盘基网柄菌的半合成培养基及其制备方法

摘要

盘基网柄菌的半合成培养基及其制备方法，涉及一种细菌培养基。提供一种适合于盘基网柄菌高密度生长，并充分表达基因工程产物的半合成培养基及其制备方法。其组成为有机成份：酵母粉、细菌用胰蛋白胨、酪蛋白胨、朊蛋白胨和碳源，碳源为葡萄糖或麦芽糖；无机盐：KCl、MgCl

说明书

技术领域

本发明涉及一种细菌培养基，尤其是涉及一种适合于盘基网柄菌(Dictyosteliumdiscoideum)高密度培养及生产基因工程产物用的半合成培养基。

背景技术

目前常用的表达系统宿主有原核的大肠杆菌和真核的酵母菌、昆虫细胞及动物细胞系等。随着重组蛋白药物研究的深入和功能基因组时代的研究要求，上述常用系统在高通量表达真核基因方面都存在不同程度的局限性。大肠杆菌表达系统通常不拥有各种翻译后修饰加工功能，且表达的异源蛋白质通常以不溶的包涵体形式存在于细胞内，不适合用于大规模生产重组异源蛋白。酵母菌由于对某些重组蛋白质会进行超糖基化，从而阻碍了蛋白质的正确折叠。昆虫细胞的糖基化能力通常只适用于生产含高甘露糖单元的糖蛋白，且昆虫细胞生长缓慢，往往需要昂贵的培养基，限制了其应用范围。哺乳动物细胞由于表达技术十分复杂和耗时，细胞生长缓慢，而且往往需要使用含血清的培养基，产物容易被病毒等污染等，使其大规模培养技术的建立极其困难。

近年来，在悬浮培养中单细胞生长的盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)已发展成为一个前景广阔的表达重组蛋白的真核系统(Glenn D，Williams KL.Dictyostelium discoideum：its future in biotechnology.Austr J Biotech 1：46-51(1988))。盘基网柄菌属于真菌界的粘菌亚界的聚粘霉纲，由Raper于1935年发现。该系统表达糖蛋白具有很多优越性：盘基网柄菌是少数几种拥有环状核酸质粒的真核生物之一，且质粒打包于一个核粒结构中，与高等生物的染色质组织相似(Rai M，Padh H.Expression systems for production of heterologous proteins.Curr Sci 80：1121-1128(2001))；盘基网柄菌拥有许多与哺乳动物细胞相似的复杂特征，能进行各种翻译后修饰，如磷酸化、酰基化，形成糖基磷脂酰肌醇锚点(glycosylphosphatidylinositolanchors)，特别重要的是，它能进行氮和氧结合的简单和复杂的糖基化，而且其糖基化机制与高等生物非常相似(Heikoop JC，Grootenhuis PDJ，Blaauw M，Veldema JS，van Haastert PJM，Linskens MHK.Expression of a bioactive，single chain choriogonadotropin in Dictyosteliumdiscoideum.Eur J Biochem 256：359-363(1998)；Jung E，Williams KL.The production ofrecombinant glycoproteins with special reference to simple eukaryotes including Dictyosteliumdiscoideum.Biotechnol Appl Biochem 25：3-8(1997))；作为广泛被研究的模式生物，盘基网柄菌的遗传背景较清楚，已完成了全部基因组测序工作，并发展了不少表达载体和简单的转化技术，为这一真核表达新系统建立提供了良好的前提条件；重组蛋白由染色体外的质粒表达复制，可利用简单的方法回收用于序列分析，而且可在此生物中应用随机突变方法产生成千上万个克隆子，从而避免了在昂贵而难处理的哺乳动物细胞系进行分析；盘基网柄菌质粒的高拷贝数可使蛋白质在可调节的启动子的严格控制下以胞内、膜结合或胞外分泌的形式大量表达。利用该系统表达动植物基因能在相当大的程度上阐明高等真核生物乃至人类基因表达调控的基本原理以及基因编码产物结构与功能之间的关系。

目前制约盘基网柄菌成为通用表达系统的最主要问题是其高密度培养的困难。在细菌或无菌复合培养基上悬浮培养盘基网柄菌，所能达到的最大细胞密度约为(1～2)×10⁷细胞/mL，难以进一步提高(Frank J，Kessin R.A defined minimal medium for axenic stains ofDictyostelium discoideum.Proc Natl Acad Sci U S A 74：2157-2161(1977)；Stephan M.Untersuchung zur Kultivierung yon Dictyostelium discoideum.Dissertation，Faculty ofTechnology，University ofBielefeld，Germany(1997))。与其它微生物表达系统如E.coli、酵母菌等相比，这个细胞密度相当低。因此有必要在改善盘基网柄菌的培养方面进行深入研究，以提高表达效率和使利用这一表达系统大规模生产复杂的药物蛋白成为可能。

培养基组分是人为提供给微生物的最重要的培养环境，是影响微生物生长增殖和代谢产物合成的重要因素。用于培养盘基网柄菌的无菌培养基可分为三类，即复合培养基、半合成培养基和合成培养基。复合培养基由碳源(葡萄糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、果糖、蔗糖或甘露糖)、提取物(蛋白胨、酵母粉、胰蛋白胨)和用于稳定培养液pH的磷酸盐(Na₂HPO₄和KH₂PO₄)组成。半合成培养基则由提取物和已知成分组成。合成培养基由各种成分已知的化学物质组成，主要是葡萄糖、氨基酸、维生素、无机盐和微量元素。

在改进培养基组成方面，Han等(Han SI，Friehs K，Flaschel E.Improvement of a syntheticmedium for Dictyostelium discoideum.Proc Biochem 39：925-930(2004))在FM合成培养基配方的基础上，改进其氨基酸组成，新增加了天冬氨酸，增加了盐酸半胱氨酸、谷氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸和色氨酸的浓度，尤其是大幅度增加了赖氨酸的浓度，得到了一种适合盘基网柄菌高密度生长的新型合成培养基SIH。卢英华等(Lu Y，Beshay U，Friehs K，Flaschel E.Mass production of Dictyostelium discoideum in homogeneous and heterogeneous cultivation systems.Proc Biochem 39：1859-1870(2004))利用该改良FM培养基培养重组盘基网柄菌，细胞密度达到(3.6～4.8)×10⁷细胞/mL，这差不多是在复合培养基中所能达到的细胞密度的3倍。虽然采用合成培养基通常能达到较高的细胞密度，然而细胞在合成培养基中的生长速度较为缓慢，世代时间通常为14～16h。复合培养基因其价格低廉且能支持较快的细胞生长速度而得到广泛应用。在复合培养基中，盘基网柄菌以世代时间为8～12h的速度生长至(1～2)×10⁷细胞/mL。20世纪六七十年代以来，开发了以下用于盘基网柄菌培养的复合培养基：A培养基(Sussmann M.Cultivation and serial transfer of the slime mould，Dictyosteliumdiscoideum in liquid nutrient medium.J.Gen Microbiol 25：375-378(1961))，CF培养基(Sussmann RR，Sussmann M.Cultivation of Dictyostelium discoideum in axenic medium.Biochem.Biophys Res Com 29：53-55(1967))，HL-5培养基(Cocucci S，Sussman M.RNA incytoplasmic and nuclear fractions of cellular slime mould amebas.J Cell Biol 45：399-407(1970)；Schwalb R，Roth R.Axenic growth and development of the cellular slime mould Dictyosteliumdiscoideum.J Gen Microbiol 60：283-286(1970)；Watts DJ，Ashworth JM.Growth ofmyxamoebae of the cellular slime mold Dictyostelium discoideum in axenic culture.Biochem J119：171-174(1970)；Yarger J，Stults K，Soll DR.Observations on the growth of Dictyosteliumdiscoideum in axenic medium：evidence for an extracellular growth in hibitor synthesized bystationary phase cells.J Cell Sci 14：681-690(1974))，LPP培养基(ChaglaAC，Lewis KE，O’DayDH.Ca²⁺and cell fusion during sexual development in liquid cultures of Dictyosteliumdiscoideum.Exp Cell Res 126：501-505(1980))和HL-5C培养基(Reymond CD，Beghdadi-RaisC，Roggero M，et al，Fasel N.Anchoring of an immunogenic Plasmodium falciparumcircumsporozoite protein on the surface of Dictyostelium discoideum.J Biol Chem 270：12941-12947(1995))。其中HL-5C培养基以其培养效果重复性好及不依赖于特定培养基组分而成为实验室常用的盘基网柄菌复合培养基(Han SI，Friehs K，Flaschel E.Improvement of asynthetic medium for Dictyostelium discoideum.Proc Biochem 39：925-930(2004))。

半合成培养基能综合复合培养基和合成培养基的优点，使菌种能够以较快的细胞生长速度达到较高的细胞密度。半合成培养基配方的确立一般是以复合培养基为基础，向其中添加成分已知的化学物质。

发明内容

本发明的目的在于针对现有的盘基网柄菌培养基所存在的缺点，提供一种适合于盘基网柄菌高密度生长，并充分表达基因工程产物的半合成培养基及其制备方法。

本发明的技术方案是以复合培养基HL-5C为优化起点，对特定培养基组分如碳源种类及其浓度进行优化，并向其中添加了无机盐溶液。

本发明所述的盘基网柄菌的半合成培养基其组成(g/L)是：

a.有机成份：

酵母粉(yeast extract)            4.0～6.0

细菌用胰蛋白胨(bactotryptone)    2.0～3.0

酪蛋白胨(peptone from casein)    2.0～3.0

朊蛋白胨(proteose peptone)       4.0～6.0

碳源，碳源为葡萄糖(D-glucose)    10～15或麦芽糖(D-maltose)  15～20

b.无机盐：

KCl                              0.7～0.9

MgCl₂                            1.4～1.9

CaCl₂                            1.7～2.2

c.磷酸盐缓冲液：

KH₂PO₄                           1.2～1.4

Na₂HPO₄                          0.3～0.4

其余是水。

本发明所述的盘基网柄菌的半合成培养基的制备方法包括以下步骤。

1)在全部无机盐和磷酸盐缓冲液中加入酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、朊蛋白胨后，用NaOH或H₃PO₄调至pH至6.2～6.5，并在121℃高压灭菌20min，得未添加碳源的半合成培养基；

2)将葡萄糖或麦芽糖配成溶液后在121℃高压灭菌20min或膜过滤除菌，然后再加到未添加碳源的半合成培养基中，所述的膜孔径≤0.2μm。

采用本发明所述的盘基网柄菌的半合成培养基培养盘基网柄菌的方法如下：

1)菌种：盘基网柄菌以孢子形式保存菌种。盘基网柄菌的孢子在Soerensen磷酸盐缓冲溶液中可在-60℃保存6年以上。Soerensen磷酸盐缓冲溶液的配方为：Na₂HPO₄ 0.36g/L，KH₂PO₄ 2.0g/L，pH6.0。

2)菌种活化：保存在-60℃下的盘基网柄菌孢子悬浮液在室温下解冻，在HL-5C培养基中活化培养2次，培养条件：在500mL摇瓶中加入50mL培养基，转接入对数生长期的细胞，接种密度为(0.5～1)×10⁵细胞/mL，温度22℃，150r/min摇床培养4～5天。HL-5C培养基组成为(g/L)：酵母粉5.0；细菌用胰蛋白胨2.5；酪蛋白胨2.5；朊蛋白胨5.0；葡萄糖10；KH₂PO₄ 1.2；Na₂HPO₄ 0.35。

3)扩大培养：将对数生长期的细胞接入半合成培养基中，培养条件同上。

本发明所述的盘基网柄菌的半合成培养基的成分含有盘基网柄菌生长的必需元素和有机含量，经摸索其成分和含量均比较合理，再经灭菌处理后，能有效地作为盘基网柄菌生长的半合成培养基，适合于重组基因在盘基网柄菌中高效稳定地表达，用本发明所述的盘基网柄菌的半合成培养基发酵盘基网柄菌，其菌体浓度可达3.8×10⁷细胞/mL，从而显著地提高了基因表达量。本发明用于发酵基因工程产物，能有效提高产品的产量，大大降低成本。

附图说明

图1为不同碳源对盘基网柄菌生长的影响。在图1中，1-未添加任何碳源，2-葡萄糖作为碳源，3-麦芽糖作为碳源，4-果糖作为碳源，5-甘露糖作为碳源，6-甘油作为碳源，7-蔗糖作为碳源，8-乳糖作为碳源。

图2为不同葡萄糖浓度对盘基网柄菌生长的影响。在图2中，1-葡萄糖浓度0g/L，2-葡萄糖浓度5g/L，3-葡萄糖浓度10g/L，4-葡萄糖浓度15g/L，5-葡萄糖浓度20g/L，6-葡萄糖浓度30g/L。

图3为不同麦芽糖浓度对盘基网柄菌生长的影响。在图3中，1-麦芽糖浓度0g/L，2-麦芽糖浓度5g/L，3-麦芽糖浓度10g/L，4-麦芽糖浓度15g/L，5-麦芽糖浓度20g/L，6-麦芽糖浓度25g/L，7-麦芽糖浓度30g/L。

图4为无机盐对盘基网柄菌生长的促进作用。在图4中，空心点-未添加无机盐的初始HL-5C培养基，实心点-添加了无机盐的HL-5C培养基。

图5为用本发明培养盘基网柄菌生产人可溶性Fas配体。在图5中，空心点-初始HL-5C培养基；实心点-本发明的半合成培养基。

在图1～5中，横坐标为培养时间t/h，纵坐标为细胞密度N/10⁷细胞mL^-1。在图4中，右纵坐标为葡萄糖浓度C_Glc/gL^-1，在图5中，右纵坐标为Fas配体浓度C_FasL/μgL^-1。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

根据上述发明内容所述的盘基网柄菌的半合成培养基其组成及其含量为：

1)有机成份：酵母粉4.0～6.0g/L，细菌用胰蛋白胨2.0～3.0g/L，酪蛋白胨2.0～3.0g/L，朊蛋白胨4.0～6.0g/L，碳源，碳源为葡萄糖10～15g/L或麦芽糖15～20g/L；

2)无机盐：KCl 0.7～0.9g/L，MgCl₂ 1.4～1.9g/L，CaCl₂ 1.7～2.2g/L；

3)磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄ 1.2～1.4g/L，Na₂HPO₄ 0.3～0.4g/L；

其余为水。

实施例1：碳源种类的选择

在初始培养基的基础上，将葡萄糖分别换成相同浓度(均为10.0g/L)的葡萄糖、麦芽糖、甘露糖、蔗糖、果糖、乳糖、甘油，配制不同的培养基。在培养条件相同的情况下(如说明书所述)进行盘基网柄菌的摇瓶培养。初始培养基为HL-5C培养基。为进行对比，还进行了盘基网柄菌在未加碳源的复合培养基中的培养。结果如图1所示。结果显示，以葡萄糖或麦芽糖作为唯一碳源时细胞生长情况良好，最大细胞密度可达2.0×10⁷细胞/mL，且细胞生长较为迅速。乳糖和蔗糖均抑制细胞的生长，甘油对其生长影响很小，而果糖和甘露糖均可促进细胞的生长，但其效果不如葡萄糖和麦芽糖。此外，葡萄糖与麦芽糖均价格低廉，由此确定最佳碳源为葡萄糖或麦芽糖。

实施例2：葡萄糖浓度的优化

在初始培养基的基础上，以不同浓度葡萄糖(0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、30g/L)作为碳源，配制培养基。在培养条件相同的情况下(如说明书所述)进行盘基网柄菌的摇瓶培养。初始培养基为HL-5C培养基。结果如图2所示。结果显示，葡萄糖浓度直接影响最大细胞密度，最佳的葡萄糖浓度在10～15g/L范围内，此时盘基网柄菌生长良好，最大细胞密度可达1.9×10⁷细胞/mL。当葡萄糖不足时，细胞密度将显著降低，只能达到2.6×10⁶细胞/mL。但当葡萄糖浓度高于20g/L时，最大细胞密度反而下降。

实施例3：麦芽糖浓度的优化

在初始培养基的基础上，将葡萄糖换成不同浓度的麦芽糖(0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L)，配制培养基。在培养条件相同的情况下进行盘基网柄菌的摇瓶培养。初始培养基为HL-5C培养基。结果如图3所示。结果显示，麦芽糖浓度直接影响最大细胞密度，最佳的麦芽糖浓度在15～20g/L范围内，此时盘基网柄菌生长良好，最大细胞密度可达1.9×10⁷细胞/mL。当培养基中缺乏麦芽糖时，最大细胞密度大大降低，只达到2×10⁶细胞/mL。当初始麦芽糖浓度高于20g/L时，细胞的生长反而受到抑制，最大细胞密度较低，如初始麦芽糖浓度高达30g/L时，稳定期的细胞密度只有3×10⁶细胞/mL。

实施例4：无机盐溶液的添加

在初始培养基的基础上，添加以下无机盐溶液0.9g/L KCl，1.9g/L MgCl₂和2.2g/LCaCl₂，配制培养基。在培养条件相同的情况下进行盘基网柄菌的摇瓶培养。初始培养基为HL-5C培养基。结果如图4所示。结果显示，添加无机盐溶液后细胞密度可达3.8×10⁷细胞/mL，为未添加无机盐时的细胞密度(2.1×10⁷细胞/mL)的1.8倍。对底物葡萄糖的利用更充分，发酵结束时葡萄糖的利用率达到90％以上，而在常规HL-5C培养基中仅达到60％。

实施例5：适合盘基网柄菌细胞培养的半合成培养基1

半合成培养基的配方为(g/L)：

a.有机成份：酵母粉4.0，细菌用胰蛋白胨2.5，酪蛋白胨2.5，朊蛋白胨6.0，葡萄糖10；

b.无机盐：KCl 0.8，MgCl₂ 1.4，CaCl₂ 1.7；

c.磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄ 1.2，Na₂HPO₄ 0.35；

其余是水。

制备半合成培养基时，在全部无机盐及磷酸盐缓冲液中加入酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、朊蛋白胨后，用NaOH和H₃PO₄调至pH至6.5，并在121℃高压灭菌20min。葡萄糖配成溶液单独高压灭菌，然后再加到其它已灭菌的培养基组分中。

保存在-60℃下的盘基网柄菌孢子悬浮液在室温下解冻，在HL-5C培养基中活化培养2次，培养条件：接种量为初始浓度(0.5～1)×10⁵细胞/mL，在22℃，150r/min摇床培养4～5天后，细胞密度通常可以达到5×10⁶～10⁷细胞/mL。将对数生长期的细胞接入半合成培养基中，接种密度为(0.5～1)×10⁵细胞/mL，培养条件同上。每隔12h取样计数，细胞培养4～5天后，活细胞密度达到最高，为3.77×10⁷细胞/mL。

实施例6：适合盘基网柄菌细胞培养的半合成培养基2

半合成培养基的配方为(g/L)：

a.有机成份：酵母粉6.0，细菌用胰蛋白胨2.0，酪蛋白胨3.0，朊蛋白胨4.0，葡萄糖15；

b.无机盐：KCl 0.7，MgCl₂ 1.9，CaCl₂ 2.0；

c.磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄ 1.3，Na₂HPO₄ 0.30；

其余是水。

制备半合成培养基时，在全部无机盐及磷酸盐缓冲液中加入酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、朊蛋白胨后，用NaOH和H₃PO₄调至pH至6.2，并在121℃高压灭菌20min。葡萄糖配成溶液单独高压灭菌，然后再加到其它已灭菌的培养基组分中。

保存在-60℃下的盘基网柄菌孢子悬浮液在室温下解冻，在HL-5C培养基中活化培养2次，培养条件：接种量为初始浓度(0.5～1)×10⁵细胞/mL，在22℃，150r/min摇床培养4～5天后，细胞密度通常可以达到5×10⁶～10⁷细胞/mL。将对数生长期的细胞接入半合成培养基中，接种密度为(0.5～1)×10⁵细胞/mL，培养条件同上。每隔12h取样计数，细胞培养4～5天后，活细胞密度达到最高，为3.81×10⁷细胞/mL。

实施例7：适合盘基网柄菌细胞培养的半合成培养基3

半合成培养基的配方为(g/L)：

a.有机成份：酵母粉5.0，细菌用胰蛋白胨3.0，酪蛋白胨2.0，朊蛋白胨5.0，麦芽糖15；

b.无机盐：KCl 0.9，MgCl₂ 1.7，CaCl₂ 2.2；

c.磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄ 1.4，Na₂HPO₄ 0.4；

其余是水。

制备半合成培养基时，在全部无机盐及磷酸盐缓冲液中加入酵母粉、胰蛋白胨、酪蛋白胨、朊蛋白胨后，用NaOH和H₃PO₄调至pH至6.2，并在121℃高压灭菌20min。葡萄糖配成溶液后用0.2μm的滤膜过滤除菌，然后再加到其它已灭菌的培养基组分中。

保存在-60℃下的盘基网柄菌孢子悬浮液在室温下解冻，在HL-5C培养基中活化培养2次，培养条件：接种量为初始浓度(0.5～1)×10⁵细胞/mL，在22℃，150r/min摇床培养4～5天后，细胞密度通常可以达到5×10⁶～10⁷细胞/mL。将对数生长期的细胞接入半合成培养基中，接种密度为(0.5～1)×10⁵细胞/mL，培养条件同上。每隔12h取样计数，细胞培养4～5天后，活细胞密度达到最高，为3.80×10⁷细胞/mL。

实施例8：发酵生产人可溶性Fas配体

本发明用于人可溶性Fas配体的发酵方法为：将编码人可溶性Fas配体(AA141-128)的基因pCESFL 95和hCG-β信号肽基因克隆到质粒MB74中，然后导入盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)AX3细胞中，得重组盘基网柄菌AX3-pLu8(参见文献：吴小霞，卢英华，李清彪，邓旭，徐志南.利用盘基网柄菌表达可溶性人Fas配体.生物工程学报21：380-384(2005))，该重组菌在启动子actin15的作用下可分泌表达人可溶性Fas配体蛋白。

在500mL摇瓶中加入50mL半合成培养基，转接入重组盘基网柄菌AX3-pLu8细胞，接种密度为(0.5～1)×10⁵细胞/mL，温度22℃，150r/min摇床培养4～5天。培养基中加入10μg/mL遗传菌素G418以保证质粒的高拷贝数。半合成培养基的成分为(g/L)：

a.有机成份：酵母粉5.0，细菌用胰蛋白胨2.5，酪蛋白胨2.5，朊蛋白胨5.0，麦芽糖20；

b.无机盐：KCl 0.9，MgCl₂ 1.9，CaCl₂ 2.2；

c.磷酸盐缓冲液：KH₂PO₄ 1.2，Na₂HPO₄ 0.35；

其余是水。

FasL浓度测定采用购自法国Diaclone公司的FasL试剂盒，通过酶连免疫分析(ELISA)方法来定量测定。细胞培养液每隔12h取样计数，测定菌体生长曲线。为进行对比，还进行了该重组盘基网柄菌在初始复合培养基HL-5C中的培养。结果如图5所示。用本发明方法培养重组盘基网柄菌AX3-pLu8，每毫升菌体浓度可达3.8×10⁷，人可溶性Fas配体产量为350μg/L。相比于常规的HL-5C培养基，菌体浓度和目标蛋白产量均有很大提高。