddH₂O中至总体积100mL，过滤除菌，-20℃保存。

4)细菌培养基(1000mL)

  蛋白胨  (g)  酵母提取物  (g)  氯化钠  (g)  氨苄青霉素  储液(50mg/mL)  琼脂粉(g)  (仅固体培养基)  LB无抗性  LB+氨苄青霉素  10  10  5  5  10  10  ——  1000  15  15

配制方法：按上表分别称取各种试剂，加入800mL ddH₂O，用10M NaOH调节pH至7.0，定容至1000mL，高压灭菌，4℃保存。

5)酵母选择性培养基(1000mL)

  培养基类型  YNB  (g/L)  琼脂粉(g/L)  (仅固体培养基)  DO Supplement  (g/L)  SD/-Trp  SD/-Leu  SD/-Trp-Leu  SD/-Trp-Leu-His  SD/-Trp-Leu-His-Met  SD/-Trp-Leu-Met  6.7  6.7  6.7  6.7  6.7  6.7  20  20  20  20  20  20  0.74  0.69  0.64  0.62  0.60  0.62

配制方法：按上表分别称取各种试剂，加入ddH₂O定容至950mL，高压灭菌15min，冷却到约55℃，加入50mL 40％的消毒葡萄糖溶液(Dextrose)使之浓度为2％，4℃保存。

6)YPD的配制(1000mL)

细菌蛋白胨                        20g

酵母提取物                        10g

琼脂粉(仅固体培养基)              20g

配制方法：加ddH₂O至总体积为950mL，高压灭菌15min，冷却到约55℃，加入50mL 40％的消毒葡萄糖溶液(Dextrose)使之浓度为2％，4℃保存。

7)X-gal储液(20mg/mL)

取X-gal 200mg，用二甲基甲酰胺(DMF)定容于10mL，避光保存于-20℃。

8)PCI溶液

49％苯酚，49％CHCl₃，2％异戊醇。

9)Z溶液

Na₂HPO₄·7H₂O 16.1g/L，NaH₂PO₄·H₂O 5.5g/L，KCl 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.246g/L，调节pH值至7.0，高压灭菌，室温保存。

10)Z buffer/X-gal溶液(用于ONPG实验)

100mL Z buffer，0.27mL β-巯基乙醇，1.67mL X-gal储液。

11)10×TE(100mL)

1M Tris-HCl，10mM EDTA，溶于ddH₂O中至总体积100mL，调节pH至7.5，高压灭菌。

12)酵母裂解溶液(用于酵母DNA的提取)

300mM NaCl，10mM Tris，1mM EDTA，0.1％SDS，调节pH至8.0，高压灭菌。

实施例1、验证性筛选人类PDZ结构域的结合配体

现以人类PDZ结构域为例，用本发明的方法筛选该结构域的结合配体，流程图如图1所示，具体过程包括以下步骤：

一、以人类PDZ结构域家族中结合特性有代表性的成员为诱饵蛋白，用酵母双杂交技术筛选随机多肽文库

1、挑选人类PDZ结构域家族中结合特性有代表性的成员

PDZ结构域特异性地识别和结合配体蛋白C-末端的4个氨基酸残基。根据所识别氨基酸残基的不同，PDZ结构域被传统地分为四类：I类，-[S/T]-x-Φ-COOH；II类，-Φ-x-Φ-COOH；III类，-[D/E/K/R]-x-Φ-COOH；IV类，-x-ψ-[D/E]-COOH(x代表任意氨基酸，Φ代表疏水性氨基酸，ψ代表芳香族氨基酸)。

为使筛选获得的PDZ结构域结合配体能够涵盖所有的类型，首先选择四个人类PDZ结构域：ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3、Erbin PDZ和GIPC PDZ，将其作为诱饵蛋白分别筛选随机多肽文库。根据已知的结合序列推知ZO-1 PDZ1可结合I、II、III类配体，ZO-1 PDZ3结合II类配体，Erbin PDZ主要结合I类配体，GIPC PDZ主要结合I类配体，因此，以这四个PDZ结构域筛选随机多肽文库所获得的阳性配体，理论上可以涵盖PDZ结合配体的主要类型。

2、构建酵母双杂交诱饵质粒

A、ZO-1 PDZ1结构域诱饵质粒ZO-1 PDZ1-pBridge的构建

a)PCR扩增ZO-1 PDZ1(Swiss-Prot：Q07157，氨基酸1-105)的cDNA编码序列

以人类肝脏cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，在引物P1(上游引物)：

5’-CCGGAATTCATGGAGGAAACAGCTATATGGGAACAACAT-3’和P2(下游引物)：

5’-CGCGGATCCCTAAGGACGACTTACTGGTATTTGAACTTTCTT-3’的引导下，PCR扩增ZO-1PDZ1结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：人类肝脏cDNA文库1μl，引物P1和P2各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)EcoR I和BamH I双酶切PCR扩增产物和载体pBridge

用限制性内切酶EcoR I和BamH I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pBridge进行双酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的ZO-1 PDZ1结构域的诱饵质粒，命名为ZO-1 PDZ1-pBridge。

B、ZO-1 PDZ3结构域诱饵质粒ZO-1 PDZ3-pBridge的构建

a)PCR扩增ZO-1 PDZ3(Swiss-Prot：Q07157，氨基酸401-500)的cDNA编码序列

以人类肝脏cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，在引物P3(上游引物)：

5’-CCGGAATTCATGAAGATGGGATTTCTTCGGCCCAGCATG-3’和P4(下游引物)：

5’-CGCGGATCCCTATGATTCTACAATGCGACGATAAACATCCTT-3’的引导下，PCR扩增ZO-1PDZ3结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：人类肝脏cDNA文库1μl，引物P3和P4各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)EcoR I和BamH I双酶切PCR扩增产物和载体pBridge

用限制性内切酶EcoR I和BamH I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pBridge进行双酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的ZO-1 PDZ3结构域的诱饵质粒，命名为ZO-1 PDZ3-pBridge。

C、GIPC PDZ结构域诱饵质粒GIPC PDZ-pBridge的构建

a)PCR扩增GIPC PDZ(Swiss-Prot：O14908，氨基酸123-223)的cDNA编码序列

以人类肝脏cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，在引物P5(上游引物)：

5’-CCGGAATTCGACTTCATCTTCGCCCACGTGAAGGGGCAGCGCAAG-3’和P6(下游引物)：

5’-CGCGGATCCCTACTGGCTGATCATGTCGAAGGCCTTGCGAGG-3’的引导下，PCR扩增GIPCPDZ结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：人类肝脏cDNA文库1μl，引物P5和P6各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)EcoR I和BamH I双酶切PCR扩增产物和载体pBridge

用限制性内切酶EcoR I和BamH I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pBridge进行双酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的GIPC PDZ结构域的诱饵质粒，命名为GIPC PDZ-pBridge。

D、Erbin PDZ结构域诱饵质粒Erbin PDZ-pBridge的构建

a)PCR扩增Erbin PDZ结构域(Swiss-Prot：Q96RT1，氨基酸1273-1371)的cDNA编码序列

以人类T细胞cDNA文库(购自Stratagene公司)为模板，在引物P7(上游引物)：

5’-GAATTCGGCCATGAACTGGCAAAACAAG-3’和P8(下游引物)：

5’-GAATTCTTATGAGGAAACTTCTCGTAC-3’的引导下，PCR扩增Erbin PDZ结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：人类T细胞cDNA文库1μl，引物P7和P8各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)EcoR I单酶切PCR扩增产物和载体pBridge

用限制性内切酶EcoR I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pBridge进行单酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，EcoRI 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的Erbin PDZ结构域诱饵质粒，命名为Erbin PDZ-pBridge。

E、HtrA2 PDZ结构域诱饵质粒HtrA2 PDZ-pBridge的构建

a)PCR扩增HtrA2 PDZ结构域(Swiss-Prot：O43464，氨基酸343-454)的cDNA编码序列

以人类骨髓cDNA文库(购自Clontech公司)为模板，在引物P9(上游引物)：

5’-CGCGGATCCATCGTGGGGAAAAGAAGAATT-3’和P10(下游引物)：

5’-GGCGGATCCAGGGGTCACATATAAGGTCAG-3’的引导下，PCR扩增HtrA2 PDZ结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：人类骨髓cDNA文库1μl，引物P9和P10各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)BamH I单酶切PCR扩增产物和载体pBridge

用限制性内切酶BamH I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pBridge进行单酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，BamHI 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的HtrA2 PDZ结构域的诱饵质粒，命名为HtrA2 PDZ-pBridge。

F、LNX1 PDZ2结构域诱饵质粒LNX1 PDZ2-pACT2-1的构建

a)PCR扩增LNX1 PDZ2结构域(Swiss-Prot：Q8TBB1，氨基酸371-473)的cDNA编码序列

以IMAGE：5164034克隆(购自Invitrogen公司)为模板，在引物P11(上游引物)：5’-CCGGAATTCGATGCCTACAGACCCCGAGAT-3’和P12(下游引物)：5’-CGCGGATCCCTACTGAAAGATGTCAGGGCTCCG-3’的引导下，PCR扩增LNX1 PDZ2结构域的编码序列，20μl PCR反应体系为：IMAGE：5164034克隆1μl，引物P11和P12各1μl，dNTP(各2.5mM)1μl，10×PCR反应缓冲液2μl，Pfu DNA聚合酶1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl。PCR反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环；最后72℃延伸10min。反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳(电压100V，1h)检测，用小分子量DNA片段高效快速纯化回收试剂盒回收、纯化300bp的目的片段。

b)EcoR I和BamH I双酶切PCR扩增产物和载体pACT2-1

用限制性内切酶EcoR I和BamH I对步骤a)的PCR扩增产物和载体pAS2-1进行双酶切，酶切体系及条件为：PCR扩增产物/质粒载体10-12μl，10×反应缓冲液2μl，BamH I 1μl，EcoR I 1μl，用ddH₂O补充反应体系至20μl，37℃水浴反应2h，用DNA产物纯化试剂盒分别回收两种酶切产物。

c)连接

将步骤b)的两种酶切产物进行连接，连接体系及条件为：载体DNA 4μl(200ng)，目的DNA片段2μl(10ng)，10×反应缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，用ddH₂O补充反应体系至10μl，16℃水浴反应16h。

d)转化及鉴定

将步骤c)的连接产物用化学法转化E.Coli DH5α感受态细胞，将转化细胞铺于LB/氨苄青霉素固体培养基，挑取单克隆菌落，提质粒，用酶切、PCR和测序的方法进行鉴定，结果获得了正确插入目的DNA片段的LNX1 PDZ2结构域的诱饵质粒，命名为LNX1 PDZ2-pACT2-1。

经DNA测序鉴定，上述酵母双杂交诱饵质粒的核苷酸序列和读码框架均正确无误，可用于后续实验。

3、构建新型酵母双杂交随机多肽文库

现利用人类基因组DNA和烟草基因组DNA分别构建了10个新型随机多肽文库，具体构建方法参见申请号为02120209.5的专利“随机多肽文库构建方法”。将此10个随机多肽文库混合成一个更大的随机多肽文库，命名为“总随机多肽文库”。所有构建的新型随机多肽文库结果如表1所示：

                                 表1新型随机多肽文库列表

  新型随机多肽文库  基因组  DNA 基因组DNA 酶切  载体  载体  酶切  载体  修饰  转化克隆  数  人Tsp509I RFII  人  Tsp509I  pGADT7(-E)  EcoR I  是  1.14×10⁷  人Tsp509I RFIII  人  Tsp509I  pGADT7(+E)  EcoR I  是  2.4×10⁶  人DpnII RFII  人  DpnII  pGADT7(-B)  BamH I  是  1.05×10⁷  人DpnII RFIII  人  DpnII  pGADT7(+B)  BamH I  是  1.67×10⁷  烟草Tsp509I RFI  烟草  Tsp509I  pGADT7  EcoR I  否  5×10⁷  烟草Tsp509I RFII  烟草  Tsp509I  pGADT7(-E)  EcoR I  是  1.1×10⁷  烟草Tsp509I RFIII  烟草  Tsp509I  pGADT7(+E)  EcoR I  是  1.02×10⁷  烟草DpnII RFI  烟草  DpnII  pGADT7  BamH I  否  1.02×10⁷  烟草DpnII RFII  烟草  DpnII  pGADT7(-B)  BamH I  是  1.07×10⁷  烟草DpnII RFIII  烟草  DpnII  pGADT7(+B)  BamH I  是  1.5×10⁷  总随机多肽文库  1.5×10⁸

4、酵母双杂交筛选新型随机多肽文库

1)酵母菌株的保存与表型验证

用挑菌环蘸取少量保存于-80℃的酵母CG1945菌液，划线培养于YPD固体培养基上，30℃培养3-5天，直至菌落直径达2mm，4℃保存。

正常的酵母CG1945菌落由于ade2-101突变而呈粉色或红色，且直径大于2mm。现挑3-4个单克隆菌落接种于不同的选择性固体培养基(SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-His，SD/-Ura，YPD)，30℃培养4-5天，核对生长情况。

表型验证结果表明酵母CG1945菌株的所有表型完全正常。

2)酵母的小量快速转化(PEG/LiAc法)

a、挑取酵母CG1945单克隆菌落接种于3mL YPD液体培养基中，30℃、250rpm摇培14-16小时；

b、取1mL经培养的酵母菌置于1.5mL微量离心管中，12,000rpm离心20s；

c、将细胞重悬于1mL无菌ddH₂O中，12,000rpm离心20s；

d、将酵母沉淀重悬于1mL 100mM LiAc溶液中，30℃温浴5min；

e、12,000rpm，离心20s，吸弃上清，依次加入下述溶液：

240μl  50％PEG4000

36μl   1.0M LiAc

5μl    鲑精DNA(10.0mg/mL)

10μl   质粒DNA(100-5000μg)

45μl   ddH₂O

f、剧烈振荡混合溶液1min，充分悬浮细胞，42℃水浴20min；

g、12,000rpm离心20s，吸弃上清；

h、加入200-400μl ddH₂O，用加样器轻柔吹打，重悬细胞；

i、将转化细胞均匀涂布在SD/-Trp固体培养基上，30℃培养2-4天。

3)随机多肽文库转化含诱饵质粒的酵母CG1945(PEG/LiAc法)

a、挑几个直径为2-3mm含诱饵质粒的酵母CG1945克隆于0.5mL SD/-Trp液体培养基中，剧烈振荡打散菌落，使细胞均匀悬浮；然后转移菌液至50mL SD/-Trp液体培养基中，30℃、250rpm摇培18h，使之生长至平台期(OD₆₀₀＞1.5)；

b、转移培养后的菌液于300mL YPD液体培养基中，使菌液的OD₆₀₀＝0.2-0.3，30℃、250rpm，摇培3h；

c、将培养物转移到6个50mL离心管中，1000g室温离心5min；

d、弃去上清，共加入25-50mL ddH₂O，悬浮细胞；

e、将细胞集中在一个离心管中，1000g室温离心5min；

f、弃去上清，将细胞重悬于1.5mL新鲜制备的无菌1×TE/LiAc溶液(10mL1×TE/LiA溶液含：ddH₂O 8mL，10×TE 1mL，10×LiAc(1.0M)1mL)中；

g、在50mL离心管中依次加入随机多肽文库质粒10-50μg和鲑精DNA(10.0mg/mL)2mg并混合均匀；

h、加入1mL新鲜制备的酵母感受态细胞，混合均匀；

i、加入6mL PEG/LiAc溶液(10mL PEG/LiAc溶液含：50％PEG40008mL，10×TE1mL 10×LiAc(1.0M)1mL)并剧烈振荡2min使之混匀；

j、30℃、200rpm摇培30min；

k、加入0.7mL DMSO颠倒混匀；

l、42℃水浴15min，间或摇晃使之混匀；

m、冰浴1-2min；

n、1000g室温离心5min；

o、弃去上清，加入1×TE溶液4mL，悬浮细胞；

p、将细胞均匀涂抹于20个SD/-Trp-Leu-His固体培养基上(150mm)，30℃培养4-7天。

4)转化效率及筛选克隆数量分析

取少量转化细胞，分别按1∶10、1∶100、1∶1000的比例用ddH₂O稀释，各取100μl铺于SD/-Trp-Leu固体培养基上，30℃培养3-4天至菌落出现，选择菌落数介于30-300之间者计数，并按下述公式计算转化效率和筛选克隆数。

筛选克隆数(cfu)＝cfu/μg×转化DNA质量(μg)

5)β-半乳糖苷酶活性的检测

a、制备新鲜的Z buffer/X-gal溶液10mL，将一张干净滤纸置于其中，使其完全润湿；

b、挑取直径大于2mm的His⁺酵母菌落划在另一个新鲜的SD/-Trp-Leu-His固体培养基上，30℃培养2-4天；

c、用一张无菌、干燥的滤纸铺于平皿表面，在滤纸上扎3个不对称的小孔以确定方向；

d、待滤纸润湿后，立即用镊子揭下，将其置于液氮中，并使沾有酵母细胞的一面朝上，用镊子使滤纸完全浸没于液氮中1-2min；

e、取出滤纸，室温解冻；

f、将沾有酵母的滤纸小心置于步骤1)中润湿的滤纸上，并使有酵母细胞的一面朝上；

g、置于30℃温箱内，定期观察酵母颜色变化情况，8小时以内颜色变蓝的菌落为阳性克隆。

6)阳性结合配体质粒(阳性AD克隆质粒)的提取

a、挑取阳性酵母克隆于3mL SD/-Leu液体培养基中，30℃、250rpm摇培12-24小时；

b、12,000rpm离心20s，收集酵母细胞；

c、将沉淀重悬于200μl酵母裂解液中，振荡使其充分重悬；

d、加入酸洗玻璃珠，使总体积至400μl，剧烈振荡1min；

e、加入200μl PCI溶液，剧烈振荡1min；

f、12,000rpm离心5min；

g、小心吸取上清至另一个离心管中，加入200μl PCI溶液并剧烈振荡，12,000rpm离心5min；

h、小心吸取上清至另一个离心管中，加入200μl CHCl₃抽提；

i、小心吸取上清至另一个离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，室温放置15min，

j、12000rpm离心10min沉淀DNA；

k、用1mL 70％的乙醇洗涤2遍，离心回收沉淀；

l、干燥沉淀，溶解于10-20μl ddH₂O中；

m、电转化1μl DNA溶液于E.Coli DH5α感受态细胞中，铺于LB/氨苄青霉素固体培养基上，37℃培养14-16h，挑取单克隆菌落，提取质粒。

7)酵母双杂交二次转化实验

现用酵母双杂交的方法进行二次转化实验，以再次验证筛选获得的阳性相互作用，即将筛选出来的阳性AD质粒分别一一转化到含诱饵质粒的CG1945酵母细胞中，检测转化酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性，确定两个蛋白之间的相互作用，具体方法包括以下步骤：

a、挑选含诱饵质粒的CG1945酵母单克隆菌落接种于3mL SD/-Trp液体培养基中，30℃、250rpm摇培14-16小时；

b、12,000rpm离心20s，收集所有酵母细胞；

c、将酵母细胞重悬于1mL ddH₂O中，12,000rpm离心20s，收集酵母细胞；

d、将酵母细胞重悬于1mL 100mM的LiAc溶液中，30℃温浴5min；

e、12,000rpm离心20s，收集酵母细胞，吸弃上清，依次加入下列溶液：

240μl   50％PEG4000

36μl    1.0M LiAc

5μl     鲑精DNA(10.0mg/mL)

10μl    AD质粒(100-5000μg)

45μl    ddH₂O

f、剧烈振荡溶液至少1min，使细胞充分悬浮，42℃水浴20min；

g、12,000rpm离心20s，弃上清；

h、加入200-400μl ddH₂O重悬细胞；

i、将细胞均匀涂布在SD/-Trp-Leu-His的固体培养基上，30℃培养3-7天。

8)β-半乳糖苷酶活性检测

检测步骤7)酵母双杂交二次转化实验中获得的酵母克隆的β-半乳糖苷酶活性，方法同步骤5)，此步骤中获得的LacZ⁺克隆确定为阳性结合配体。

9)阳性质粒的测序

将步骤8)鉴定出的阳性结合配体克隆送北京奥科生物技术有限公司测序。

结果用诱饵蛋白PDZ结构域ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3、Erbin PDZ和GIPC PDZ筛选新型随机多肽文库分别得到了42、37、34和15个非冗余阳性结合配体，其C-末端序列见表2：

             表2  PDZ结构域筛选随机多肽文库结果——结合配体C-末端

  ZO-1 PDZ1  ZO-1 PDZ3  Erbin PDZ  GIPC PDZ  AVIHFTYI*  WAWTDEWV*  ELSFGTWV*  STDGVSPC*  FPYYRTYI*  LRVDLGWV*  FVLRQTWV*  SRDGVSLC*  PNKLKTYI*  VDPWLVWV*  PSSGETWV*  SRDGVSSC*  RVLRITYI*  YLALEDYL*  EFFTQTWV*  WARSTSHC*  PEHHITYI*  FFLMSVFL*  YGTNQTWV*  SRDGVSRC*  RYGISTYI*  IQWITSWF*  EEFITTWV*  CNITESHC*  CLPRTTWL*  KFLDTMWV*  RPCWETWV*  ITSHSSYC*  MEQAKTWL*  RRLCSFWV*  GTNQETWV*  TAASTSQA*  RSFQVTYL*  FILLIIFL*  SEFIETWV*  YSDDCSSV*  FLLKCTYL*  FWIWDFWI*  IAKTETWV*  LTDDSSEV*  TVAKKTYL*  KFWVSGYL*  CRNAETWV*  EFLDSSEV*  ASEFKTYL*  FILESIFL*  NVSNETWV*  TRNDETLI*  AFKRFTYL*  LFLWNLFY*  IFLTETWV*  VTNEETEA*  AKGRQTFL*  FILNTLFL*  EFCVMTWV*  FAVEETEV*  FRAQQTFL*  FILFCLFV*  CFYEETFL*  YCLQETQC*  QNGEITYL*  SILAKIFL*  RTDFETFV*  PLGGQTYV*  ELWFTPWL*  YHDQETFV*  VSLAWTYV*  QFLDTVFF*  SGVRETYV*  QTAQCTYV*  RVIADGWV*  PLFKETEV*  DYWARTFV*  IVLDHIFY*  SEFLITDV*  NVHTKTFV*  FIFRYIFL*  SEFEQSWV*  QFQLSTYV*  DHIISDWI*  KGALESWV*  TERSITYV*  SPKDINWI*  LHSFDSWV*  ISGTQTYV*  FALKTGIV*  DFTFDSWV*  EIFARTYV*  FLLKYMFW*  LCFLDSWV*  KSVGKTWV*  FILLTIFF*  SEFEESWI*  FFYYTSYL*  SFWVTGWI*  KVWLESFV*  LLRVTSYL*  VFLDILFL*  EFNIESDV*  IFSFKSYL*  KNVKSFWI*  SEFEEAWV*  PWASQSYL*  SILEEIFK*  VDGDEAWV*  GMSHQSWL*  LILRCIFF*  LTDFDIEV*  AWTFQSRV*  FILKYIFN*  EASMDVWV*  SYSVFTIL*  IQLSEVWV*  FAVTEVWV*  EWGLISWV*  SLPWSFWV*  YFLKDEWV*  WYKKESWV*  FHSVSEWV*  KIQKISWV*  FILRYIFE*  CSSKCVWL*  LFLWNLFF*  LWGLTEYV*  KVSMLTWC*  FYRLSVYC*  QEKNMTYC*  SYAWVTYT*

二、PDZ结合配体文库的构建及分析

1、PDZ结合配体文库的构建

1)收集所有步骤一中筛选获得的非冗余阳性PDZ结构域结合配体克隆，提取质粒；

2)将阳性克隆分别转化到Y187(MATα)酵母细胞中，方法同步骤一；

3)挑取转化后的酵母细胞于SD/-Leu液体培养基中，30℃、250rpm摇培14-16小时；

4)将培养的酵母菌液加入20％甘油溶液，-80℃保存。

结果得到由128个非冗余PDZ结合配体组成的PDZ结构域结合配体文库。

2、PDZ结合配体文库的分析

为检测步骤1构建的配体库是否能够用于验证性筛选研究新的PDZ结构域，现对其配体的类型和长度进行了分析，其配体类型的分布如图2所示，该配体库中每类配体分别是I类72个(56.25％)，II类35个(27.34％)，III类6个(4.70％)，IV类1个(0.80％)，非常规配体14个(10.90％)。除了四类传统的PDZ结合配体外，此配体库还包括非常规的结合配体(0位是C或亲水性氨基酸的配体)，筛选这些非常规配体极有可能发现新的PDZ结合保守序列，由于I类和II类配体是PDZ结构域结合的主要的、最多的配体，所以此配体库中配体类型的分布与PDZ结构域配体结合类型的偏好性一致。配体长度分布的统计结果如图3所示，配体库中配体的长度最短的是6个氨基酸残基、最长的是91个氨基酸残基，绝大多数配体的长度是6-20个氨基酸残基。由于PDZ结构域是特异性地识别和结合配体C-末端的4个氨基酸残基，所以配体库中配体的长度完全满足PDZ结构域的识别要求。上述配体类型分布和长度分布分析结果均表明此配体库适用于验证性筛选PDZ结构域结合配体。

三、酵母双杂交(酵母接合实验，yeast mating array)验证性筛选PDZ结构域结合配体文库

1)将步骤一构建的含有目的PDZ结构域的酵母双杂交诱饵质粒转化CG1945(MATa)酵母细胞；

2)分别取步骤二构建的PDZ配体库中每种配体的酵母菌液(MATα)10μl点在96孔培养板上，并分别与60μl含诱饵质粒的酵母菌液(MATa)混匀，将混合物分别点在96孔YPD固体培养基上，30℃培养30h；

3)将生长出的酵母菌落转移至96孔SD/-His/-Leu/-Trp固体培养基上，30℃培养2-4天，筛选His⁺阳性克隆，筛选结果如图5所示；同时，将生长出的酵母菌落转移至96孔SD/-Leu/-Trp固体培养基上，30℃培养2-4天，检测筛选效率，检测结果如图4所示，酵母接合效率为100％；

4)检测96孔SD/-His/-Leu/-Trp固体培养基上生长的酵母克隆的β-半乳糖苷酶活性，筛选LacZ⁺阳性克隆，筛选结果如图6所示；由于配体序列是已知的，所以，可直接从颜色变化读出阳性和阴性结合配体的序列。

结果以HtrA2 PDZ结构域和LNX1 PDZ2结构域为诱饵蛋白，用高通量的酵母双杂交接合实验验证性筛选PDZ配体库，分别得到38和83个阳性结合配体，其C-末端序列见表3；以ZO-1 PDZ1、ZO-1 PDZ3和Erbin PDZ结构域为诱饵蛋白，验证性筛选PDZ配体库，分别得到16、0和3个新的阳性结合配体，并且每个PDZ结构域都鉴定出了阴性结合序列。

       表3  PDZ结构域验证筛选阳性结果—结合配体C-末端

  HtrA2 PDZ                 LNX1 PDZ2  KTETWV*  CWETWV*  SMDVWV*  DGVSPC*  SGETWV*  NQETWV*  LSEVWV*  DGVSLC*  LRQTWV*  LTETWV*  FEEAWV*  DGVSSC*  SFGTWV*  SGETWV*  GDEAWV*  RSTSHC*  FITTWV*  FIETWV*  VTEVWV*  DGVSRC*  CVMTWV*  KTETWV*  LGDLWV*  ITESHC*  VGKTWV*  NAETWV*  LCSFWV*  SHSSYC*  GLISWV*  SNETWV*  PWSFWV*  LQETQC*  FEQSWV*  FTQTWV*  VDLGWV*  SMLTWC*  QKISWV*  LRQTWV*  PWLVWV*  KNMTYC*  SHQSWL*  TNQTWV*  LDTMWV*  FLITDV*  DFETFV*  SFGTWV*  LKDEWV*  LALFFL*  WARTFV*  FITTWV*  WTDEWV*  LDSSEV*  HTKTFV*  VGKTWV*  SVSEWV*  DFDIEV*  GRQTFL*  CVMTWV*  RKSEWV*  LKTGIV*  RSITYV*  ALESWV*  IWDFWI*  NEETEA*  FARTYV*  SFDSWV*  VKSFWI*  RLSVYC*  IHFTYI*  FLDSWV*  IISDWI*  KLKTYI*  TFDSWV*  KDINWI*  EFKTYL*  FEQSWV*  WVTGWI*  KRFTYL*  KKESWV*  WFTPWL*  GEITYL*  EEESWV*  SHQSWL*  SFKSYL*  LFCLFV*  GGQTYV*  WITSWF*  DFETFV*  PFSTYV*  KNMTYC*  DQETFV*  VRETYV*  VTLSHV*  GYTGFV*  TSTSYV*  VSLSHV*  LAKVFV*  WFGVYI*  AFASHV*  VSSIFV*  HHITYI*  VTEVWV*  DFTEFV*  GISTYI*  LSEVWV*  FKETEV*  LRITYI*  PWSFWV*  FRETEV*  IHFTYI*  LDTVFF*  AVETDV*  FQVTYL*  LLTIFF*  RVETDV*  WVSGYL*  RLSVYC*  WVTGWI*  SVSEWV*  IISDWI*

四、PDZ结构域结合特性的分析和配体蛋白的预测

1、首先将每个PDZ结构域筛选获得的所有阳性配体序列作序列比对，并对比分析阴性序列，总结每个PDZ结构域的结合特性，推测共有结合序列，结果如表4所示。

2、根据共有结合序列用Tailfit软件检索蛋白质数据库中所有C-末端序列符合共有结合序列的天然蛋白。

3、根据蛋白质的生物学信息，如亚细胞定位、已知功能，进一步筛选出高可信度的配体蛋白，结果如表4所示：

                            表4  用生物信息学预测的配体蛋白

  PDZ  共有结合序列                               预测配体蛋白  SwissProt  ID  C-末端                     蛋白名称  ZO-1  PDZ1  [S/T]-ψ-[V/I/L/  C]^*  Q15760  SNPPNTFV  Probable G protein-coupled receptor GPR19  P56750*  SKTSTSYV  Claudin-17  P32745*  STMRISYL  Somatostatin receptor type 3  O60229*  GDPFSTYV  Huntingtin-associated protein-interacting protein  Q9GZW8  KSSSRSWI  Membrane-spanning 4-domains subfamily A member 7  Q9ULI0  VHMFETFL  Hypothetical protein KIAA 1240  Q86W26*  ETPKNTYI  NACHT-，LRR-and PYD-containing protein 10  Q92823-1  VNAMNSFV  Neuronal cell adhesion molecule  [D/E]-Y-V^*  O95832*  PSSGKDYV  Claudin-1  O15551*  GYDRKDYV  Claudin-3  O95471*  SNSSKEYV  Claudin-7  Q8N6F1  SAAAREYV  Claudin-19  [S/T]-[K/R/H]-[  V/I/L]^*  P19320  VEAQKSKV  Vascular cell adhesion protein 1  Q9UBN4*  EDYVTTRL  Short transient receptor potential channel 4  Q96J84*  QQRMQTHV  NEPH1(Kin of IRRE-like protein 1)  ZO-1   PDZ3   [L/W]-x-x-[V/I/   L/M/F/G/P/D/E]   -ψ-[V/I/L/ψ]^*  Q14232  DELIKLYL  Translation initiation factor eIF-2B alpha subunit  Q99502  HALELEYL  Eyes absent homolog 1  Q99504  QALELDFL  Eyes absent homolog 3  P17181  EELQQDFV  Interferon-alpha/beta receptor alpha chain  Q8NH51  NNLCNIFV  Olfactory receptor 8K3  Q96AC1*  YKLTSGWV  Pleckstrin homology domain containing family C member 1；Mig-2  Q92599  ATWREGFL  Septin 8  O43815  DALAKVFV  Striatin  O14798  IVLLIVFV  Tumor necrosis factor receptor superfamily member 10C  Q9Y5U5*  GRLGDLWV  TumoF necrosis factor receptor superfamily member 18  Q86YO7  VFLALFFL  Serine/threonine-protein kinase VRK2  Q9H1J5  RVWFGVYI  Wnt-8a protein  Erbin  PDZ  [D/E/Q]-[S/T]-[  W/F]-[V/L]^*  Q8NHY3*  PPEEESWV  GAS2-related protein isoform beta  P09619  AEAEDSFL  PDGF-R-beta  O00141  APPTDSFL  Serine/threonine-protein kinase Sgk1  O00192*  PQPVDSWV  Armadillo repeat protein deleted in velo-cardio-facial syndrome  Q9UQB3*  PASPDSWV  Catenin delta-2  Q99569-2*  PGSPDSWV  p0071(plakophilin-4)  [D/E/Q]-[S/T]-[  D/E]-V^*  O60242  EGDFQTEV  Brain-specific angiogenesis inhibitor 3  Q13224  LSSIESDV  NR2B  O15399  FSSLESEV  NR2D  P15385  AKAVETDV  Potassium channel Kv 1.4  P27228  PTRRETEV  VE6 HPV35 E6 protein  P03409*  KHFRETEV  TAX HTLV-1  Q96KB5*  VEALETDV  PDZ-binding kinase  Q99434  RLRVETDV  ARHGEF 16 protein  [D/E]-[V/L]-W-  V^*  Q9Y5U5  GRLGDLWV  Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18  HtrA  2  [S/T]-ψ-[V/L]^*  Q8TBB1  VSWPGTFL  LNX1 protein  P46937*  KESFLTWL  Yes-associated protein  [S/T]-[D/E]-   ψ-[V/I/L]^*  P49815*  VEDFTEFV  Tuberin  Q8N2R7*  RARKSEWV  Connexin40.1  Q9Y4Z2  SLAFSDFL  Neurogenin 3  [S/T]-[V/I/F/G]-  [W/F]-[V/L]^*  Q12906-5*  TAGYTGFV  Interleukin enhancer binding factor 3 isoform c  P43234*  DSVSSIFV  Cathepsin O  T-[H/R]-V^*  Q99952*  PPAEWTRV  Protein-tyrosine phosphatase，non-receptor type 18  Y-C^*  P15498  EEDYSEYC  Vav proto-oncogene  Φ-Y-[V/I/L]^*  P35961*  CGGEFFYV  Envelope glycoprotein(HIV)  Q95835*  KNRDLVYV  WARTS protein kinase  P49768*  LAFHQFYI  Presenilin-1(PS1)  LNX   1   PDZ2   [S/T]-x-C^*  Q06418*  GLLPHSSC  Tyrosine-protein kinase receptor TYRO3  Q99966*  TADFPSSC  Cbp/p300-interacting transactivator 1  Q9P2M7*  SNLQTSSC  Cingulin  P43119*  ASVACSLC  Prostacyclin receptor  Q9Y345*  DLELGTQC  Sodium-and chloride-dependent glycine transporter 2  P57058*  ADGVKTQC  Hormonally upregulated neu tumor-associated kinase  P48546*  SRELESYC  Gastric inhibitory polypeptide receptor  D-S-W-V^*  O00192*  PQPVDSWV  Armadillo repeat protein deleted in velo-cardio-facial syndrome  Q9UQB3*  PASPDSWV  Catenin delta-2  Q99569-2*  PGSPDSWV  p0071(plakophilin-4)  [S/T/E]-[W/Y/F   ]-V^*  P56750*  SKTSTSYV  Claudin-17  O60229*  GDPFSTYV  Huntingtin-associated protein-interacting protein  Q8NHY3*  PPEEESWV  GAS2-related protein isoform beta  P49815*  VEDFTEFV  Tuberin  Q8N2R7*  RARKSEWV  Connexin40.1  [G/I/L]-[W/F]-   V^*   Q12906-5*  TAGYTGFV  Interleukin enhancer binding factor 3 isoform c  P43234*  DSVSSIFV  Cathepsin O  Q9Y5U5*  GRLGDLWV  Tumor necrosis factor receptor superfamily member 18  [V/F]-[F/Y]-[V/  I/L]^*  Q86Y07*  VFLALFFL  Serine/threonine-protein kinase VRK2  Q9H1J5*  RVWFGVYI  Wnt-8a protein  O43815*  DALAKVFV  Striatin  E-T-[D/E]-V^*  P15385*  AKAVETDV  Potassium channel Kv1.4  Q99434*  RLRVETDV  ARHGEF 16 protein  P03409*  KHFRETEV  TAX HTLV-1

五、实验验证的预测的相互作用(酵母双杂交系统验证)

1)合成表达上述预测配体蛋白的C-末端10个氨基酸残基的寡聚核苷酸，以Claudin-17为例，合成表达蛋白Claudin-17(预测的ZO-1 PDZ1配体蛋白)C-末端10个氨基酸残基的寡聚核苷酸：正义链

5’-AATTCATGCTTAGTAAGACCTCCACCAGTTATGTCTAAG-3’和反义链

5’-GATCCTTAGACATAACTGGTGGAGGTCTTACTAAGCATG-3’；

2)插入片段的制备

将上述合成的编码Claudin-17C-末端10个氨基酸残基的正义链和反义链进行磷酸化和退火，方法为：

a)在0.5mL离心管中配制反应液：10×ATP(1mM)5μl，10×T₄多核苷酸激酶缓冲液5μl，T₄多核苷酸激酶5μl，ddH₂O 30μl；

b)将此反应液平均分成A、B两管(22.5μl/管)，在A管中加入正义链2.5μl，在B管中加入反义链2.5μl(正、反义链的原始浓度均为11.5μM)；

c)A、B管均于37℃温育1h，合并A、B管的反应产物，共获得反应液50μl；

d)将此反应液于80℃反应30min；置于室温20min，使正、反义链之间退火；

e)在退火后反应液中加入450μl ddH₂O稀释，得到反应液C。

3)连接

将步骤2)获得的Claudin-17 C-末端10个氨基酸残基的编码序列连接入载体pGADT7中，连接体系为：经EcoR I和BamH I双酶切的载体pGADT7 1μl，反应液C7μl，10×连接缓冲液1μl，T₄ DNA连接酶1μl(2U)，16℃反应16个小时；

4)将连接产物转化E.Coli DH5α感受态细胞中，铺于LB/氨苄青霉素固体培养基上，37℃培养14-16小时；

5)挑取单克隆菌落，提质粒，用PCR和酶切反应鉴定是否正确插入目的DNA片段，将阳性克隆送北京奥科生物技术有限公司测序；

6)将构建的表达预测配体蛋白C-末端的AD质粒与表达相应PDZ结构域的BD质粒一起转化酵母CG1945；

7)检测转化酵母细胞的β-半乳糖苷酶活性；

8)将构建的天然蛋白C-末端克隆加入到所构建的PDZ配体库中，扩充配体库。

经上述实验验证，四种PDZ结构域(ZO-1 PDZ1，PDZ3，Erbin PDZ和GIPC PDZ)都发现了新的配体蛋白，见表4中*标示的蛋白。

以上实施例是以人类PDZ结构域为例，说明了本发明验证性筛选该结构域结合配体的方法，与此类似，本发明的方法完全适用于筛选WW结构域，GYF结构域，EVH1结构域，SH3结构域和VHS结构域等其它结合非修饰线形短肽结构域的结合配体，理由如下：绝大多数蛋白质相互作用是通过相互作用结构域与其识别模体的结合完成的。很大一部分相互作用结构域识别和结合的是非修饰线形短肽，包括PDZ结构域(识别S/T/Φ-x-Φ-COOH motif)，WW结构域(识别PPxY motif)，GYF结构域(识别PPG-F/I/L/M/V motif)，EVH1结构域(识别FPPPPxD/E motif)，SH3结构域(识别PxxP/RxxK motif)和VHS结构域(识别D/E-xxLL motif)等多种结构域。这些结构域的结合特性有着共同的特点：1)其识别模体都是配体蛋白上的一段保守的线形短肽；2)这些结构域家族的不同成员之间有着相同或相似的结合特性，因此彼此之间所识别的配体有差异，也有重叠；3)在某个结构域家族中，一个成员可以结合多个配体，一个结合配体能够被多个成员识别。上述这些共同的特点正是本发明方法建立的理论基础，凡满足这些特点的结构域均适用于本发明的方法。上述实施例只是以PDZ结构域为例，详细阐述和证明了本发明方法的原理和可行性，其它结构域在此不再一一赘述。

用本发明的方法获得的结合配体和构建的结构域结合配体文库可用于蛋白质和多肽功能的研究以及相关药物的研发。