促甲状腺激素受体制品、其结合区、其与抗体和激素的相互作用、及其应用

摘要

一种突变TSHR制品，该制品包括至少一个点突变，其特征在于，在突变的TSHR制品中，至少相应于一个全长人TSHR第255氨基酸位点的Arg突变为另一个氨基酸残基，从而所述突变的TSHR制品能够区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i)与对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果显著降低或基本消除，所述对照TSHR制品的氨基酸序列相应于突变的TSHR制品的序列，但是不存在全长人TSHR第255个氨基酸相应的位置的Arg的突变；(ii)与对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的TSH的刺激效果没有受到明显影响；和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果不受明显影响或增加，从而所述突变的TSHR对差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH是有效的。

说明书

本发明涉及促甲状腺激素受体(TSHR)的制品，尤其是突变的TSHR制品、抗体和激素与其的相互作用、及其应用、提供所述制品的方法、由此识别TSHR抗体的表位区域和结合位点、及其复合体。

促甲状腺激素或甲状腺刺激激素(TSH)是一种垂体激素，对调节甲状腺功能起关键作用。它的释放是受到在视丘下部形成的TRH的刺激并控制重要的甲状腺激素，甲状腺素(T4)和三碘化甲腺氨酸(T3)的形成和释放。基于反馈机制，血清甲状腺激素含量控制TSH的释放。通过由垂体释放的TSH结合到甲状腺细胞膜上的TSHR，刺激甲状腺细胞产生T3和T4。

我们最近还在PCT专利申请WO2004/050708A2中描述了针对TSHR的人单克隆抗体，其为很有效的TSHR的甲状腺刺激物。在该申请中未公开所述单克隆抗体(hMAb TSHR1)在TSHR上的结合位点，但可以认为该结合位点或袋状结构域是构象的，并涉及折叠到一起的受体不连续区域。对于针对TSHR的人单克隆抗体或重组抗体，如hMAb TSHR1，TSHR上的结合位点或表位区域的识别，或者基本的结合氨基酸残基或其序列，会是理解TSHR结构以及其与人抗体相互作用的关键因素，并且能够改良自身抗体群的分析方法和其后的与对TSHR的自身免疫反应相关的甲状腺疾病的治疗。

本领域已经有大量资料说明，各种类型的抗TSHR的自身抗体可以在与抗TSHR自身免疫相关的疾病的过程中形成。根据这些自身抗体的类型而定，或者对T3和T4的形成和释放的抑制可以由于TSH分子对TSHR的保护而发生，或者从另一个角度来说，由于抗TSHR自身抗体模仿TSH的作用刺激甲状腺激素的合成和释放，这些甲状腺激素可以不受控制的形式被释放。

自身免疫性甲状腺疾病(AITD)是最常见的自身免疫疾病，影响着世界上不同的人群。有一部分AITD患者，主要是那些患Graves病的患者，具有基本上与如前所述的抗TSHR一样的自身抗体。该自身抗体结合到TSHR，通常模仿TSH的作用，刺激甲状腺产生高水平的甲状腺激素。这些自身抗体被描述成具有刺激活性。刺激性自身抗体也与TSHRs在眼组织相互作用，引起Graves病至少在眼部的某些症状。在有些患者中，自身抗体结合到TSHR但并不刺激甲状腺激素的形成，因而被描述为具有阻断作用(J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B Rees Smith“Understanding thethyrotropin receptor function-structure relationship.”

Baillière’s Clinicai Endocrinology and Metabolism.Ed.T F Davis1997 11(3)：451-479.Pub.Baillière Tindall，London)。

测定TSHR自身抗体对诊断和治疗AITD很重要，尤其是Graves病。现有三种类型测定TSHR自身抗体的方法：

(a)竞争性结合方法，测定TSHR自身抗体抑制TSH结合到TSHR制品的能力；

(b)生物鉴定法，测定TSHR自身抗体在培养物中刺激细胞表达TSHR的能力；和

(c)利用TSHR自身抗体免疫沉淀TSHR制品。

利用这些方法测定TSHR自身抗体在以下参考物中已有描述，J Sanders，Y Oda，S-A Roberts，M Maruyama，J Furmaniak，B Rees Smith″Understanding the thyrotropin receptor function-structurerelationship″；Bailliere’s Clinical Endocrinology and Metabolism.Ed；T F Davies 1997 11(3)：451-479.Pub.Bailliere Tindall，London；andJ Sanders，Y Oda，S Roberts，A Kiddie，T Richards，J Bolton，V McGrath，S Walters，D Jask[omicron]lski，J Furmaniak，B Rees Smith″Theinteraction of TSHR autoantibodies with<125>I-labelled TSHR″，Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 199984(10)：3797-3802。

然而，在使用以上所述目前测定TSHR自身抗体的方法时有很多局限性。类型(a)的竞争性方法以不同的方式使用起来一般来说是灵敏的，作为日常工作相对容易操作。但是，至今所熟知的测定TSHR自身抗体的竞争性的放射性受体分析在实用性(由于TSHR制品的结合能力一般对受体或通过它而结合的生物分子的变化非常敏感)上有根本的缺陷并且也不允许针对自身抗体群进行鉴别诊断(例如，像以上所述的刺激或阻断自身抗体的区别)。

类型(b)的生物鉴定法，费用高、耗时，还需要技术很熟练的技术员。

至于类型(c)的直接免疫沉淀法，具有在实际应用中很敏感这一问题，而且目前还不可能对自身抗体群实现鉴别诊断。

从以上所述可以理解，本领域需要提供改进的TSHR自身抗体测定的方法，并且具有例如能够区分与TSHR自身免疫相关的刺激性和阻断性自身抗体的优势。关于这一点，WO01/27634公开了一种测定方法，用于对TSHR自身抗体进行鉴别诊断确定，从而刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和非病原性TSHR自身抗体(既不是刺激也不是阻断)在一个样品中可以理论上由选择地确定。TSHR嵌合体被使用，其中用来结合刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体的TSHR序列被受体G蛋白偶联类的不同受体的序列替换。并且还公开了在反应混和物中可溶性野生型重组体TSHR，如果需要的话。可以看出，嵌合体A代表TSHR嵌合体，其中TSHR第8-165位的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第10-166的氨基酸替换；嵌合体B代表TSHR嵌合体，其中TSHR第261-370的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第261-329的氨基酸替换；嵌合体C代表TSHR嵌合体，其中TSHR第8-165和261-370的氨基酸被促黄体素/绒膜促性腺激素受体的第10-166和261-370的氨基酸分别替换。

WO01/63296相似地公开了一种进行鉴别诊断确定不同TSHR自身抗体的方法，从而刺激性TSHR自身抗体、阻断性TSHR自身抗体和非病原性TSHR自身抗体在一个样品中又可以理论上由选择地确定。另一种至少结合被筛选的自身抗体的结合试剂(如野生型重组体TSHR)，在过量的被选择的TSHR嵌合体存在下与一个样品反应，其中，对阻断性或刺激性自身抗体是必须的TSHR结合序列被未结合到被筛选的不同类型的自身抗体的序列替换。在WO01/63296公开的TSHR嵌合体与以上WO01/27634所述的嵌合体是相对应的。

以上WO01/27634和WO01/63296中所公开的技术在Journal ofEndocrinology&Metabolism，89(1)：352-356中，被Minich等进一步描述。

Minich和同事们在这些研究中所描述的原理为：具有甲状腺刺激活性(即TSH激动剂)的TSHR自身抗体与TSHR(在25和165位氨基酸之间)的N末端的表位相互作用，而具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体与更靠近C末端(第261-370位的氨基酸)的表位相互作用。用嵌合体A进行的研究尤其表明它与¹²⁵I标记的TSH结合得很好，并且用该嵌合体转染的细胞对TSH反应良好。

标记的TSH与嵌合体A和野生型TSHR的结合被含有TSHR自身抗体的血清所抑制。但是用野生型受体，血清的抑制作用会更强，这就是具有TSH激动剂和/或TSH拮抗剂活性的自身抗体的情况。基于TSH结合到嵌合体的抑制作用的分析方法，说明了具有TSH激动活性的TSHR自身抗体和TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体之间改进了的鉴别性(与野生型TSHR比较)，但是有大量重叠。该重叠限制了临床应用。同时，在更早些时候的研究中，基于标记了的TSH结合到天然(即野生型)TSHR的抑制作用分析TSHR自身抗体的方法，已经被改进到通过减少分析方法的敏感性(即使用稀释了的测试样品)，选择具有TSH拮抗剂活性的TSHR自身抗体。这是有效的，因为TSH拮抗剂自身抗体一般以高于TSH激动剂自身抗体的浓度存在于血清当中。

为提供改进的测定和分析在应答TSHR时产生的TSHR自身抗体的方法，和克服现有技术中出现的问题，本发明在此提供一种不同于Minich及其同事们现有技术的方案。具体地说，我们已经突变了TSHR中一个氨基酸，并且观察了突变对TSHR结合和利用各种新配体的刺激作用的效果的影响。这些新配体包括人单克隆甲状腺刺激自身抗体(hMAb TSHR1)、鼠单克隆抗体(9D33)，后者是很有效力的hMAb TSHR1(和TSH)拮抗剂，以及作为强TSH激动剂的鼠单克隆抗体。

与现有技术相比，我们的研究已经令人惊讶地产生了一种可以提供更加清楚得区别各种TSHR配体的系统。更具体得说，我们已经识别了一个特异的TSHR点突变，该TSHR主要是消除具有TSH激动剂活性的TSHR抗体(自身抗体和单克隆抗体)的作用，而具有TSH拮抗剂活性的TSH受体抗体(自身抗体和单克隆抗体)的效果不会受到同样突变的影响或增加。

本发明因而提供一种新的和改进了的能区分刺激性和阻断性TSHR抗体群的方法，在此提供一种突变的TSHR制品，该制品包括至少一个点突变，其特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少在相应于一个全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变为另一个氨基酸残基。从而所述突变的TSHR制品能够区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i)与对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果根本上降低或基本上消除，所述对照TSHR制品的氨基酸序列对应于突变的TSHR制品的序列，但是不存在全长人TSHR第255位氨基酸相应位置的Arg的突变，(ii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的TSH的刺激效果没有受到显著影响，和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果基本上不受影响或增加，从而所述突变的TSHR对差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH是有效的。

在本发明的一项优选实施例中，至少对应于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg点突变为带负电的氨基酸残基，优选是Asp。因而优选地，在此提供了一种突变的TSHR制品，该制品包括至少一个点突变，特征在于，在所述突变的TSHR制品中，至少相对于全长人TSHR第255氨基酸位点的氨基酸Arg突变成Asp，从而所述突变的TSHR制品可以区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，因为(i)与对照TSHR制品相互作用相比，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果根本性地降低或基本上被消除，该对照TSHR制品相应于所述突变的TSHR制品的氨基酸序列，但不存在与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的所述的Arg的突变，(ii)与所述对照TSHR制品相互作用的刺激效果相比较，当与突变的TSHR制品相互作用时，TSH的刺激效果不会受到明显的影响，和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果基本上不受影响或增加，从而所述突变的TSHR对差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH是有效的。

适当地，本发明所提供的突变的TSHR制品可以包括一个具有如上所述突变的全长野生型人TSHR。或者，突变TSHR制品可以包括具有如上所述突变的全长野生型人TSHR的片段，并且该片段能够与如上所述的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH区分性地相互作用。进一步的氨基酸突变可以存在于如上所述的突变TSHR制品中，所述的进一步突变可以是点突变，该点突变进一步提高突变的TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH区分性地相互作用，或者该点突变表现为沉默替换、插入或缺失，但都不会改变或根本改变本发明提供的突变TSHR制品的生物活性或功能。

当进一步突变是保守性的氨基酸替换时，这种替换是指具有相似特性的氨基酸替换了突变的TSHR制品中的氨基酸。如同一般见到的保守性替换为置换，在下列各组内的氨基酸中一个替换另一个，所述组包括脂肪族氨基酸；羟基氨基酸；酸性氨基酸；酰氨类氨基酸；碱性氨基酸；和芳香族氨基酸。

在此所使用的术语“片段”是指与本发明的突变TSHR制品相关的氨基酸序列，其与部分而不是全部的野生型人TSHR的氨基酸序列相对应，并且包括至少与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的氨基酸Arg突变成另一个氨基酸残基(如所述)，其片段可以区分性地与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，从而使差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH成为可能。如在本发明突变TSHR制品范围所提供的“片段”可以是“独立式”，即不是其它氨基酸或多肽的一部分或不融合到其它氨基酸或多肽，或者它们可以是一个比较大的多肽的一个组成部分，在其中形成一部分或是一个区域。这样的片段因而可以合并到“骨架”式多肽，其中，其它的氨基酸以在构象、排列或序列上“支撑”突变TSHR片段制品的氨基酸，且该片断的构象、排列或序列与野生型TSHR制品氨基酸活性位点的构象、排列或序列相似或基本相似的。

关于野生型人TSHR氨基酸序列的全序列信息可以参考本领域出版物和/或受体序列的氨基酸数据库而易于获得，如此，本发明所有适当的突变制品及其突变片段的整个序列，可以基于已知的野生型序列并结合本发明说明书所公开的内容而很容易得到。

如本发明所提供的突变TSHR制品在差别筛选和识别患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH具有诊断功能，因此在提供可靠的对与TSHR自身免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断方法，和解决很多与至今为止本领域已知的如以上所述的诊断方法和试剂盒相关的问题上向前进了一大步，尤其是与WO01/63296和WO01/27634的公开相比具备很多优势。

所以，根据本发明，突变的TSHR制品具有在如下方面的应用，即，如在此之前提到的，该用途是差别筛选和识别受试者(尤其是人)体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，且该受试者疑似遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。

本发明还提供了突变TSHR制品在如下方面应用，即，如在此之前提到的，对受试者(尤其是人)进行与针对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断，该受试者疑似遭受、易患或患有与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。

本发明因而还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括如在此之前提到的突变TSHR制品，以及检测突变TSHR制品区分性地与待筛选体液样品中患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用的检测工具(means)。

本发明还进一步提供了一种方法，该方法能够差别筛选受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，该受试者被怀疑遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用突变TSHR制品区分性地与受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，并对其进行检测。

本发明还进一步提供了一种诊断受试者(尤其是人)可能发作或存在与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的方法，该受试者被怀疑遭受、易患或患有与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用如在此之前所述的突变TSHR制品区分性地与受试者体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用，并对其进行检测，从而提供受试者(尤其是人)可能发作或存在与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的诊断。

本发明还进一步提供延迟或阻止受试者(尤其是人)中与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的发作的方法，该受试者被怀疑遭受或易患与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从所述疾病中恢复。所述方法使用基本上如在此之前所述的突变TSHR制品首先区分性地与刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，并对其进行检测，所述自身抗体可作为与对患者体液样品中TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作或存在的标志，进而为该受试者提供与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作或存在的诊断。然后对患者进行治疗，以延迟和/或阻止与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病发作。

本发明还进一步提供一种治疗受试者与针对TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病的方法，所述方法使用基本上如在此之前所述的突变TSHR制品，首先区分性地与刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，并对其进行检测，该自身抗体是在对受试者体液样品中的TSHR免疫应答时产生的，进而为患者提供自身免疫疾病的诊断，并对受试者施用对治疗这种自身免疫疾病有效的至少一种有效治疗剂量的治疗剂。

给药的治疗剂量根据要治疗的特定的自身免疫疾病状况而定，如患者的年龄，并最终由医生的判断而定。

本发明还进一步同时提供基本如在此之前描述的试剂盒与基本如在此之前所描述的与TSHR的免疫反应相关的自身免疫疾病有效的至少一种有效治疗剂量的治疗剂的组合。

本发明待筛选的体液样品一般包括血液样品或血液的其它液体组分，尤其是如血清样品或血浆样品，但是样品还可以是另一种生物液体，如唾液或尿或可溶性组织抽提物，或获自穿刺活检。

本发明的突变TSHR制品基本上如在此之前所述，其还适于当作一种治疗剂，治疗与TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或对治疗免疫疾病的一种适当的治疗剂进行识别。例如，突变TSHR制品可以以治疗性地与受试者(尤其是人)的循环的刺激性和/或阻断性TSHR自身抗体相互作用，或基本上将所述自身抗体去除，该受试者被怀疑遭受、易患或患有与对TSHR免疫反应相关的自身免疫疾病，或正从上述疾病中恢复。

所以，本发明还提供一种药物组合物，包括基本如在此之前所述的本发明的突变TSHR制品，以及药物可接受的载体、稀释剂或赋型剂，其中，突变TSHR制品能够区分性地与TSHR应答反应中产生的刺激性和/或阻断性自身抗体相互作用。

本发明还提供一种基本上如在此之前所述的突变TSHR制品用于制备治疗Graves病的药物。尤其是，一种如本发明提供的突变TSHR制品适于制备治疗Graves病的至少某些眼部症状的药物。

本发明的组合物或药物应该包含治疗性或预防性剂量的本发明的突变TSHR制品，该制品处于药学上可接受的载体中。所述药物载体可以为任何适于递送突变TSHR制品给患者的相容的、非毒性物质。消过毒的水、醇、脂肪、腊和惰性固体都可以当作载体。药物可接受的佐剂、缓冲剂、扩散剂等等，也都可以结合到药物组合物中。该组合物可以是包含单一的突变TSHR制品或者也可以包含两个或更多的本发明的突变TSHR制品。

本发明的药物组合物对肠外给药很有用。优选地，该组合物为肠外给药，即通过皮下、肌肉或静脉给药。所以，本发明提供用于肠外给药于患者的组合物，其中该组合物包括可接受的载体(如以上所述)中的突变TSHR制品的溶液或分散液。药物组合物中的突变TSHR制品的浓度可以变化很大，从小于大约0.1％的含量，通常至少大约1％的含量到大到20％的含量或更高。一般用于肌肉注射的药物组合物可以制成含有例如，1ml的消毒缓冲水和1到100μg的本发明纯化了的突变SHR制品。一般用于静脉注射的组合物可以制成含有100到500ml的消毒Ringer液和100到500mg的本发明纯化了的突变SHR制品。现有的制备肠外给药组合物的方法都是本领域众所周知的，并且在各种资料中有更详尽的描述，包括例如Remington’s PharmaceuticalSciernce，15^th Edition，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)。

本发明还进一步提供一种多核苷酸，包括：

(i)编码基本上如在此之前所述的突变TSHR制品的核苷酸序列；

(ii)包括(i)中序列的等位基因变异的核苷酸序列；

(iii)包括(i)中序列的片段的核苷酸序列；或

(iv)在严格的条件下与(i)中序列杂交的核苷酸序列。

本发明进一步提供了引物核苷酸序列Arg 255 Asp F；Arg 255 Asp R；如表1中所示，和/或由于遗传密码简并性在密码子序列上与它们不同的核苷酸序列。应当理解，虽然核苷酸仅用于表1中所列的引物，但是其余编码本发明突变TSHR制品的核苷酸可以很容易参照本领域的出版物和/或受体序列数据库而获得，因为已给出的野生型人TSHR全长序列是本领域众所周知的。

更具体地说，可以参考实施例中描述的特定的技术，即发生于本发明提供的多核苷酸序列里并用来影响本发明突变的人TSHR制品中的点突变的突变，是通过使用在表1中的以下引物序列对Arg 255 Asp F：Arg 255 Asp R而实现的，即，使255位点(Arg)突变成255位点(Asp)。更优选的是，表1中的引物用于PCR扩增以获得所需的突变核苷酸序列，以及相应的本发明的突变人TSHR制品是通过表达本发明的多核苷酸而适当地获得或获得的。基本如在此所描述的本发明的突变TSHR制品能够在产生重组蛋白质的各种系统中表达。例如在哺乳动物细胞如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中的表达是优选的，而且CHO细胞的特殊用途与pcDNA5.1/FRT载体一同在实例中被描述。或者，本发明的突变TSHR制品可以利用本领域熟知的技术，用传统的肽合成方法来合成产生。

本发明还提供一种制备基本如在此之前描述的突变TSHR制品的方法，该方法包括：

(i)提供一种如基本在此所述的宿主细胞；

(ii)培养宿主细胞；和

(iii)回收本发明的突变TSHR制品。

回收本发明的突变TSHR制品一般使用传统的分离和纯化技术，如本领域技术人员熟知的色谱分离或免疫分离。

本发明的多核苷酸可以为DNA的形式，包括，例如cDNA、合成DNA和基因组DNA，所述DNA通过克隆适当地获得或通过化学合成技术或其结合而产生的。本发明一个优选实施例优选地包括cDNA或合成DNA。

本发明还涉及在此所描述的多核苷酸变异体，而所述多核苷酸变异体编码本发明提供的突变TSHR制品。多核苷酸的变异体可以是一种自然发生的变体，如自然发生的等位基因的变异体，或者是一种非自然发生的变体。这种非自然发生的多核苷酸变体可以通过突变技术而产生。

在这一点上的变异体是不同于之前所述的通过核苷酸替代、缺失或插入而形成的多核苷酸。替代、缺失或插入会涉及一个或多个核苷酸。编码区的改变会产生保守或不保守的氨基酸的替代、缺失或插入。

适宜地，本发明的变异体多核苷酸在整体长度中与编码在此所描述的突变TSHR制品的多核苷酸至少具有70％的同一性，以及与这些多核苷酸互补或杂交的多核苷酸。或者，最优选的是那些多核苷酸，它们包括一个占全长至少80％的区域与编码所述的突变TSHR制品的多核苷酸具有同一性，以及与这些多核苷酸互补或杂交的多核苷酸。从这个角度来看，在整体长度中至少具有90％同一性的多核苷酸尤其是优选，并且在这些尤其优选的多核苷酸中，那些至少具有95％同一性的多核苷酸是特别优选的。更进一步说，在具有至少95％同一性的多核苷酸中，那些具有至少具有97％同一性的多核苷酸是高度优选的，而在这些多核苷酸中，那些具有至少具有98％同一性和至少具有99％同一性的多核苷酸尤其是高度的优选，至少具有99％同一性的多核苷酸更优选。

基本如在此之前所述，本发明还涉及杂交到以上所述的多核苷酸的序列。在这一点上，本发明尤其涉及在严格条件下杂交到以上所述的多核苷酸的多核苷酸。在此，术语“严格的条件”是指杂交只是在两条序列之间具有至少95％和优选为97％互补一致性的情况下才发生。

本发明还涉及载体，该载体包括本发明的一个核苷酸或多个核苷酸、用本发明的载体进行基因改造的宿主细胞，和用重组技术生成的本发明的突变TSHR制品的产物。

所以，本发明还提供一种生物功能性载体，可以携带如在此之前所描述的多核苷酸并能将该多核苷酸引入到一个宿主有机体的基因组中。

宿主细胞可以被遗传改造以并入多核苷酸并表达本发明的突变TSHR制品，本发明因而提供一种用一种多核苷酸或多种多核苷酸或一种载体系统(每一种都基本如在此所描述)来转化或转染的宿主细胞。用任何一种众所周知的常规技术可以将适当的DNA序列插入到载体。

本发明进一步提供一种方法，用以识别可以差别筛选和识别体液样品中患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的突变TSHR制品。该方法包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR的结合伴侣(如hMAb TSHR1，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别导致所获得的TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的至少一个的相互作用受到抑制的点突变。

本发明还用于识别氨基酸残基，该氨基酸残基为TSHR表位区域的关键，因此提供一种方法，包括识别TSHR的潜在的相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR结合伴侣(如hMAb TSHR1，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH相互作用所需的候选氨基酸；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别用于TSHR与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH分别的相互作用的关键氨基酸残基。

本发明可被进一步用来识别氨基酸残基，该氨基酸残基是所述TSHR的构象所需的，从而使其与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的一个或多个相互作用，因此提供一种方法，包括识别潜在的TSHR相互作用区域和其内的氨基酸残基，所述氨基酸残基的识别是根据它们与TSHR结合伴侣(如hMAb TSHRl，9D33或TSH)的相互作用能力(包括针对野生型TSHR的不同的能力)而被进一步识别，并作为用于TSHR的构象所需的候选氨基酸，从而使其与所述患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH中的一个或多个相互作用；进行所述候选氨基酸残基的点突变和检测所获得的突变TSHR制品与结合伴侣的相互作用，从而识别用于所述TSHR的构象的关键氨基酸残基，所述构象使TSHR与一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH分别的相互作用。

在以上所述的每一个方法中，被检测的突变TSHR制品的相互作用优选是突变TSHR的刺激作用或这种刺激的阻断作用，所述检测是通过检测结合伴侣与突变TSHR制品相互作用而产生的cAMP而进行的。

如所述，位于相应于全长人TSHR第255位点的氨基酸Arg已经被本发明识别为人TSHR的关键氨基酸，该氨基酸用于抗体结合并且所述人TSHR的突变能够针对刺激性和阻断性抗体群进行鉴别诊断。

本发明还提供了存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR抗体的结合位点。本发明还进一步提供了存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR受体自身抗体或其一个或多个片段的结合位点。本发明还提供存在于TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，作为TSHR的结合伴侣的结合位点，所述结合伴侣包括或是来自人单克隆或复合体抗体，或其一个或多个片段。本发明提供一个存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的突变氨基酸残基，用于差别筛选待筛选体液样品中的一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，优选用于识别体液样品中是否存在刺激性TSHR自身抗体。本发明提供一个存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的突变氨基酸残基，用于诊断与TSHR相关的自身免疫疾病的用途。更确切地说，本发明提供了存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg，用于差别筛选待筛选体液样品中的一个或多个患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH，优选识别体液样品中是否存在刺激性TSHR自身抗体的用途。本发明还进一步提供存在于突变TSHR制品、位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg用于诊断与TSHR相关的自身免疫疾病的用途。

本发明提供了一种结合复合物，包括(a)如位于相应于全长人TSHR第255个氨基酸位点的氨基酸Arg所示的结合位点；和(b)其结合伴侣，该结合伴侣优选包括或来自人单克隆或复合体抗体，或其一个或多个片段。

结合伴侣适当地包括，或来自与TSHR相互作用的人单克隆抗体，或其一个或多个片段。或者，该结合伴侣包括，或来自与TSHR相互作用的人重组抗体，或其一个或多个片段。优选地，结合伴侣包括一种与TSHR相互作用的人单克隆或重组抗体，或其一个或多个片段。优选地，结合伴侣进一步的特征在于抑制TSH与TSHR结合的能力，和/或其刺激TSHR的能力，所述的两种能力是与来自患有Graves病的患者血清中的TSHR自身抗体的抑制性和刺激性相比而言的。

本发明提供的尤其优选的一种复合物的结合伴侣是人TSHR单克隆抗体hMAb TSHRl，如PCT专利申请WO2004/050708A2中所描述。如以上的现有技术所述，hMAb TSHRl的结合位点还没有公开，由于TSHR复合物的特性以及对其的抗体反应的不同特性，所公开的现有技术还不足以确定或预测所述的表位区域或结合位点。

以下的例证性解释用于帮助理解某些特定的本发明所使用的术语。这些解释仅用于方便理而不是对本发明的限制。

TSHR的结合伴侣描述了一种具有对TSHR的结合特异性的分子。在此所描述的结合伴侣可以天然获得或整个地或部分地经合成而产生。这种结合伴侣有一个结构域或区域，其特异性地结合到因而也是互补到一个或多个TSHR的表位区域，该结合伴侣可包括抗TSHR的刺激性和/或阻断性抗体，该抗体可以是自身抗体、单克隆或重组抗体，或其它配体，如TSH。

结合位点是指一个位点，如TSHR的一个原子、功能性基团或氨基酸残基，它们能够结合到TSHR的抗体或其它配体或结合伴侣。根据空腔内特定的分子，位点会由于电荷、空间等因素而表现出吸引或排斥的相互结合作用。

通过结合伴侣的TSHR的阻断说明了结合伴侣结合到TSHR的能力从而抑制例如环AMP(cAMP)的生成，而该cAMP是如在此所述的TSHR刺激作用的结果。

阻断性TSHR抗体结合到TSHR并产生如在此所述的TSHR的阻断。

区分性地相互作用或区分性的相互作用，是针对本发明的突变TSHR制品而言，是指(i)与对照TSHR制品相互作用相比，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清刺激性TSHR自身抗体的刺激效果基本上降低或基本被消除，该对照TSHR制品具有与所述突变TSHR制品相对应的氨基酸序列，但不存在与全长人TSHR第255氨基酸位点相对应的所述Arg的突变，(ii)与所述对照TSHR制品相互作用的刺激效果相比较，当与突变的TSHR制品相互作用时，TSH的刺激效果不会受到明显的影响，和(iii)与所述对照TSHR制品相互作用相比较，与突变的TSHR制品相互作用的患者血清阻断性TSHR自身抗体的阻断效果明显不受影响或增加。以上(是否被抑制、不变或增强)所述的相互作用是在或者为TSHR的刺激作用或者为TSHR的阻断作用的情况下。至于突变TSHR制品与患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH的结合相互作用或亲合性，如在实例中进一步所描述的，在某些情况下，与所观察的针对本发明的突变TSHR制品的刺激和/或阻断结果似乎不吻合，但可能例如是由突变受体的表达水平的降低而造成的。

“F”在引物定义和其命名上指正向引物。

宿主细胞是指被转化或转染的细胞，或能够通过外源多核苷酸序列进行转化或转染的细胞。

同一性，为本领域所熟知，指两个或更多的多肽序列，或两个或更多的多核苷酸序列之间的关系，所述关系通过对序列进行比较而定。

突变TSHR制品是指一种TSHR制品，包括一个或多个点突变，其特征在于所获得的TSHR制品能够差别筛选和识别待筛选的体液样品中的患者血清刺激性TSHR自身抗体、患者血清阻断性TSHR自身抗体和TSH。但是，特定的本发明的突变TSHR制品包括至少一个点突变，其特征在于至少有一个与全长人TSHR第255个位点的氨基酸对应的位点的氨基酸Arg突变成突变TSHR制品中不同的氨基酸残基。

点突变是指一个氨基酸或核苷酸被另一个氨基酸或核苷酸替换。其在本发明的范围内包括通过使用PCR引物以及之后的突变核苷酸序列的表达而产生的点突变。在此所使用的该术语点突变还包括通过已知的合成技术而获得的突变，例如，使用传统的肽合成来影响所需的多肽序列的合成而获得的突变，其中，合成的序列包括所需氨基酸与另一个氨基酸的置换。

“R”在引物定义和其命名上指反向引物。

通过所述的结合伴侣的TSHR的刺激作用说明了结合伴侣结合到TSHR的能力和其效果，例如，cAMP的形成是由于与TSHR的这种结合的结果。该刺激作用类似于TSH或TSHR自身抗体结合到TSHR的反应，并且以这种方式，在此所述的结合伴侣模仿了TSH或TSHR自身抗体结合到TSHR的效果。

刺激性TSHR抗体结合到TSHR并刺激在此所述的TSHR。

TSH是指促甲状腺激素或甲状腺刺激激素。

TSHR是指促甲状腺激素或甲状腺刺激激素受体，本领域也将它称为TSH受体。

TSHR自身抗体是指在患与TSHR相关的自身免疫疾病期间产生的抗TSHR的抗体。根据所产生的抗体的类型，或者由于TSHR对TSH分子的屏蔽而出现对T3或T4形成和释放的抑制，或者因为产生的抗体模仿TSH的作用刺激甲状腺激素的合成和释放，T3和T4会以失控的方式被释放。

TSHR制品是指一个多肽序列，如本文所述，其与全长野生型TSHR相对应，或者包括一个或更多个变异体、类似物、衍生物或其片段。

现在用下面的数据和实例来说明本发明，但它们都不是对本发明的限制。

实例

选择TSHR胞外结构域的各种氨基酸并将其突变成为丙氨酸。这些氨基酸包括：

Asp43，因为它是带电残基(电荷间的相互作用众所周知在TSHR与TSHR自身抗体和TSH的相互作用中很重要)(Rees Smith B，McLachlan SM，Furmaniak J 1988 Autoantibodies to the thyrotropin receptor.EndocrRev 9：106-121)。另外，Asp43位于TSHR富亮氨酸结构域(LRD；aa 36-281)的第一(即最N端)重复序列。相似地，也选择Glu61，因为它带电并位于TSHRLRD的第二重复序列。

GIu 157(位于TSHR LRD的第6个重复序列)基于带电以及可能参与同TSHR Lys183一起形成一个盐桥而被选择(Duprez L，Parma J，CostagliolaS，Hermans J，Van-Sande J，Dumont JE，Vassart G 1997 Constitutiveactivation of the TSHR by  spontaneous mutations affecting theN-terminal extracellular domain.FEBS Letters 409：469-474)。另外两个带电氨基酸，GIu 178和Asp203基于它们分别位于第7和第8个LRD的重复序列而被选择。

带电荷氨基酸Asp232和Arg255基于它们分别位于TSHR LRD第9和第10重复序列而被选择。同时，位于LRD第10个重复序列的芳香族氨基酸Trp258突变成丙氨酸。更进一步地，位于LRD C端的氨基酸Asp276和Ser281由于可能参与TSHR活性而被突变(Corvilain B，Van Sande J，Dumont J E andVassart G 2001 Somatic and germ line mutatiohs of the TSH receptor andthyroid disease.Clin Endocrinol 55：143-158；and Russo D，Arturi F，Chieari E，Filetti S 1997 Molecular insights into TSHR abnormality andthyroid disease.J Endocrinol Invest 20：36-47).

方法

利用PCR将特定氨基酸突变引入人TSHR序列

TSHR全长核苷酸序列(Swiss prot号：Pl 6473-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝136448；NCBl EntrezNucleotide accession number NM 000369-http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝nucleotide&val＝4507700)根据标准克隆方法，用BamHI和Xhol限制性位点被克隆至pcDNA5.1/FRT载体。

为每一个突变(表1)设计出特异性的“正向”和“反向”PCR引物，以改变编码适当氨基酸突变的核苷酸编码序列。建立起两个独立的PCR反应(PCR1和PCR2).

加入PCRl反应的试剂：32.5μLH₂O，2.5μL20x三磷酸脱氧核苷(dNTPs)(5mmol/L)，5μL 10x Pfu DNA多聚酶缓冲液(10x Pfu缓冲液；Promega)，2.5μL 10 pmol/μLT7引物(表1)，2.5μL 10pmol/μL用于突变的″反向″引物，4μL pcDNA5.1/FRT TSHR模板DNA(100ng)和1μL Pfu DNA多聚酶(3个单位，Promega)。加入PCR2反应的试剂：34.5μLH₂O)，2.5μL20xdNTPs(5 mmol/L conc)，5μL10x Pfu缓冲液，2.5μL用于突变的″正向″引物(表1)10 pmol/μL，2.5μL牛生长激素多聚腺苷酸化信号反向引物(BGHR引物)(表1)10pmol/μL，2μL模板DNA(100ng)和1μLPfu DNA多聚酶(3个单位)。

所使用的模板DNA的量由生成的PCR产物的长度决定。在以上所述实例中，PCR1产物长度是800个碱基对，PCR2产物长度是1600个碱基对。PCR和PCR2产物的大小由TSHR序列中氨基酸的突变位点决定。

该PCR反应使用GeneAmp PCR System 9700(Applied Biosystems)在94℃下5分钟，然后在94℃下1分钟，40℃下1分钟，以及72℃下2分钟(以50％温度变化速率从94℃到40℃以及40℃到72℃)的条件下进行30个循环，之后72℃下7分钟，最后将反应体系冷却到4℃。

PCRl和PCR2产物在TAE缓冲液的1％琼脂糖凝胶上跑电泳(40mmol/LTris-HCl pH 8.0，1mmol/L EDTA，0.114％冰醋酸)并且用解剖刀从凝胶上切除条带。按照说明书，用Geneclean II试剂盒(Anachem Ltd，Luton，LU2OEB，UK)纯化条带。用本领域的标准方法确定DNA的浓度。该DNA用来建立PCR3反应，以构建含有突变的完整TSHR序列。PCR3反应含有：2.5μL 10xPfu缓冲液，1μL的20x dNTPs，200ng的PCR1产物和200ng的PCR2产物，1μLPfu DNA聚合酶和水，且终体积为25μL。将所述反应置于GeneAmpPCR系统在94℃下，1.5分钟，65℃下1.5分钟以及72℃下1.5分钟的条件下进行7个循环。然后将温度升高到94℃，2分钟，并且将PCR4反应体系(2.5μL 10x Pfu缓冲液，1.3μL 20x dNTPs，2.5μL T7引物10 pmol/μL，2.5μL BGHR引物10pmol/L，1μL Pfu DNA聚合酶和水，且终体积为25μL)加到PCR3中。该混合物在94℃下1分钟，52℃下1分钟和72℃下2分钟(以50％的温度变化速率从94℃到52℃并从52℃到72℃)的条件下进行30个循环，之后72℃下10分钟，最后将反应体系冷却到4℃。

PCR产物用50μL的1∶1苯酚/氯仿混合物纯化，用乙酸钠和乙醇沉淀并风干，如本领域所述。将DNA重悬浮于1 x缓冲液B作限制性消化(RocheDiagnostics，Lewes，BN7 1LG，UK)并用限制性酶BamHI/XhoI在37℃下切割4小时。PCR条带在1％琼脂糖凝胶进行电泳，将条带切除并用Geneclean II试剂盒进行纯化。之后PCR产物被连接到BamHI/XhoI切割的pBluescript(Stratagene)上并且利用DNA测序检测突变(来自Amersham Biosciences的Sequenase version 2 DNA测序试剂盒)，如本领域所述。然后利用BamHI/XhoI限制性酶将突变的TSHR DNA从pBluescript移除并克隆到pcDNA 5.1/FRT载体(Invitrogen)，然后如上述对序列再进行确认。

利用FIp-In系统将TSHR构建体转染至CHO细胞

长满细胞的一烧瓶的FIp-In-CHO细胞(Invitrogen)以1x10⁵-1.5x10⁵细胞/孔的密度接种至24孔盘的孔中，，且培养基的成分为：DMEM(Invitrogen)，10％新生小牛血清(Invitrogen)，1 x L-谷氨酰胺(Invitrogen)和1 x非必需氨基酸(NEAA)(Invitrogen)，不含抗生素。细胞在37℃，5％CO₂和＞95％湿度下过夜培养。

pcDNA5.1/FRT TSHR DNA(如上述)和POG44 DNA(Invitrogen)在灭菌水中被分别稀释成0.01μg/mL和0.1μg/mL的溶液。POG44 DNA和TSHR DNA被混合成为3种不同的浓度：(1)9μL的POG44，10μL TSHR DNA and 31μLOptimemI(Invitrogen)；(2)8μL POG44，20μL TSHR DNA和22μL OptimemI；(3)9.5μL POG44，5μL TSHR DNA和35.5μL OptimemI，并在室温下温育5分钟。将50μL的以1∶25的比例在OptimemI中稀释的Lipofectamine(Invitrogen)加入每一个管中(以上所述的1-3个管)并于室温下温育20分钟。每一种温育混合物之后被加到1孔(24孔盘中)，该孔中具有95％融合FIp-In-CHO细胞，在以上所述条件下过夜培养。将培养基移除，换上DMEM，10％FCS，1x L-谷氨酰胺，1x NEAA和1x青霉素(100u/mL)/链霉素(100μg/mL)(Invitrogen)并继续过夜培养。用1 x trypsin/EDTA溶液(Invitrogen)将细胞从孔盘上分离并将其分至4个新的孔，在额外加入600μg/mL的潮霉素(Invitrogen)的以上所述培养基中生长。

用POG44质粒DNA和pcDNA5.1/FRT TSHR转染的细胞能将TSHR插入到FIp-In-CHO细胞基因组并赋予细胞抗潮霉素性，因而能在潮霉素选择培养基上生长。Invitrogen的Flp-1n系统设计成通过POG44，构建体中的TSHR被插入到FIp-In-CHO细胞的FRT位点。FIp-In-CHO细胞含有一个FIp-In位点每一个细胞，所以，在每一个实验中，TSHR DNAs能插入到基因组中的相同的地方，而且每一个细胞只存在一个拷贝。该系统具有这样的优点，即没有必要为那些具有理想表达水平的细胞(之后克隆细胞以发现一个稳定的细胞系)进行细胞群落的筛选。随后，表达在潮霉素选择培养基生长的突变TSHR的细胞可以快速扩增用于不同的实验。

刺激cAMP生成的分析

按照WO2004/050708A2所述，分析了hMAb TSHRl和TSH刺激在FIp-In-CHO细胞中生成cAMP的能力，所述FIp-In-CHO细胞表达野生型和突变TSHR。简要地说，CHO细胞接种于96孔盘(12,500-20,000细胞每孔)并在含有10％新生小牛血清的DMEM(Invitrogen)中温育48小时。然后移除DMEM，加入猪TSH稀释液(RSR Ltd；0.01-3ng/mL)和hMAb TSHR1 Fab(0.1-10ng/mL)的cAMP分析缓冲液(不含NaCl的Hank’s Buffered Salts溶液，含有1g/L葡萄糖，20mmol/L HEPES，222mmol/L蔗糖，15g/L牛血清白蛋白(BSA)和0.5mmol/L 3异丁基-1-甲基黄嘌呤，pH7.4)的的稀释液，在37℃、含有5％CO2大气中培养1小时。在移走测试液之后，利用Amersham Biosciences的Biotrak酶免疫测定系统，溶解细胞用于分析cAMP。包含具有TSH激动剂活性的TSH受体抗体的血清实验，用同样的方法来进行，但不同的是，该血清样品在实验开始之前在cAMP分析缓冲液中被稀释到1∶10。

TSH拮抗剂活性的测定

在某些实验中，患者血清和抗TSHR的鼠单克隆抗体抑制猪TSH刺激活性的能力被测定。该测定是通过比较(a)单独TSH的刺激效果和(b)在患者血清和鼠单克隆抗体存在下TSH的刺激效果而进行的。简要地说，在稀释在cAMP分析缓冲液中的50μL患者血清或50μL的鼠单克隆抗体添加到载有细胞的孔中，之后加入50μL的缓冲液或50μL的TSH(加入前浓度为0.6ng/mL，终浓度为0.3ng/mL)，然后如以上所述进行刺激分析时一样温育。移除测试液，使用Biotrak酶免疫分析系统，融解细胞并用作cAMP分析。

清洁剂增溶的野生型和突变TSHR制品的制备

表达野生型(wt)或突变的TSHRFIp-In-CHO细胞在175cm²烧瓶中生长到汇合时，用Dulbecco的PBS(不含钙和镁离子)(Invitrogen)冲洗并刮到10mL冰冷缓冲液A(50 mmol/L NaCl，10mmol/L Tris-HCl pH7.5)，上述缓冲液含有来自Roche Diagnostics的蛋白酶抑制品(每50mL溶液编号1836145的产品1片)和1mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF))。将细胞在4℃、1000xg下离心5分钟，沉淀物在1mL缓冲液A中重悬浮，并在冰上的玻璃匀浆器上被匀浆。细胞膜在4℃、12,000xg离心30分钟，沉淀物在6mL的缓冲液A、0.5g/L叠氮钠和2.75g/L碘乙酰胺中被重新悬浮，并如以上所述进行沉淀。膜沉淀物随即在1mL含有1％Triton X-100和0.5g/L叠氮纳的冰冷缓冲液A中重悬浮，并匀浆。增溶的TSHR制品在4℃、90,000xg离心2小时，上清液在-70℃等份储存。

标记TSH和标记单克隆抗体与野生型或突变TSHR的结合

在这些实验中，如以前所述(WO2004/050708A2)制备用¹²⁵I标记或未标记的猪TSH(70单位每mg，来自RSR Ltd的)和单克隆抗体(Fab或IgG)。

首先制备TSHR制品的稀释液。在这些实验中，塑料管(Maxisorp Star；NUNC)被200μL的涂覆缓冲液(0.1mmol/L Na2CO3，pH为9.2)中的浓度为10μg/mL的抗TSHR C端的鼠单克隆抗体涂覆，4℃下过夜。在冲洗以及后涂覆(10mg/mL在水中的BSA)之后，所述管用分析缓冲液(10mmol/L Tris-HCl pH7.8，50mmol/L NaCl和1mg/mL BSA)冲洗，该分析缓冲液含有0.1％TritonX-100。在下一个步骤中，200μL的增溶野生型或突变TSHR制品被加入管中，并在4℃下温育过夜。管中内容物被吸走，用分析缓冲液和50μL的起始缓冲液(RSR Ltd)冲洗该管，然后加入50μL的分析缓冲液和50μL的¹²⁵I-TSH或¹²⁵I标记的单克隆抗体(10,000-15,000cpm)并在室温下摇床培养2个小时。将溶液吸走，冲洗管并用伽玛计数器计数。

提供15-40％的标记TSH或单克隆抗体结合的TSHR制品稀释液用来制备作分析用的TSHR涂覆管。在某些实验中，用50μL的分析缓冲液替代浓度增加的未标记的TSH(0.4-500munits/mL)或单克隆抗体(0.001-1.0μg/mL)的溶液。计算出结合的和游离的TSH或单克隆抗体的浓度，该结合针对结合/游离所做的图(Scatchard分析)用来计算对TSHR的亲和性。

含有突变TSHR的CHO细胞刺激作用的分析

评估TSH或hMAb TSHR1在含有各种突变TSHR转染的CHO细胞中刺激产生cAMP的能力。结果如表2a-2j，15a-15x，和27a-27h所示，并在表3、16和28中进行总结。大多数突变引起对TSH和hMAb TSHR1应答反应的降低。但是，突变对激素和抗体的免疫应答的效果有明显的区别，在如下情况下，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala，GIu107突变为Ala，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys129突变为Asp，Phe130突变为Ala，Lys183突变为Ala，Lys183突变为Asp，Tyr185突变为Ala，Asp232突变为Ala，Arg255突变为Ala，Trp258突变为Ala；和双突变：Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala；Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala；Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala。这些氨基酸的任意一个突变引起对hMAb TSHRl的应答反应明显降低，而对TSH的应答反应基本保留。

针对Asp232，Arg255和Trp258突变的效果作了更详细的观察。在Asp232的例子中，附近的谷氨酰胺(Glu235)突变为Ala。但是，该突变对TSH或hMAb TSHR1(表4a)刺激作用的影响很小(相对于野生型而言)。相似地，与Trp258相邻的苏氨酸257的突变对激素或抗体的刺激作用(表4b)的影响很小。但是，作为双突变，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala；Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala；以及Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala对TSH的刺激作用影响很小或没有影响，但是hMAb TSHR1的刺激作用基本消失(分别如表4c、27g和27h所示)。更进一步地，Arg255(正电荷氨基酸)突变为负电荷天冬氨酸(而不是中性Ala)也对hMAb TSHR1的应答反应基本消失，但对TSH的刺激作用影响很小或没有影响(表4d)。这些结果在表5和28中做了总结。

Arg255突变为Asp对来自14个Graves患者的含有TSHR自身抗体的血清能力的影响作了研究，结果如表6所示。如表所示，表达该突变体的CHO细胞对14份血清的应答反应(相对于野生型)有很大的降低。与之对应的是，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，GIu107突变为Ala，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys183突变为Ala，Lys183突变为Asp，影响一些血清，但对所有的测试用刺激性血清(表19a-19h并在表20有总结)的应答反应没有降低。只有Arg 255突变为Asp以及双突变Trp258突变为Ala和Arg 255突变为Ala，能够降低对所有测试用刺激性血清的应答反应(表6、19i，并在表20作总结)。

表7记录了不同剂量的hMAb TSHR1 IgG和供体血浆(获自相同的用于分离淋巴细胞、制备hMAb TSHR1杂交瘤细胞的血液样品)对表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞中产生cAMP的刺激作用。IgG和血浆对突变TSHR的影响相对于野生型明显减少，而且剂量反应的效果也是相似的。对各种具有甲状腺刺激活性(如WO03/018632A2所述制备mTSMAb)的鼠单克隆抗体的效果，根据它们刺激CHO细胞的产生cAMP的能力，也进行了测试，所述CHO细胞用野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp(表8)，Arg80突变为Asp，GIu107突变为Ala，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys183突变为Ala，Lys183突变为Asp(表21a-g)的TSHR进行转染的。如表8和表21a-g以及表22中的总结，mTSMAbs的刺激效果被突变基本消除。也研究了具有TSH拮抗剂活性的4个患者的血清影响CHO细胞中TSH刺激产生cAMP的能力，所述CHO细胞表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR。所有4份血清在表达野生型和突变TSHR的CHO细胞中具有很强的TSH拮抗剂的作用(表9)。另外，剂量反应的研究表明，在较低剂量时(高稀释)，患者血清TSH拮抗剂效果在表达突变受体的细胞中更强(表10)。同时，Glu107突变为Ala对患者的血清(表23a和24)表现出一个相似的增强了的拮抗剂效果，而另外两个突变，Arg109突变为Ala和Lys183突变为Ala没有作用(表23b&c和24)(表24中的总结)。还研究了抗具有很强TSH拮抗剂(和hMAb TSHR1拮抗剂)活性(9D33，如在WO2004/05078A2中所描述)的TSHR的鼠单克隆抗体的作用(表11，13a-j，17a-v和表14和18中的总结)。如表11所示，9D33能够阻断表达野生型TSHR或具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞的TSH刺激作用。另外，在低剂量时，9D33在表达突变受体细胞中的拮抗剂作用更强(表11)。与野生型TSHR相比(表17n和17v)，Asp160突变为Ala和Arg274突变为Ala表现了9D33增强了的拮抗剂作用，而Lys 58突变为Ala，Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala，Glu107突变为Arg，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys129突变为Asp，Phe134突变为Ala和Lys250突变为Ala，表现出9D33的降低了的阻断TSH在表达这些突变的TSHR的CHO细胞中的刺激能力(表17和表18中的总结)。但是，所研究的32种不同突变中的19种，对9D33阻断TSH对cAMP刺激的作用没有影响(表13，14，17和18)。

结合到突变TSHR的分析

TSHR氨基酸突变为丙氨酸、精氨酸或天冬氨酸对结合TSH、hMAbTSHR1和9D33 MAb的影响如表12，25，29和表26中的总结所示。

Asp43突变为Ala，Glu61突变为Ala，Asp203突变为Ala，Gln235突变为Ala，Glu251突变为Ala，Asp276突变为Ala和Ser281突变为Ala，对TSH，hMAb TSHR1或9D33的结合有很小或没有影响。但是，Glu107突变为Arg，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Asp，Lys183突变为Asp和Asp232突变为Ala或Arg，导致检测不到TSH，hMAb TSHR1和9D33 MAb的结合。Tyr206突变为Ala对TSH和9D33来说具有检测不到的结合，没有对hMAb TSHR1的结合进行测试。Glu157突变为Ala，Asp160突变为Ala，Lys209突变为Ala，Thr257突变为Ala和Trp258突变为Ala，阻止可测试到的TSH的结合但是对hMAb TSHR1和9D33 MAb的结合影响很小或没有影响。Lys58突变为Ala，Ile60突变为Ala和Tyr82突变为Ala，表现出测试不到9D33 MAb的结合，而与hMAb TSHR1和TSH的结合与野生型的相似。Arg80突变为Ala和Arg80突变为Asp，导致测试不到9D33 MAb和hMAb TSHR1的结合，而TSH仍旧结合得很好。Glu107突变为Ala和Phe134突变为Ala，导致hMAb TSHR1 and 9D33MAb较低的结合亲和性，而TSH仍然结合得很好。Arg109突变为Ala表现出TSH的结合稍有降低，而hMAb TSHR1的结合保持不变并且9D33 MAb的结合不可测试到。当GIu 178突变为Ala时，观察到对TSH和hMAb TSHR1较低的结合，而9D33 MAb的结合不受到影响。在Lys129突变为Ala的情况下，TSH仍旧结合得很好，而对hMAb TSHR1的亲和性明显减小，并且9D33 MAb的结合测试不到。Phe130突变为Ala，Tyr185突变为Ala和Arg255突变为Ala，导致hMAb TSHR1结合的明显降低，以及9D33 MAb结合的降低，而TSH仍然结合得很好。在Arg255突变为Asp的情况下，TSH的结合测试不到并且hMAbTSHR1的结合亲和性明显地减少，而9D33 MAb结合不受影响。当Lys250突变为Ala，Arg274突变为Ala和Tyr279突变为Ala时，TSH的结合测试不到，并且hMAb TSHR1和9D33的结合亲和性减少。Lys183突变为Ala增加了TSH(未测试hMAb TSHR1和9D33 MAb的结合)的结合亲和性(表25)，如同双突变，Tyr185突变为Ala和Lys183突变为Ala(未测试hMAb TSHR1的结合，9D33 MAb的结合降低)(表29)的结果一样。

双突变，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala，表现出不可测试的TSH结合，以及对hMAb TSHR1的亲和性的稍有减少，而9D33 MAb仍然结合很好(表25)。Asp232突变为Arg和Arg255突变为Asp；Asp232突变为Ala和Trp258突变为Ala；Asp232突变为Ala，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala；Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala；Arg255突变为Ala和Lys183突变为Ala；Trp258突变为Ala，Lys183突变为Ala和Tyr185突变为Ala；Arg255突变为Ala，Trp258突变为Ala，Tyr185突变为Ala和Lys183突变为Ala，都表现出对TSH，hMAb TSHR1和9D33 MAb不可测试的结合(表29)。双突变，Asp232突变为Ala和Arg255突变为Ala也显示不结合TSH或9D33 MAb，并且没有测试到对hMAb TSHR1的亲和性(表29)。在双突变的情况下，即GIuI57突变为Ala和Asp203突变为Ala，TSH的结合测试不到，与hMAb TSHR1的结合相似于野生型，并且9D33 MAb的结合减少(表29)。Glu178突变为Ala和Asp203突变为Ala；Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala；Arg255突变为Ala和Tyr185突变为Ala；Arg255突变为Ala，Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala，显示不可测试的TSH结合，明显减少的hMAb TSHR1结合以及稍有减少的9D33 MAb的结合(表29)。在Arg255突变为Ala，Lys183突变为Ala和Tyr185突变为Ala的情况下，TSH的结合与hMAb TSHR1的结合测试不到，而9D33 MAb的结合减少(表29)。

总结/解释

1)通过各种配体，根据刺激cAMP产生的作用，观察了对TSHR所选择的单个氨基酸进行突变的效果。

出乎意料的是某些氨基酸突变，对hMAb TSHR1的结合和/或刺激作用的影响比对TSH的结合和/或刺激作用大得多。对激素和抗体的影响的这种区别在以下情况下表现得最明显，当氨基酸发生以下突变时，即Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Tyr82突变为Ala，GIu107突变为Ala，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys129突变为Asp，Phe130突变为Ala，Lys183突变为Ala，Lys183突变为Asp，Tyr185突变为Ala，Asp232突变为Ala，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala。另外，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala的双突变，比Arg255突变为Ala或Trp258突变为Ala的单独突变的效果更强。

更进一步地，Arg255突变成为相反电荷的Asp基本上消除了hMAb TSHR1的刺激效果，而TSH的刺激作用基本不受影响。同时，来自14名患有Graves疾病患者的TSH受体自身抗体的刺激效果由于Arg255突变为Asp的突变而基本消失，如同6个鼠单克隆甲状腺刺激性抗体一样。

与Arg255突变为Asp不同的是TSHR的其它氨基酸的突变，包括Arg80突变为Ala，Arg80突变为Asp，Glu107突变为Ala，Arg109突变为Ala，Arg109突变为Asp，Lys129突变为Ala，Lys183突变为Ala，Lys183突变为Asp和双突变Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala，这些突变减少或消除了hMAb TSHR1但不是所有测试的患者血清的TSHR自身抗体的刺激效果。

2)结果，也令人惊奇的是，TSHR氨基酸Arg255的突变是唯一一个发现的可以清楚地区分TSH刺激作用和患者血清TSHR自身抗体(包括hMAb TSHR1)的刺激作用的突变。

3)具有TSH拮抗剂活性的患者血清对阻断表达突变TSHR(Arg255 Asp突变)的CHO细胞的TSH刺激作用是有效的。同时，具有很强TSH拮抗剂活性的鼠单克隆抗体(9D33)是表达野生型或突变(Arg255 Asp)受体的CHO细胞中有效的TSH拮抗剂。

还发现Arg109突变为Ala的突变阻止9D33抑制TSH刺激作用的能力，但该突变对血清TSHR自身抗体(TSH拮抗剂自身抗体)阻断TSH刺激作用没有影响。

4)结果，TSHR Arg255突变为Asp的突变基本上消除了TSH激动剂型TSHR自身抗体(包括hMAb TSHR1)与受体相互作用的能力。与之相反的是，TSH激动剂型TSHR自身抗体(和TSH)能够与突变受体很好地起反应。TSHRArg255突变为Asp的突变因而可以用来区别具有TSH激动剂活性的TSHR自身抗体和具有拮抗剂活性的TSHR自身抗体。

5)针对标记TSH和标记hMAb TSHR1结合到野生型和突变TSHR制品的分析表明，Arg255突变为Ala的突变降低了受体对hMAb TSHR1的亲和性，但是对结合TSH只有很小的影响。这与突变对产生cAMP的刺激作用的影响是一致的。

在Asp232突变为Ala的情况下，没有测试到激素或抗体的结合，可能是由于突变受体的表达水平降低了。当Trp258突变为Ala时，TSH的结合同样也测试不到，而hMAb TSHR1的结合只减少了3倍。

表1

表1续

F＝“正向”引物

R＝“反向”引物

BGHR＝牛生长激素多聚腺苷酸化信号反向引物

T7＝噬菌体T7 RNA聚合酶启动子

表2a

TSHR Asp43突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)实验1野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.11636±2041940±481190.32550±1962772±98109111362±112012660±3610111314498±140013308±1030921024914±433017962±136072TSH(ng/mL)0.01902±168894±104990.031454±821532±3261050.14210±2403996±612950.39158±14408986±56098120136±138011864±120059324812^a13496±92054环AMP分析缓冲液616±30680±100实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.11564±3901648±1201050.33594±4263416±52295110750±2006940±53065317850±94016630±1820931024850±305020064±104081TSH(ng/mL)0.011000±98742±60740.031380±3261164±282830.12920±4982136±142730.310700±9606650±104062117200±401013980±33081327864±35014260±146051环AMP分析缓冲液720±22670±116

hMAbTSHR1 Fab在所有的实验中使用

a两个值的平均值

表2b

TSHR Glu61突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean；n＝2)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1648 998 610.3 3678 3204 871 19912 16020 803 25336 22304 8810 28292 23370 83TSH(ng/mL)0.01 740 482 650.03 824 612 740.1 2324 1688 730.3 4320 3392 791 24168 12914 533 23332 15842 68环AMP分析缓冲液 578 366实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1808 1312 730.3 3926 2738 701 11452 6400 563 20400 20962 10310 20114 26718 133TSH(ng/mL)0.01 992 722 730.03 1796 960 530.1 3316 2452 740.3 10440 5296 511 15826 13840 873 17582 19448 111环AMP分析缓冲液 794 680

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表2c

TSHR Glu157突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)  (mean±SD；n＝3或mean；n＝2)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1682 1216 720.3 4150 1284 311 13668 6264 463 17390 8366 4810 25920 13156 51TSH(ng/mL)0.01 548 800 1460.03 760 820 1070.1 2560 1190 460.3 5124 2668 521 19034 3288 173 22720 12830 56环AMP分析缓冲液 582 710实验2hMMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1584±66 1490±12 940.3 3568±174 2584±250 721 14560±1680 7260±990 503 16560±2210 15350±3370 9310 20900±3930 14910±1120 71TSH(ng/mL)0.01 1410±270 1330±206 940.03 1592±28 1308±216 820.1 3788±534 1842±54 490.3 10500±170 2500±1730 241 16730±1650 7100±740 423 32000 11380±300 36环AMP分析缓冲液 774±58 1124±42实验3hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1040 1260 1210.3 1644 2000 1221 12588 10924 873 15736 14816 9410 21950 26304 1200.01 708 1026 1450.03 914 1486 1630.1 2458 2008 820.3 5916 2444 411 17014 8382 493 20002 15158 76环AMP分析缓冲液 608 988

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表2d

TSHR Glu178突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean；n＝2)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1210 1346 1110.3 2710 2012 741 9190 4528 493 13790 9524 6910 24166 12492 52TSH(ng/mL)0.01 970 828 850.03 1416 1148 810.1 2218 1464 660.3 4564 3188 701 12524 9918 793 18440 13722 74环AMP分析缓冲液 540 910实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1354 1028 760.3 3372 1424 421 8820 3822 433 15524 8070 5210 19540 12040 62TSH(ng/mL)0.01 826 648 780.03 1042 810 780.1 2446 1182 480.3 5626 3018 541 13900 8050 583 19330 9080 47环AMP分析缓冲液 804 672

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表2e

TSHR Asp203突变为Ala的突变

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3或mean；n＝2)实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1202±222 968±58 810.3 2508±1198 1512±162 601 8052±1290 4824±520 603 13696±4150 8204±310 6010 16974±1920 9680±3420 57TSH(ng/mL)0.01 796±34 668±96 840.03 1028±72 984±124 960.1 2216±610 1248±82 560.3 nd 5700±380 nd1 14976±1990 8258±116 553 18592±1740 11406±4130 61环AMP分析缓冲液 804±48 614±36实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1666 1712 1030.3 2978 2642 891 nd nd nd3 15392 11414 7410 17498 21486 123TSH(ng/mL)0.01 1146 660 580.03 1566 1360 870.1 2048 2232 1090.3 5236 3112 591 16252 8790 543 16092 16328 101环AMP分析缓冲液 610 560

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表2f

TSHR Asp232突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3或mean；n＝2)实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1776 720 410.3 4086 1442 351 10000 3560 363 18030 8120 4510 11250 11210 100TSH(ng/mL)0.01 730 632 870.03 978 798 820.1 2436 1998 820.3 5600 5600 1001 10170 7400 733 12800 9384 73环AMP分析缓冲液 368 586实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1006±156 804±384 800.3 2236±94 968±24 431 11138±1080 3894±320 353 12188±860 5984±690 4910 16212±570 9476±650 58TSH(ng/mL)0.01 850±54 606±34 710.03 908±148 956±152 1050.1 2026±202 1652±256 820.3 4488±2060 3632±384 811 12034±880 7280±1070 603 16886±1400 12216±1460 72环AMP分析缓冲液 538±40 560±24

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表2g

TSHR Arg255突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3或mean；n＝2)实验1野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1644±156 706±108 430.3 3370±256 808±44 241 16964±1380 4172±660 253 18078±1210 8500±880 4710 17820±1150 11208±670 63TSH(ng/mL)0.01 950±86 826±50 870.03 1444±90 1416±86 980.1 nd 3784±1410 nd0.3 8624±360 8920±460 1031 16014±1220 12164±1060 763 16244±1570 13128±1170 81环AMP分析缓冲液 830±140 718±48实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1454 400 280.3 3126 534 171 6400 2278 363 11412 2606 2310 16878 9584 57TSH(ng/mL)0.01 450 404 900.03 778 610 780.1 1710 1566 920.3 4690 4680 1001 10082 7180 713 14830 11938 80环AMP分析缓冲液 496 290

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表2h

TSHR Trp258突变为Ala的突变

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean；n＝2)实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2040 1464 720.3 4908 4198 861 nd 5964 nd3 17958 11242 6310 29824 14208 48TSH(ng/mL)0.01 1354 952 700.03 1464 1646 1120.1 2954 3592 1220.3 12154 10398 861 17270 14774 863 13142 17270 131环AMP分析缓冲液 526 390实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2404 1206 500.3 5902 2518 431 nd nd nd3 32000 9550 3010 32000 17782 56TSR(ng/mL)0.01 1026 514 500.03 2000 1416 710.1 nd nd nd0.3 10716 12022 1121 16596 13804 833 26302 18620 71环AMP分析缓冲液 698 1158

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表2i

TSHR Asp276突变为Ala的突变

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean；n＝2)实验1 野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1490 1530 1030.3 3056 3208 1051 nd nd nd3 12136 19610 16210 21740 24030 111TSH(ng/mL)0.01 1184 1282 1080.03 1470 1550 1050.1 3188 3748 1180.3 9466 9180 971 12796 15670 1223 13820 23070 167环AMP分析缓冲液 866 960实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1346 2130 1580.3 4120 nd nd1 nd nd nd3 14216 15236 10710 18230 21320 117TSH(ng/mL)0.01 866 1236 1430.03 934 1594 1710.1 2124 2160 1020.3 5400 6000 1111 9880 16640 1683 16846 20480 122环AMP分析缓冲液 894 1132

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表2j

TSHR Ser281突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean；n＝2)实验1野生型TSHR    突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1080 936 870.3 3236 2490 771 nd 4722 nd3 15556 10416 6710 27712 17190 62TSH(ng/mL)0.01 402 828 2060.03 708 1152 1630.1 2068 1464 710.3 5200 3188 611 18548 9918 533 24136 13722 57环AMP分析缓冲液 550 356实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1500 1400 930.3 4706 4486 951 nd nd nd3 17110 11418 6710 23010 16384 71TSH(ng/mL)0.01 402 566 1410.03 708 1028 1450.1 2068 1824 880.3 5200 6250 1201 18548 10032 543 24136 14130 59环AMP分析缓冲液 582 696

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表3   突变(相对于野生型)对含有突变TSHR的CH0细胞刺激作用的

      影响的总结

氨基酸突变TSH刺激作用hMAb TSHR1 Fab刺激作用Asp43突变为Ala有些减少有些减少Glu61突变为Ala有些减少有些减少Glul57突变为Ala对一些TSH的剂量明显减少对一些抗体的剂量明显减少Glu178突变为Ala有些减少有些减少Asp203突变为Ala有些减少有些减少Asp232突变为Ala有些减少明显减少Arg255突变为Ala有些减少明显减少Trp258突变为Ala影响很小明显减少Asp276突变为Ala影响很小影响很小Ser281突变为Ala有些减少有些减少

表4a

TSHR Gln235突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 770±174 764±108 990.3 3020±398 2434±140 811 5904±650 6356±970 1083 10538±2380 13320±2080 12610 17314±1980 13486±2290 78环AMP分析缓冲液 252±58 234±24TSH(ng/mL)0.01 422±28 482±34 1140.03 816±138 810±116 990.1 1412±86 1488±264 1050.3 4756±280 4358±690 921 9722±2330 12656±160 1303 12826±5000 14266±2730 111环AMP分析缓冲液 252±58 234±24实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1958±40 1722±172 880.3 3374±244 3378±556 1001 11144±1850 11128±350 1003 15536±820 18374±3140 11810 17830±1560 17616±1750 99环AMP分析缓冲液 518±264 374±70TSH(ng/mL)0.01 1074±272 1054±222 980.03 2062±310 1878±298 910.1 4192±992 2912±254 690.3 11260±740 10458±1240 931 14364±720 18170±1680 1263 18175±1220 20128±3240 111环AMP分析缓冲液 518±264 374±70

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表4b

TSHR Thr257突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)实验1野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1080±26 972±24 900.3 2438±382 1796±366 741 16096±4100 12862±4960 803 16788±3320 11692±1250 7010 23688±3800 19994±3380 84环AMP分析缓冲液 550±58 402±132TSH(ng/mL)0.01 680±54 716±216 1050.03 996±96 1142±98 1150.1 1752±226 3188±364 1820.3 6962±1320 6284±100 901 12316±4250 12486±3100 1013 18212±3670 16674±1650 92环AMP分析缓冲液 550±58 402±132实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1532±580 998±80 650.3 3656±744 2718±286 741 8516±2600 5694±310 673 23294±6540 21948±740 9410 30580±400 27366±2330 89环AMP分析缓冲液 690±50 584±66TSH(ng/mL)0.01 864±62 776±34 900.03 1244±550 1084±1.2 870.1 2882±584 3390±294 1180.3 8584±2260 6996±680 821 19548±5380 25080±3710 1283 30344 31488±430 104环AMP分析缓冲液 690±50 584±66

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表4c

TSHR AR255突变为Ala和TSHR Trp258突变为Ala的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)实验1野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1718±92 1502±78 870.3 3116±204 1622±428 521 15540±2370 2708±340 173 14408±1960 1958±280 1410 18652±2170 5506±130 30TSH(ng/mL)0.01 1968±136 1786±66 910.03 2754±318 2628±144 950.1 4246±196 4488±742 1060.3 12026±870 12608±1570 1051 18016±3270 16362±700 913 18256±990 19162±1230 105环AMP分析缓冲液 1014±220 1386±460实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1778±24 646±48 360.3 3282±622 676±14 211 7054±2380 720±270 103 15036±700 1876±240 1210 18292±2130 3330±620 18TSH(ng/mL)0.01 910±146 796±60 870.03 1998±252 1558±80 780.1 5492±402 4066±644 740.3 8304±1280 7238±850 871 16858±1210 13718±1250 813 17088±2130 18132±2870 106环AMP分析缓冲液 666±88 662±78

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表4d

TSHR Arg255突变为Asp的突变

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)实验1 野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1124±48 488±60 430.3 2578±152 478±50 191 8950±680 370±150 43 14870±2520 620±110 410 13750±1620 1440±20 10TSH(ng/mL)0.01 1110±166 776±94 700.03 1360±210 1206±54 890.1 3246±594 2806±586 860.3 8880±800 8340±350 941 10030±2040 12400±390 1243 12260±140 9980±510 81环AMP分析缓冲液 270±84 170±40实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1088±88 374±18 340.3 2250±240 360±30 161 5904±620 154±8 33 10604±420 190±4 210 17010 150±20 1TSH (ng/mL)0.01 516±58 590±148 1140.03 1048±320 908±54 870.1 3788±644 2382±858 630.3 6906±1090 9278±1310 1341 18284±3660 9910±1100 543 17370 16000 92环AMP分析缓冲液 670±548 424±54

表5    突变(相对于野生型)对含有突变TSHR的CHO细胞刺激作用的

      影响的总结

氨基酸突变TSH刺激作用hMAb TSHR1 Fab刺激作用Gln235突变为Ala影响很小影响很小Thr237突变为Ala影响很小影响很小Arg255突变为Asp影响很小基本消除Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala影响很小基本消除

表6    来自14个患Graves病(G1-G14)的病人血清的环AMP在表达野生

       型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1野生型TSHR  突变TSHR  突变/野生  型(％)仅有环AMP分析缓冲液520±350 650±4 125HBD库570±360 420±360 74G111490±1030 3840±400 33G29250±950 1420±630 15G34590±910 950±240 21G47340±370 750±570 10G58480±800 1390±200 16G63820±480 1140±200 30G77880±580 1680±210 21G89310±650 2530±380 27TSH(3ng/mL)10180±640 12000±1960 118hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL)12060±1130 1860±190 15实验2仅有环AMP分析缓冲液150±20 340±330 227HBD150^a 150±10 100G912250±1590 1470±150 12G105880±160 560±350 10G111790±230 340±300 19G123290±360 140^a 4G138580±730 2160±140 25G142750±20 700±80 25TSH(3ng/mL)21130^a 20580±2520 97hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL)19240±2550 1510±310 8

a两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

表7    来自不同剂量hMAb TSHR1 lgG和供者血浆^a的环AMP在表达野生

      型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)样品稀释液或浓度^b 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)HBD/10 580±180 270^c 47仅有环AMP分析缓冲液 790±180 450±160 57TSH(3 ng/mL) 19010±2360 16120±1230 85hMAb TSHR1 IgG1ng/mL 4860±720 940±70 1910ng/mL 16230±230 3160±380 19100ng/mL 15410±1400 5700±360 371μg/mL 16340±3690 5030±780 31供者血浆稀释液2000x 2400±130 820±120 341000x 4180±980 970±240 23200x 11020±900 1790±240 16100x 14860±1560 2550±530 1720x 15750±1480 3160±500 20

^a供者血浆来自用于分离淋巴细胞、制备hMAb TSHRl杂交瘤细胞的相同的血液样品

^b样品在环AMP分析缓冲液中稀释

c两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

表8    通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环

      AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD：n＝3)  测试样品^a  野生型TSHR  突变TSHR  突变/野生  型(％)  仅有环AMP分析缓冲液  502±76  456±30  91  hMAb TSHR1(10ng/mL)  18220±1210  1160±150  6  2G2(1μg/mL)  524±22  540±20  103  TSMAb 1(1μg/mL)  4810±1250  1740±170  36  TSMAb 2(1μg/mL)  3440±420  860±90  25  TSMMAb C(10ng/mL)  9960±1130  1490±150  15  TSMAb D(1μg/mL)  10850±1340  1520±170  14  TSMAb E(1μg/mL)  2490±160  640±10  26  TSMAb F(100ng/mL)  16200±2680  2670±110  16

^a在环AMP缓冲液的测试样品

2G2为抗甲状腺球蛋的鼠单克隆抗体：(阴性对照)

表9    TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO

      细胞的生成。具有TSH拮抗剂活性的4份血清(B1-B4)的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean+SD：n＝3)  测试样品^a  野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)  环AMP分析缓冲液 936±336 636±86 68  TSH^b 9550±740 9580±840 100  HBD 610±84 514±34 84  HBD+TSH^b 8510±590 5070±720 60  B1 390±92 496±90 127  B1+TSH^b 740±590 520±150 70  B2 408±30 408±172 100  B2+TSH^b 240±20 440±140 183  B3 504±20 522±96 104  B3+TSH^b 320±60 550±310 172  B4 414±326 474±12 114  B4+TSH^b 1180±430 690±340 58

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^c的抑制％具有TSH拮抗剂活性的血清  野生型TSHR  突变TSHR B1 91 90 B2 97 91 B3 96 89 B4 86 86

HBD＝健康血液供者血清库

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中；所有血清以10x的终稀释液进行实验

^bTSH终浓度＝0.3ng/mL

表10    TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO

       细胞的生成。具有TSH拮抗剂活性的血清B3 (表9)不同稀释度的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(％) B3 1000x 718±68 462±80 64 B31000x+TSH^c 11650±710 3710±570 32 B3 100x 626±50 228±24 36 B3 100x+TSH^c 7590±480 180±20 2 B3 10x 358±46 190±20 53 B3 10x+TSH^c 230±98 310±230 135 HBD 1000x 718^b 410±22 57 HBD 1000x+TSH^c 12210±820 12594±496 103 HBD 100x 768±144 440±62 57 HBD 100x+TSH^c 9970±800 10960±750 110 HBD 10x 626±106 346±66 55 HBD 10x+TSH^c 8130±980 6920±360 85

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％具有TSH拮抗剂活性的血清稀释度野生型TSHR突变TSHRB3 1000x 5 70B3 100x 24 98B3 10x 97 96

HBD＝健康血液供者血清库

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

b两个值的平均值

cTSH终浓度＝0.3ng/mL

d抑制作用％＝100×(1-TSH和血清B3中的cAMP)

                       TSH和HBD中的cAMP

测试样品与HBD的稀释度相同 

测试样品与HBD的稀释度相同

表11    TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Asp的TSHR的CHO

       细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的

       单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％) 环AMP分析缓冲液1208±20 776±344 64 TSH^b15410±1450 12410±3030 81 2G2 1μg/mL+TSH^b10890±1130 10770±1040 99 2G2 10μg/mL+TSH^b11580±720 11540±260 100 2G2 100μg/mL+TSH^b11710±1890 10450±1140 89 9D33 0.001μg/mL+TSH^b12960^c 11780±750 91 9D33 0.01μg/mL+TSH^b11730±220 11760±940 100 9D33 0.1μg/mL+TSH^b9960±520 5250±610 53 9D33 1μg/mL+TSH^b7530±1150 1160±140 15 9D33 10μg/mL+TSH^b2560±1470 700±220 27 9D33 100μg/mL+TSH^b1180±70 490±80 42 9D33 100μg1178±60 558±216 47

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d    抗体的浓度  野生型TSHR  突变TSHR 2G2 1μg/mL 29 13 2G2 10μg/mL 25 7 2G2 100μg/mL 24 16 9D33 0.001μg/mL 16 5 9D33 0.01μg/mL 24 5 9D33 0.1μg/mL 35 58 9D33 1μg/mL 51 91 9D33 10μg/mL 83 94 9D33 100μg/mL 92 96

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.3ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表12    TSH和hMAb TSHR1 Fab结合到野生型(无突变)和突变TSH

       受体制剂的Scatchard分析

受体制剂TSH的亲和性hMAb TSHR1 Fab的亲和性野生型4.2±1.0×10⁹L/mol2.9±0.6×10¹⁰L/molAsp43突变为Ala3.1×10⁹L/mol3.0×10¹⁰L/molGlu61突变为Ala2.7×10⁹L/mol2.9×10¹⁰L/molGlu157突变为Ala不可测试TSH结合1.9×10¹⁰L/molGlu178突变为Ala0.9×10⁹L/mol0.6×10¹⁰L/molAsp203突变为Ala1.9×10⁹L/mol1.6×10¹⁰L/molAsp232突变为Ala不可测试TSH结合不可测试hMAb TSHR1 Fab结合Arg255突变为Ala1.9×10⁹L/mol0.5×10¹⁰L/molTrp258突变为Ala不可测试TSH结合1.0×10¹⁰L/molAsp276突变为Ala3.4×10⁹L/mol1.6×10¹⁰L/molSer281突变为Ala3.4×10⁹L/mol2.3×10¹⁰L/mol

不可测试TSH结合

不可测试hMAb TSHR1 Fab结合

表13a   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有ASp43突变为Ala的TSHR的CHO

       细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的

       单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)测试样品^a野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％)仅有环AMP分析缓冲液84±13 128±20 152TSH7142±389 6858±2398 962G2 1μg/mL+TSH^b6631±226 6854^c 1032G2 10μg/mL+TSH^b7928±1448 7876±343 992G2 100μg/mL+TSH^b6011±642 7572±196 1269D33 0.001μg/mL+TSH^b5670±1727 5989±366 1069D33 0.01μg/mL+TSH^b6809±411 6160^c 909D33 0.1μg/mL+TSH^b4958±1852 5462±467 1109D33 1μg/mL+TSH^b1636±226 1851±314 1139D33 10μg/mL+TSH^b1388±416 1175±116 859D33 100μg/mL+TSH^b681±258 863±192 1279D33 100μg1097±362 107±16 10

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度  野生型TSHR  突变TSHR 2G2 1μg/mL  7 0 2G2 10μg/mL  -11 -15 2G2 100μg/mL 16 -10 9D33 0.001μg/mL 21 13 9D33 0.01μg/mL 5 10 9D33 0.1μg/mL 31 20 9D33 1μg/mL 77 73 9D33 10μg/mL 81 83 9D33 100μg/mL 90 87

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表13b   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu61突变为Ala的TSHR的CHO

       细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的

       单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液154±16 113±3586 TSH15616±3992 12824±65182 2G2 1μg/mL+TSH^b10613±1188 15077±2841142 2G2 10μg/mL+TSH^b9163^c 12327^c135 2G2 100μg/mL+TSH^b12967^c 14989±908116 9D33 0.001μg/mL+TSH^b11478±1868 14708±1441128 9D33 0.01μg/mL+TSH^b12543^c 16118±2133129 9D33 0.1μg/mL+TSH^b13098±253 7695±348959 9D33 1μg/mL+TSH^b3249±162 3960±232122 9D33 10μg/mL+TSH^b1819±609 2800±201154 9D33 100μg/mL+TSH^b625±27 1679±546269 9D33 100μg87±43 ndnd

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 32-18 2G2 10μg/mL 414 2G2 100μg/mL 17-17 9D33 0.001μg/mL 26-15 9D33 0.01μg/mL 20-26 9D33 0.1μg/mL 1640 9D33 1μg/mL 7969 9D33 10μg/mL 8878 9D33 100μg/mL 9687

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

nd＝未确定

表13c   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu178突变为Ala的TSHR的CHO

       细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的

       单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)测试样品^a野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)仅有环AMP分析缓冲液122±25 udndTSH6162±458 4613^c752G2 1μg/mL+TSH^b5070±271 5825^c1152G2 10μg/mL+TSH^b4493^c ndnd2G2 100μg/mL+TSH^b4468±1019 4083±1170919D33 0.001μg/mL+TSH^b2784±625 4062±6371469D33 0.01μg/mL+TSH^b3255±124 4476±13831389D33 0.1μg/mL+TSH^b3439±147 1886±396559D33 1μg/mL+TSH^b754±372 540±303729D33 10μg/mL+TSH^b774±99 519±135679D33 100μg/mL+TSH^b654±115 395±241609D33 100μg83±42 34±741

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 18 -26 2G2 10μg/mL 27 nd 2G2 100μg/mL 27 11 9D33 0.001μg/mL 55 12 9D33 0.01μg/mL 53 3 9D33 0.1μg/mL 44 59 9D33 1μg/mL 88 88 9D33 10μg/mL 87 89 9D33 100μg/mL 89 91

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.3ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

ud＝不可测试

nd＝未确定

表13d  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具右Asp203突变为Ala的TSHR的CHO

      细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的

      单克隆抗体的影响

A  环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)测试样^a野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生 型(％)仅有环AMP分析缓冲液140±11 134^c 96TSH6227±1211 6167±923 992G2 1μg/mL+TSH^b4307±553 6428^c 1492G2 10μg/mL+TSH^b5579±1128 4708±908 842G2 100μg/mL+TSH^b6920±1455 5204±787 759D33 0.001μg/mL+TSH^b4916±405 5093±581 1049D33 0.01μg/mL+TSH^b4600±394 5671±1164 1239D33 0.1μg/mL+TSH^b3814±342 2905±295 769D33 1μg/mL+TSH^b760±315 1322±125 1749D33 10μg/mL+TSH^b466^c 498±97 1079D33 100μg/mL+TSH^b171^c 275±27 1619D33 100μg159±22 151±23 95

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR  突变TSHR 2G2 1μg/mL 31 -4 2G2 10μg/mL 10 24 2G2 100μg/mL -11 16 9D33 0.001μg/mL 21 17 9D33 0.01μg/mL 26 8 9D33 0.1μg/mL 39 53 9D33 1μg/mL 88 79 9D33 10μg/mL 93 92 9D33 100μg/mL 97 96

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.3ng/mL

^c两个值的平均值

^d抑制作用％=100×(1-测试样品+TSH中的cAMP)

               环AMP分析缓冲液+TSH中的cAMP

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表13e   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Gln235突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度

       的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3)测试样品a野生型TSHR突变TSHR突变/野生型％仅有环AMP分析缓冲液524^c141^c27TSH12503±106011847±689952G2 1μg/mL+TSH^b12569±199213130^c1042G2 10μg/mL+TSH^b14948±104411648±723782G2 100μg/mL+TSH^b12514±231611909±533959D33 0.001μg/mL+TSH^b10756±162312067^c1129D33 0.01μg/mL+TSH^b13418±164014843±25291119D33 0.1μg/mL+TSH^b11906±180511792±898999D33 1μg/mL+TSH^b10325±81610567±6851029D33 10μg/mL+TSH^b8185^c4368^c539D33 100μg/mL+TSH^b6127±1662171^c359D33 100μg156±8499±37320

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL-1-11 2G2 10μg/mL-202 2G2 100μg/mL0-1 9D33 0.001μg/mL14-2 9D33 0.01μg/mL-7-25 9D33 0.1μg/mL50 9D33 1μg/mL1711 9D33 10μg/mL3563 9D33 100μg/mL5182

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

d抑制作用％＝100×(1-测试样品+TSH中的cAMP)

                  环AMP分析缓冲液+TSH中的cAMP

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表13f   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释

       度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品a^-野生型TSHR突变TSHR突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液197±34325±47 165 TSH6871±97010822±1435 158 2G2 1μg/mL+TSH^b6407±114111502±2692 180 2G2 10μg/mL+TSH^b5803±1548806^c 152 2G2 100μg/mL+TSH^b8283±148512027±463 145 9D33 0.001μg/mL+TSH^b7451±147312018±2501 161 9D33 0.01μg/mL+TSH^b6528±227711961±1453 183 9D33 0.1μg/mL+TSH^b3019±5286107±753 202 9D33 1μg/mL+TSH^b1765±1452858±268 162 9D33 10μg/mL+TSH^b1369±1461873±247 137 9D33 100μg/mL+TSH^b768±1581662±177 216 9D33 100μg223±19402±57 180

B  抑制作用结果％

  TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 7-6 2G2 10μg/mL 1619 2G2 100μg/mL -21-11 9D33 0.001μg/mL -8-11 9D33 0.01μg/mL 5-11 9D33 0.1μg/mL 5644 9D33 1μg/mL 7474 9D33 10μg/mL 8083 9D33 100μg/mL 8985

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

d抑制作用％＝100×(1-测试样品+TSH中的cAMP)

                  环AMP分析缓冲液+TSH中的cAMP

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体9D33的阴性对照)

表13g   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Thr257突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆

       抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液365±40410±82 112 TSH4491^c4179±281 93 2G2 1μg/mL+TSH^b3900±1243723±344 95 2G2 10μg/mL+TSH^b4478±1533549±199 79 2G2 100μg/mL+TSH^b4038±5494191±686 104 9D33 0.001μg/mL+TSH^b4400±6723655±244 83 9D33 0.01μg/mL+TSH^b3301±1143796±372 115 9D33 0.1μg/mL+TSH^b2804±4742225±45 79 9D33 1μg/mL+TSH^b1256±2271486±217 118 9D33 10μg/mL+TSH^b536^c598^c 112 9D33 100μg/mL+TSH^b435±19523±53 120 9D33 100μg356±11457^c 128

 TSH刺激作用的抑制％^d抗体的浓度 野生型TSHR  突变TSHR 2G2 1μg/mL 13 11 2G2 10μg/mL 0 15 2G2 100μg/mL 10 0 9D33 0.001μg/mL 2 13 9D33 0.01μg/mL 26 9 9D33 0.1μg/mL 38 47 9D33 1μg/mL 72 64 9D33 10μg/mL 88 86 9D33 100μg/mL 90 87

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表13h   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Trp258突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆

       抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液119±13154±41 129 TSH8836±23758958±703 101 2G2 1μg/mL+TSH^b7339±19666244±1452 85 2G2 10μg/mL+TSH^b5250±6267015±758 134 2G2 100μg/mL+TSH^b7991±30956842±771 111 9D33 0.001μg/mL+TSH^b9371±18787449^c 79 9D33 0.01μg/mL+TSH^b7411±16946123±685 83 9D33 0.1μg/mL+TSH^b6379±2263435±359 54 9D33 1μg/mL+TSH^b1893±11641990±197 105 9D33 10μg/mL+TSH^b1342±4511150±84 86 9D33 100μg/mL+TSH^b689±118601±17 87 9D33 100μg179±11117±25 65

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％ 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 17 30 2G2 10μg/mL 41 22 2G2 100μg/mL 10 1 9D33 0.001μg/mL -6 17 9D33 0.01μg/mL 16 32 9D33 0.1μg/mL 28 62 9D33 1μg/mL 79 78 9D33 10μg/mL 85 87 9D33 100μg/mL 92 93

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(对9D33的负控制)

表13i   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Ser281突变为Ala的TSHR的

CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆

抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 94±4 173±58 184 TSH 4846±620 9761±4189 201 2G2 1μg/mL+TSH^b 4887±1492 7017^c 144 2G2 10μg/mL+TSH^b 5206^c 6929±1601 133 2G2 100μg/mL+TSH^b 5128±1801 13529±2725 264 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 6502±2731 5846±613 90 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 4502±716 7709±1418 171 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 4745±290 4119±1045 87 9D33 1μg/mL+TSH^b 1994±361 1973±45 99 9D33 10μg/mL+TSH^b 1184±136 1143±322 97 9D33 100μg/mL+TSH^b 1332±469 1066±319 80 9D33 100μg 186±15 172±24 92

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用^d的抑制％ 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL -1 28 2G2 10μg/mL -7 29 2G2 100μg/mL -6 -39 9D33 0.001μg/mL -34 40 9D33 0.01μg/mL 7 21 9D33 0.1μg/mL 2 58 9D33 1μg/mL 59 80 9D33 10μg/mL 76 88 9D33 100μg/mL 73 89

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(对9D33的负控制)

表13j   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg255突变为Ala和Trp258

       突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体

       (9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液 876±26 536±108 61 TSH 11487±683 6935±796 60 2G2 1μg/mL+TSH^b 9762±684 7202±334 74 2G2 10μg/mL+TSH^b 9374±1023 6369±33 68 2G2 100μg/mL+TSH^b 12285±1718 6513±254 53 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 8773±1226 6741±381 77 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 10499±1934 5660±157 54 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 7500±336 1647±197 22 9D33 1μg/mL+TSH^b 3468±548 643±80 19 9D33 10μg/mL+TSH^b 1243±57 497±132 40 9D33 100μg/mL+TSH^b 1063±163 189±24 18 9D33 100μg 695±33 386±28 56

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 15 -4 2G2 10μg/mL 18 8 2G2 100μg/mL -7 6 9D33 0.001μg/mL 24 3 9D33 0.01μg/mL 9 18 9D33 0.1μg/mL 35 76 9D33 1μg/mL 70 91 9D33 10μg/mL 89 93 9D33 100μg/mL 91 97

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c抑制作用％＝100×(1-测试样品+TSH中的cAMP)

                  环AMP分析缓冲液+TSH中的cAMP

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表14    突变(相对于野生型)对抑制鼠单克隆抗体9D33引起的、TSH介导

       的环AMP刺激作用的影响的总结

氨基酸突变9D33引起的、TSH介导的环AMP刺激作用的抑制Asp43突变为Ala没有影响Glu61突变为Ala没有影响Glu178突变为Ala没有影响Asp203突变为Ala没有影响Gln235突变为Ala没有影响Arg255突变为Ala没有影响Arg255突变为Asp效果增强Thr257突变为Ala没有影响Trp258突变为Ala没有影响Ser281突变为Ala没有影响Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala没有影响

表15a   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys58突变为Ala对含有TSHR的CHO细胞内

       的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)hAMP TSHR1(ng/ml)0.1 1410±124 997±132 710.3 1718±381 1962±135 1141 3067±270 8960±1 501 2923 13569±3730 6003±242 4410 16312±1559 17808±4348 109TSH(ng/mL)0.01 1410±124 1621±162 1150.03 2881±684 3020±443 1050.1 nd nd nd0.3 17623±493 19584±1889 1111 15629±2427 26367±1861 1693 16621±1196 20053±3738 121环AMP分析缓冲液 377±229 356±122实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1206±70 777±75 640.3 2571±130 1298±121 501 6754±1140 2948±169 443 11485±1262 7373±197 6410 12204±1056 13538±1409 111TSH(ng/mL)0.01 675±34 783±57 1160.03 1207±251 1441±175 1190.1 3350±326 3637±245 1090.3 9564±785 8522±335 891 12149±73 14785±1379 1223 13701±652 18020±1527 132环AMP分析缓冲液 429±31 569±23

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15b   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR lle60突变为Ala对含有TSHR的

       CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)  实验1  野生型TSHR  突变TSHR  突变/野生型  (％)  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1432±83  1574±284  110  0.3  3834±101  3060±648  80  1  9355±1170  6368±673  68  3  17404±2551  11276±798  65  10  21898±1209  22384±3337  102  TSH(ng/mL)  0.01  1106±127  966±72  87  0.03  1678±37  1624±166  97  0.1  5942^a  4550±538  77  0.3  12023±2060  9552±846  79  1  18051±1955  22768±5454  126  3  24292±1961  26734±511  110  环AMP分析缓冲液  654±19  857±76  实验2  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1537±223  1434±115  93  0.3  3684±149  2812±192  76  1  9685±723  7287±833  81  3  17373±656  12398±775  71  10  20390^a  18968±286  93  TSH(ng/mL)  0.01  1104±142  1191±73  108  0.03  1699±80  2014±338  119  0.1  4731±167  4642±328  98  0.3  12871±1429  11634±434  90  1  17341±592  17668±1213  102  3  22282±1483  20934±554  94  环AMP分析缓冲液  834±97  879±54

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15c   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Arg80突变为Ala对含有TSHR

       的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1758±502 719±78 410.3 4283±192 745±55 171 11225±673 465±57 43 20033±3422 443±29 210 22299±1244 1026±350 5TSH(ng/mL)0.01 1019±238 1612±720 1580.03 2350±1100 3372±721 1430.1 5650±304 5902^a 1040.3 12387±3782 17557±4187 1421 20052±2829 20003±2029 1003 28631±1464 17696±3212 62环AMP分析缓冲液 683±19 676±66实验2bMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2311±631 1159±214 500.3 4772±930 1352±404 281 11729±1421 1701±19 153 19197±6100 1714±189 910 19820±1443 1676±293 8TSH(ng/mL)0.01 1069±227 1375±136 1290.03 2810±539 3133±292 1110.1 nd 5894^a nd0.3 14592±1531 13199±2744 901 23710±1972 19145±1820 813 26019±4795 21095±3355 81环AMP分析缓冲液 594±38 1194±231

a两个值的平均值

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15d   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Arg80突变为Asp对含有TSHR的

       CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％hMAb TSHA1(ng/mL)0.1 1153±19 940±157 820.3 1933±194 923±19 481 5567±1067 895±66 163 11325±1045 1031±87 910 18903±3034 863±127 5TSH(ng/mL)0.01 1015±71 1015±163 1000.03 1620±309 1379±58 850.1 3470±271 2301±96 660.3 8692±455 7790±203 901 17173±1433 9859±744 573 19360±1243 14095±1426 73环AMP分析缓冲液 671±69 1098±66实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 728±54 1029±122 1410.3 1435±135 807±70 561 6506±317 855±344 133 9982±1363 1089±225 1110 24283±6165 649±346 3TSH(ng/mL)0.01 815±69 1015±126 1250.03 1088±116 1962±137 1800.1 3291±424 4496±47 1370.3 6511±785 11286±2733 1731 13663±1 309 13474±981 993 20084±4514 15230±3881 76环AMP分析缓冲液 905±258 785±113

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15e   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHRArg80突变为Asp对含有TSHR

       的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1307±198 1316±177 1000.3 2717±99 1611±225 591 7883±576 2993±741 383 11500±1811 6786±228 5910 15890±3356 10749±1312 68TSH(ng/mL)0.01 658±164 1764±110 2680.03 1335±162 2070^a 1550.1 3567±428 3932±553 1100.3 8610^a 8104±723 941 13021^a 13821±1198 1063 18076±5118 15070±2214 83环AMP分析缓冲液 432±53 914±87实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1393±27 1075±85 770.3 3709±434 1511±140 411 7756±918 3507±455 423 13197±2052 6528±202 4910 18635±1877 9085^a 49TSH(ng/mL)0.01 861±83 1047±74 1220.03 1390±181 1535±234 1100.1 3846±303 3790±288 990.3 7900±820 6400±278 811 12747±1290 9605±642 753 15892±125 16516^a 104环AMP分析缓冲液 682±97 697±12

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15f   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Glu107突变为Ala对含有TSHR

       的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1814±152 1135±53 630.3 4032±258 1096±28 271 9770±1020 985±90 103 17529±1597 1136±65 610 22348±3565 1760±175 8TSH(ng/mL)0.01 1161±153 1160±68 1000.03 2010±197 1469±111 730.1 4433±794 1906±138 430.3 10299^a 3717±283 361 18214±1154 8438±300 463 18540±1065 14885±2525 80环AMP分析缓冲液 784±38 1117±57实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1417±215 1331±95 940.3 3190±264 1259±39 391 7438±656 1053±79 143 11470±6099 1215^a 1110 19199±1545 1793±280 9TSH(ng/mL)0.01 1129±64 1302±118 1150.03 1482±246 1465^a 990.1 3788±432 1996^a 530.3 8384±643 4290±120 511 12459^a 7910±64 633 15288±691 12050^a 79环AMP分析缓冲液 416±78 1057±53

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15g   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Glu107突变为Arg对含有TSHR

       的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 500±28 468±129 940.3 1118±133 350±13 311 5204±225 ud ud3 5424±566 ud ud10 9834±709 ud udTSH(ng/mL)0.01 376±13 488±2 1300.03 608±122 488±65 800.1 1960±109 496±100 250.3 3516±154 440±183 131 7114±67 1020±340 143 8384±666 2176±244 26环AMP分析缓冲液 404±54 412±23实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 682±141 612±69 900.3 1578±294 650±27 411 4592±38 366±71 83 6706±420 430±48 610 8858±503 404±26 5TSH(ng/mL)0.01 712±62 662±92 930.03 1072±120 670±55 630.1 3680±178 732±115 200.3 6874±79 572±12 81 7652±379 2038±340 273 9250±2392 3922±650 42环AMP分析缓冲液 410±121 586±24

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15h   由hMAb TSHR1 和TSH确定的TSHR Arg109突变为Ala对含有

       TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2160±121 1287±154 600.3 5494±360 1704±136 311 14680±475 3291±230 223 20089±1269 7588±451 3810 25202±1926 17348^a 69TSH(ng/mL)0.01 1436±152 1486±183 1030.03 2355±85 1886±22 800.1 nd 4588±395 nd0.3 13613±712 8503±292 621 20552±921 19037±1144 933 24503±1410 20440±299 83环AMP分析缓冲液 1070±141 902±141实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2090^a 1122±169 540.3 3104±544 1529±65 491 8081±834 4013±733 503 17745±1891 5641±475 3210 23838±3352 11764±385 49TSH(ng/mL)0.01 1037^a 1632±121 1120.03 1709±389 2063±317 1210.1 2634^a 3970±165 1510.3 9355±1215 10053±1175 1071 17724±1701 12994±2273 733 24335±4993 20831^a 86环AMP分析缓冲液 739±49 843±85

a两个值的平均值

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15i   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHRArg109突变为Asp对含有

       TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型％hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2160±121 1287±154 600.3 5494±360 1704±136 311 14680±475 3291±230 223 20089±1269 7588±451 3810 25202±1926 17348^a 69TSH(ng/mL)0.01 1436±152 1486±183 1030.03 2355±85 1886±22 800.1 nd 4588±395 nd0.3 13613±712 8503±292 621 20552±921 19037±1144 933 24503±1410 20440±299 83环AMP分析缓冲液 1070±141 902±141实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2090^a 1122±169 540.3 3104±544 1529±65 491 8081±834 4013±733 503 17745±1891 5641±475 3210 23838±3352 11764±385 49TSH(ng/mL)0.01 1037^a 1632±121 1120.03 1709±389 2063±317 1210.1 2634^a 3970±165 1510.3 9355±1215 10053±1175 1071 17724±1701 12994±2273 733 24335±4993 20831^a 86环AMP分析缓冲液 739±49 843±85

a两个值的平均值

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15j   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys129突变为Ala对含有

       TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)mean±SD(n＝3)  实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(%)  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1536±125  1320±213  86  0.3  4391±441  1270±267  29  1  10466±1641  2398±427  23  3  16666±476  4050±125  24  10  23264±1103  10349±944  44  TSH(ng/mL)  0.01  868±138  1761±184  203  0.03  1561±349  2482±294  159  0.1  4548±269  4236±548  93  0.3  8505±119  11128±1340  131  17249±430  11396±1457  66  3  17007^a  16021±4948  94  环AMP分析缓冲液  1099±8  1217±80  实验2  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1631±75  1475±76  90  0.3  3811±556  1768±233  46  1  9073±850  1821±143  20  3  15292±1346  5892±650  39  10  20878±2859  10467^a  50  TSH(ng/mL)  0.01  1682±59  1715±273  102  0.03  2042±116  2889±393  141  0.1  5969±369  5326^a  89  0.3  12989±613  9891±347  76  1  20148±3038  15817^a  79  3  23202±1348  20875±1639  90  环AMP分析缓冲液  1168±47  970±257

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15k   由hMAbTSHR1和TSH确定的TSHRLys129突变为Asp对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 865±26 367±120 420.3 1553±361 402±64 261 5074^a 284^a 63 7400±718 275±76 410 9642±210 412±131 4TSH(ng/mL)0.01 755±116 514±112 680.03 1034±115 982±44 950.1 3829±514 2292±294 600.3 4967^a 4805±170 971 9675±1581 6491±607 673 9847±725 6092±160 61环AMP分析缓冲液 536^a 244±20实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2539^a 484±96 190.3 4054±540 508±104 131 12154±2505 438±113 43 12618^a 423^a 310 18702±804 511±216 3TSH(ng/mL)0.01 1236±139 692±122 560.03 4588±952 2448±410 530.1 5620±610 4735±757 840.3 15580±2946 12130±1978 781 22808^a 16915±852 743 23480±1160 18031±3157 77环AMP分析缓冲液 679±48 243±31

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15l   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Phe130突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2990±1000 1613±706 540.3 6015±512 2126±163 351 16504±2978 3905±265 243 19850±1256 7947±841 4010 21517±1037 17480±2580 81TSH(ng/mL)0.01 1614±336 3371±1847 2090.03 2590±672 4668±47 1800.1 nd 6373^a nd0.3 14754±1095 19325±4162 1311 19712±2403 26459±319 1343 24515±1525 21361±805 87环AMP分析缓冲液 704±64 998±123实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1820±165 776±83 430.3 3536±433 899±21 251 9107±1296 1438±274 163 10390±870 3832±701 3710 11042±688 6864±636 62TSH(ng/mL)0.01 694±43 700±54 1010.03 1470±395 1616±48 1100.1 2663±155 2863±400 1080.3 8206±678 4904±625 601 8888±1514 9401±1058 1063 11261±937 9735±739 86环AMP分析缓冲液 620±63 522±68

a两个值的平均值

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15m  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Phe134突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2205±404 1284±130 580.3 5369±753 2149±559 401 16037±697 8482±353 533 22039±1469 12127±1947 5510 20117±1880 24649±1133 123TSH(ng/mL)0.01 1189±278 776±70 650.03 2004±570 1232±52 610.1 5366±665 2622±267 490.3 11790±1622 7654±675 651 16489±2900 12049±1239 733 24168±1405 18525±602 77环AMP分析缓冲液 999±33 714±142实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 2089±201 1404±67 670.3 4016±338 2460±191 611 9400±853 6484±304 693 12799±450 11263±1128 8810 14729±2011 14146±1380 96TSH(ng/mL)0.01 1108±43 1022±72 920.03 1511±34 1475±92 980.1 4111±3 16 2660±338 650.3 8747±646 7108±673 811 10290±108 12726±761 1243 12027±996 14785±2611 123环AMP分析缓冲液 584±168 317±19

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15n  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Asp160突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)  mean±SD(n＝3)实验1  野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1328±186 814±98 610.3 3123±117 1658±180 531 8120±1331 3850±213 473 12867±1041 7536±839 5910 19292±2362 11234±1575 58TSH(ng/mL)0.01 1100±27 770±48 700.03 2136±566 901±95 420.1 nd 2012±439 nd0.3 11668±2382 4149±927 361 18079±206 8590±1072 483 16979±868 11805±1364 70环AMP分析缓冲液 742±66 546±56实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1430±532 578±238 400.3 2906±471 1465±392 501 10703±1591 3239±699 303 10749±662 6772±2578 6310 23355^a 10965±2713 47TSH(ng/mL)0.01 1054±28 789±164 750.03 2241±232 804±125 360.1 5517±755 1419±395 260.3 14042±1192 2731±1041 191 13411±3331 7500±531 563 22093±2324 10942±3387 50环AMP分析缓冲液 988±69 672±180

a两个值的平均值

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15o  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys183突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)mean±SD(n=3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1461±50 766±78 520.3 2482±141 1006±24 411 7550±616 1163±175 153 9020±703 1875±350 2110 10168±1016 4658±518 46TSH(ng/mL)0.01 910±110 921±121 1010.03 1289±184 1293±124 1000.1 3302±482 2132±269 650.3 6584±630 6661±293 1011 8834±878 10049±996 1143 9296±1282 10131±1244 109环AMP分析缓冲液 530±185 1020±39实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1370±113 1379±177 1010.3 2542±236 1478±290 581 6654±690 806±160 123 10310±1621 2907±267 2810 14617±3147 5071±388 35TSH(ng/mL)0.01 699±168 1144±139 1630.03 1471±144 2193±76 1490.1 3134±388 4292±917 1370.3 5976±693 7846±475 1311 8083±1246 18003±4157 2223 8896±565 17403±1656 196环AMP分析缓冲液 659±105 1010±108实验3hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1123±187 799±17 710.3 2037±537 914±49 451 6313±115 1697±357 273 7121±904 2997±195 4210 8543±1196 4838±957 57TSH(ng/mL)0.01 964±62 846±14 880.03 1069±139 1359±87 1270.1 2903±332 3061±1253 1050.3 6579±584 5867±763 891 7556±566 9442±629 1253 8963±288 10414±2070 116环AMP分析缓冲液 610±22 804±103

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15p  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys183突变为Asp对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1201±198 882±175 730.3 3025±387 756±74 251 9184±1712 1070±74 123 11693±254 1596±561 1410 13439±1799 2665±318 20TSH(ng/mL)0.01 838±45 1332±75 1590.03 1387±318 2531±425 1820.1 3993±712 4037±370 1010.3 9320±80 12166±821 1311 12667±1548 21066±2286 1663 15764±1934 22044±1567 140环AMP分析缓冲液 441±41 837±95实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1227±154 668±39 540.3 2518±118 594±38 241 8013±646 809±22 103 12474±540 1097±59 910 14960±989 1822±116 12TSH(ng/mL)0.01 693±33 1063±219 1530.03 1531±101 1711±125 1120.1 3619±171 3278±7 910.3 10721±729 10204±685 951 13599±380 13881±1383 1023 17172±1329 15261±1578 89环AMP分析缓冲液 509±51 710±51

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15q  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHRTyr185突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1560±238 938±68 600.3 3654±516 1178±178 321 9506±1399 1540±537 163 13540±3538 2974±240 2210 16190±2880 4654±390 29TSH(ng/mL)0.01 1134±36 1148±124 1010.03 1344±46 1492±72 1110.1 2218±256 2586±544 1170.3 4980±464 5260±506 1061 10620±1080 8976±526 853 16054±1372 9619±1098 60环AMP分析缓冲液 930±152 896±120实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1754±418 620±82 350.3 2914±210 620±32 211 8630±650 1030±266 123 20120^a 1690±108 810 18380±436 3360±380 18TSH(ng/mL)0.01 760±22 840±70 1110.03 1174±230 1150±86 980.1 1994±26 2476±395 1240.3 4980±979 3770±216 761 10460±1392 6260±792 603 16230±1754 9060±2086 56环AMP分析缓冲液 694±11 586±56

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15r  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Tyr206突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)  mean±SD(n＝3)  实验1  野生型TSHR  突变TSHR  突变/野生型(%)  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  2730±626  1362±632  50  0.3  4960±300  3366±320  68  1  11744±1142  5307±1033  45  3  14787±2786  14223±1327  96  10  19505±1949  19885±3161  102  TSH(ng/mL)  0.01  920±816  822±624  89  0.03  2360±232  2092±198  89  0.1  4276±1166  4612±754  108  0.3  14415^a  6570±2268  46  1  13467±2475  20320±4656  151  3  17150±3474  20753±5641  121  环AMP分析缓冲液  670±46  730±112  实验2  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1815±256  1410±264  78  0.3  3059±388  2594±71  85  1  10159±2795  6218±480  61  3  16264±1688  12698±705  78  10  18386±170  18523±3130  101  TSH(ng/mL)  0.01  1138±139  979±22  86  0.03  1588±262  1523±225  96  0.1  2438±364  2804±211  115  0.3  7787±1111  7931±414  102  1  12685±1379  15817±320  125  3  17173±512  20529±6651  120  环AMP分析缓冲液  763±122  758±65

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15s  由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys209突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)  实验1  野生型TSHR  突变TSHR突变/野生型(%)  hMAb TSHR1 (ng/mL)  0.1  2078±431  745±9  36  0.3  5275±941  1504±235  29  1  10842±505  3057±158  28  3  17487±2798  7931±2983  45  10  23304±1886  12495±689  54  TSH(ng/mL)  0.01  1605±609  780±80  49  0.03  2711±343  1641±375  61  0.1  5653^a  2798±373  49  0.3  15819±2569  7423±2337  47  1  22465±3295  15616±336  70  3  24344±6711  16125±1656  66  环AMP分析缓冲液  735±69  592±14  实验2  hMAb TSHR1(ng/mL)  0.1  1485±77  1169±88  79  0.3  3934±295  1390±333  35  1  8271±419  4929±144  60  3  15762±1879  7564±528  48  10  25020±2040  16556±2821  66  TSH(ng/mL)  0.01  1481±286  1106±230  75  0.03  2373±519  1507±160  64  0.1  6160^a  2781±632  45  0.3  12743±2376  6478±883  51  1  19059±1638  14596±2090  77  3  18790±2563  16519±1386  88  环AMP分析缓冲液  911±164  989±87

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15t   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Asp232突变为Arg对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 872±87 376±33 430.3 1807±541 345±57 191 6117±1041 336±168 53 12613±887 482±112 410 17622±2689 365±176 2TSH(ng/mL)0.01 565±37 499±36 880.03 730±205 415±83 570.1 1718±238 401±87 230.3 5104±985 482±68 91 9314±805 247±60 33 15288±4763 337±19 2环AMP分析缓冲液 296±96 326±42实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 579±70 310±38 540.3 1860±720 260±15 141 6492±3623 202±19 33 19766±8102 191±38 110 23054±6165 185±49 1TSH(ng/mL)0.01 528±53 407±56 770.03 536±104 314±27 590.1 3114±586 292±29 90.3 3318±676 598±706 181 15396±4345 220±3 13 18431±4386 174±16 1环AMP分析缓冲液 364±20 326±10

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15u   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Lys250突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 nd nd nd0.3 3513±322 4225±118 1201 10885±74 9440±601 873 15718±1932 15433±841 9810 21864±441 18373±860 84TSH(ng/mL)0.01 1168±206 1677±259 1440.03 1830±144 2466±430 1350.1 4133±300 4506±348 1090.3 9269±1709 11416±747 1231 18165±2560 16101±794 893 24491±903 18142±1121 74环AMP分析缓冲液 873±101 1143±47实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1599±213 1756±288 1100.3 3312±554 3370±398 1021 9469±2932 7817±924 833 15451±1813 10944±1432 7110 23359±998 16126±1202 69TSH(ng/mL)0.01 1543±276 1242±152 800.03 2150±252 2129±176 990.1 nd 4235±542 nd0.3 14628±2493 11155±1593 761 18693±1137 15395±1097 823 18628±1570 18313±677 98环AMP分析缓冲液 1000±82 899±138

nd＝未确定

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15v   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Glu251突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1468±150 1806±113 1230.3 2988±150 2496±368 841 8626±473 6874±146 803 13768±1791 10810±210 7910 18100±1361 12512±297 69TSH(ng/mL)0.01 1204±57 1324±63 1100.03 1496±111 1764±134 1180.1 3344±617 2570±273 770.3 9270±962 6872±457 741 15644±2238 11232±1478 723 18494±1815 11560±2771 63环AMP分析缓冲液 998±94 1200±105实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 990±116 1332±214 1350.3 2186±237 3034±205 1391 6726±147 4690±375 703 11466±403 11476±726 10010 19820±2013 16780±1825 85TSH(ng/mL)0.01 820±133 1552±322 1860.03 1610±150 2476±321 1870.1 3912±298 4922±750 1260.3 10490±1393 8630±1595 821 12960±2792 14110±757 1093 16684±958 18476±1985 111环AMP分析缓冲液 660±29 864±106

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15w   由hMAb TSHR1和TSH确定的TSHR Arg274突变为Ala对含

       有TSHR的CHO细胞内的环AMP的刺激影响

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1390±607 686±63 490.3 2850±170 1310±284 461 7313±587 3295±25 453 13913±3769 8454±2347 6110 14998±1828 14567±1722 97TSH(ng/mL)0.01 666±56 552±30 830.03 712±25 664±28 930.1 2184±104 1216±340 560.3 3976±254 2664±14 671 11032±1183 6310±394 573 13956±1306 9688±1557 69环AMP分析缓冲液 590±30 553±24实验2hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1380±276 996±56 720.3 2858±18 1510±252 531 9024±1360 4654±1369 523 12920±959 8230±1371 6410 15570±454 12430±2176 80TSH(ng/mL)0.01 702±152 1022±370 1460.03 854±98 976±72 1140.1 1412±106 1578±382 1120.3 3364±122 3960±587 1181 9936±1003 8954±1158 903 12894±1009 11234±856 87环AMP分析缓冲液 618±51 608±80

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表15x   TSHR Tyr279突变为Ala对经过hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO

       细胞环AMP刺激作用的影响

  生成的环AMP (fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)实验1 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(%)hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1590±124 656±100 410.3 2760±24 682±188 71 8506±419 996±150 123 15260±2326 680±25 410 17580±2606 784±145 4TSH(ng/mL)0.01 864±24 1068±124 1240.03 1258±80 926±32 740.1 2410±244 750±250 310.3 5034±178 1064±220 211 13896±1193 1236±281 93 15820±784 1424±218 9环AMP分析缓冲液 730±16 750±24实验2 hMAb TSHR1(ng/mL)0.1 1390±136 686±82 490.3 3116±552 623±114 201 6123±514 410±59 73 13878±2820 500±83 410 14995±1266 674±149 4TSH(ng/mL)0.01 830±32 684±22 820.03 1164±374 688±118 590.1 1960±126 766±106 390.3 3780±567 695±162 181 8691±662 810±227 93 12673±742 1217±170 10环AMP分析缓冲液 676±44 578±26

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表16   突变(相对于野生型)对含有突变TSHR的CHO细胞刺激作用的影

                     响的总结

氨基酸突变TSH刺激作用hMAb TSHR1 Fab刺激作用Lys58突变为Ala没有影响没有影响Ile60突变为Ala没有影响没有影响Arg80突变为Ala没有影响明显减少Arg80突变为Asp没有影响明显减少Tyr82突变为Ala没有影响有些减少Glu107突变为Ala有些减少明显减少Glu107突变为Arg明显减少明显减少Arg109突变为Ala没有影响明显减少Arg109突变为Asp有些减少明显减少Lys129突变为Ala没有影响明显减少Lys129突变为Asp没有影响明显减少Phe130突变为Ala没有影响明显减少Phe134突变为Ala没有影响没有影响Asp160突变为Ala有些减少有些减少Lys183突变为Ala没有影响明显减少Lys183突变为Asp没有影响明显减少Tyr185突变为Ala没有影响明显减少Tyr206突变为Ala没有影响没有影响Lys209突变为Ala有些减少有些减少Asp232突变为Arg明显减少明显减少Lys250突变为Ala没有影响没有影响Glu251突变为Ala没有影响没有影响Arg274突变为Ala没有影响没有影响Tyr279突变为Ala明显减少明显减少

       TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys58突变为Ala的TSHR

表17a   的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同

       稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 545±200 640±34 117 TSH 21110±1582 17775±1851 84 2G2 1μg/mL+TSH^b 19943^c 22426±3322 112 2G2 10μg/mL+TSH^b 24474±1746 17626±3253 72 2G2 100μg/mL+TSH^b 21471±1436 17478±679 81 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 18865±2836 23464±2827 124 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 21648±2909 16053^c 74 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 27181^c 22621±610 83 9D33 1μg/mL+TSH^b 13290±2829 20233±2223 152 9D33 10μg/mL+TSH^b 7942±2403 20192±3977 254 9D33 100μg/mL+TSH^b 2447±1679 23258±4341 950 9D33 100μg 832±89 1204±366 145

B  抑制作用结果％

  TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL6-26 2G2 10μg/mL-161 2G2 100μg/mL-22 9D33 0.001μg/mL11-32 9D33 0.01 μg/mL-310 9D33 0.1μg/mL-29-27 9D33 1μg/mL37-14 9D33 10μg/mL62-14 9D33 100μg/mL88-31

^a测试样品在环AMP分析缓冲液

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

       TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有lle60突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体（9D33)的不同稀释

表17b   度的-单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP (fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液557±105 889±208 160 TSH16781±1025 14407±3748 86 2G2 1μg/mL+TSH^b12022±2220 16669±2167 139 2G2 10μg/mL+TSH^b12439±2453 15501±1141 125 2G2 100μg/mL+TSH^b13056±1630 15106±931 116 9D33 0.001μg/mL+TSH^b13587±1777 18962±4050 140 9D33 0.01μg/mL+TSH^b12993±2404 18797^c 145 9D33 0.1μg/mL+TSH^b11196±1798 14519±3400 130 9D33 1μg/mL+TSH^b6601±712 12120^c 184 9D33 10μg/mL+TSH^b4500±678 7217±512 160 9D33 100μg/mL+TSH^b1627±166 4886±382 300 9D33 100μg849±207 1174±312 138

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 28 -16 2G2 10μg/mL 26 -8 2G2 100μg/mL 22 -5 9D33 0.001μg/mL 19 -32 9D33 0.01μg/mL 23 -30 9D33 0.1μg/mL 33 0 9D33 1μg/mL 61 16 9D33 10μg/mL 73 50 9D33 100μg/mL 90 66

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^o两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17c   SH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释

       度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 714±43 1088±92 152 TSH 18979^c 19704±2677 104 2G2 1μg/mL+TSH^b 20640±581 20980^c 102 202 10μg/mL+TSH^b 18496±343 19799±1419 107 2G2 100μg/mL+TSH^b 19699±1947 23450±923 119 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 19575±4282 25960±1357 133 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 23162±1504 18751±865 81 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 17648±2178 23899±300 135 9D33 1μg/mL+TSH^b 9905±1476 20875±800 2119D33 10μg/mL+TSH^b 5145±495 20797±3441 404 9D33 100μg/mL+TSH^b 2241±281 21076±2980 904 9D33 100μg 965±86 1571±205 163

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL-9-6 2G2 10μg/mL30 2G2 100μg/mL-4-19 9D33 0.001μ/mL-3-32 9D33 0.01μg/mL-225 9D33 0.1μg/mL7-21 9D33 1μg/mL49-6 9D33 10μg/mL73-6 9D33 100μg/mL88-7

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝0.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17d   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Asp的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释

       度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 659±58 514±40 78 TSH 20019±1871 17217±2685 86 2G2 1μg/mL+TSH^b 16429±308 17022±1123 104 2G2 10μg/mL+TSH^b 18361±1176 15857±2364 86 2G2 100μg/mL+TSH^b 16916±814 16942±1683 100 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 15724±1763 20521±3779 131 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 15737±1060 19300±1479 123 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 16788±1341 16258±3120 97 9D33 1μg/mL+TSH^b 8613±674 21217±2058 246 9D33 10μg/mL+TSH^b 3517±798 17035±1707 484 9D33 100μg/mL+TSH^b 1869±200 18217±1061 975 9D33 100μg 950±504 675±80 71

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 18 1 2G2 10μg/mL 8 8 2G2 100μg/mL 16 2 9D33 0.001μg/mL 21 -19 9D33 0.01μg/mL 21 -12 9D33 0.1μg/mL 16 6 9D33 1μg/mL 57 -23 9D33 10μg/mL 82 1 9D33 100μg/mL 95 6

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17e   TSH诱导的环SMP在表达野生型TSHR和具有Tyr82突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释

       度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 599±71 548±25 91 TSH 8350±1303 6602±96 79 2G2 1μg/mL+TSH^b 7358±1153 5446±265 74 2G2 10μg/mL+TSH^b 9821±1749 5906±335 60 2G2 100μg/mL+TSH^b 7962±1218 5771±19 72 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 6393±1036 8064±1472 126 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 9482±1536 7608±875 80 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 8910±526 6485±146 73 9D33 1μg/mL+TSH^b 4009±447 7291±591 181 9D33 10μg/mL+TSH^b 3395±238 7648±1386 225 9D33 100μg/mL+TSH^b 2869±254 5951±1035 207 9D33 100μg 596±33 679±48 114

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的制抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 12 18 2G2 10μg/mL -18 11 2G2 100μg/mL 5 13 9D33 0.001μg/mL 23 -22 9D33 0.01μg/L -14 -15 9D33 0.1μg/mL -7 2 9D33 1μg/mL 52 -10 9D33 10μg/mL 59 -16 9D33 100μg/mL 66 10

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17f   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu70突变为Ala的TSHR

       的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同

       稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a  野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 893±103 1215±93 136 TSH 18593±2469 14789±3005 80 2G2 1μg/mL+TSH^b 17253±1508 13057±1259 76 2G2 10μg/mL+TSH^b 18423±4503 9495±1017 52 2G2 100μg/mL+TSH^b 18952±3984 13210±2663 70 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 17646±1558 9589±516 54 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 20021±949 11194±147 56 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 16937±2431 7651±1178 45 9D33 1μg/mL+TSH^b 11655±4674 5613±1549 48 9D33 10μg/mL+TSH^b 5903±1022 2386±1294 40 9D33 100μg/mL+TSH^b 3493±395 2536±388 73 9D33 100μg 996±108 963±192 97

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 7 12 2G2 10μg/mL 1 36 2G2 100μg/mL -2 11 9D33 0.001μg/mL 5 35 9D33 0.01μg/mL -8 24 9D33 0.1μg/mL 9 48 9D33 1μg/mL 37 62 9D33 10μg/mL 68 84 9D33 100μg/mL 81 83

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17g   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu107突变为Arg的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1126±74 1263±73 112 TSH 21406±932 5857±571 27 2G2 1μg/mL+TSH^b 21490±2227 5357±756 25 2G2 10μg/mL+TSH^b 18305±2116 5502±431 30 2G2 100μg/mL+TSH^b 20965±3258 4655±243 22 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 23207±5032 4504±471 19 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 20373±2048 5297±1069 26 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 16380±566 5577±192 34 9D33 1μg/mL+TSH^b 16364±2028 5285±885 32 9D33 10μg/mL+TSH^b 8126±407 5774±866 71 9D33 100μg/mL+TSH^b 3587^c 5290±619 147 9D33 100μg 973^c 720±105 74

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 0 9 2G2 10μg/mL 14 6 2G2 100μg/mL 2 21 9D33 0.001μg/mL -8 23 9D33 0.01μg/mL 5 10 9D33 0.1μg/mL 23 5 9D33 1μg/mL 24 10 9D33 10μg/mL 62 1 9D33 100μg/mL 83 10

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17h    TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a  野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 734±285 1214±66 165 TSH 15683±3332 16060±3546 102 2G2 1μg/mL+TSH^b 16962±3784 15661±1152 92 2G2 10μg/mL+TSH^b 16231c 12589±1450 78 2G2 100μg/mL+TSH^b 16675±3301 16387±1142 98 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 16646±2135 15716±283 94 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 18722±1091 14075±905 75 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 13435±333 13803±1416 103 9D33 1μg/mL+TSH^b 8004±2106 14551±2498 182 9D33 10μg/mL+TSH^b 4718±867 11169±488 237 9D33 100μg/mL+TSH^b 1991±494 9554±830 480 9D33 100μg 1155±73 1148±19 99

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL -8 2 2G2 10μg/mL -3 22 2G2 100μg/mL -6 -2 9D33 0.001μg/mL -6 2 9D33 0.01μg/mL -19 12 9D33 0.1μg/mL 14 14 9D33 1μg/mL 49 9 9D33 10μg/mL 70 30 9D33 100μg/mL 87 59

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17i   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Asp

       的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体

       (9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 734±285 1214±66    165 TSH 15683±3332 16060±3546    102 2G2 1μg/mL+TSH^b 16962±3784 15661±1152    92 2G2 10μg/mL+TSH^b 16231^c 12589±1450    78 2G2 100μg/mL+TSH^b 16675±3301 16387±1142    98 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 16646±2135 15716±283    94 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 18722±1091 14075±905    75 9D33 0.1μg//mL+TSH^b 13435±333 13803±1416    103 9D33 1μg/mL+TSH^b 8004±2106 14551±2498    182 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 4718±867 11169±488    237 9D33 10μg/mL+TSH^b 1991±494 9554±830    480 9D33 100μg 1155±73 1148±19    99

B  抑制作用结果％

 TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度    野生型TSHR    突变TSHR 2G2 1μg/mL    -8    2 2G2 10μg/mL    -3    22 2G2 100μg/mL    -6    -2 9D33 0.001μg/mL    -6    2 9D33 0.01μg/mL    -19    12 9D33 0.1μg/mL    14    14 9D33 1μg/mL    49    9 9D33 10μg/mL    70    30 9D33 100μg/mL    87    59

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c重复的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17j   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys129突变为Ala的TSHR的

       CH0细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度

       的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well) 测试样品a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液 656±50 312±151 48 TSH 16975^c 12341±1724 73 2G2 1μg/mL+TSH^b 13540±1490 11663±980 86 2G2 10μg/mL+TSH^b 12805±785 10932±1779 85 2G2 100μg/mL+TSH^b 13629±689 12795±2243 94 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 14034±1530 14046±2244 100 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 12506±1906 10787±1468 86 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 10790±1948 14003±89 130 9D33 1μg/mL+TSH^b 7392±661 15087±2096 204 9D33 10μg/mL+TSH^b 3293±457 11271±1633 342 9D33 100μg/mL+TSH^b 2062±439 10178±1136 494 9D33 100μg 564±66 367±45 65

B  抑制作用结果％

TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 20 5 2G2 10μg/mL 25 11 2G2 100μg/mL 20 4 9D33 0.001μg/mL 17 -14 9D33 0.01μg/mL 26 13 9D33 0.1μg/mL 36 -13 9D33 1μg/mL 56 -22 9D33 10μg/mL 81 9 9D33 100μg/mL 88 18

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17k  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys129突变为Asp的TSHR

       的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同

       稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well) 测试样品a 野生型TSHR突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液 412^c 401±16 97 TSH 12783±422 4914±292 38 2G2 1μg/mL+TSH^b 12434±264 5191^c 42 2G2 10μg/mL+TSH^b 11974±467 4830±119 40 2G2 100μg/mL+TSH^b 12042±1466 4168±45 35 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 10568±844 5012±134 47 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 11833±1266 8035^c 68 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 9392±1300 4905±805 52 9D33 1μg/mL+TSH^b 5031±397 6339±823 126 9D33 10μg/mL+TSH^b 2515±278 4567±505 182 9D33 100μg/mL+TSH^b 776^c 3346±419 431 9D33 100μg 509±46 473±102 93

B  抑制作用结果％

  TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 3 -6 2G2 10μg/mL 6 2 2G2 100μg/mL 6 15 9D33 0.001μg/mL 17 -2 9D33 0.01μg/mL 7 -64 9D33 0.1μg/mL 27 0 9D33 1μg/mL 61 -29 9D33 10μg/mL 80 7 9D33 100μg/mL 94 32

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表171    TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Phe130突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1019±65 915±83 90 TSH 18088±2962 11466±995 63 2G2 1μg/mL+TSH^b 15207±1297 12415±570 82 2G2 10μg/mL+TSH^b 16741±1303 11439±440 68 2G2 100μg/mL+TSH^b 19281±3245 12223±895 63 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 14911±417 10584±1719 71 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 15722±693 11744±281 75 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 14409±810 9104±407 63 9D33 1μg/mL+TSH^b 10277±629 5212±251 51 9D33 10μg/mL+TSH^b 7116±438 3071±421 43 9D33 100μg/mL+TSH^b 3953±523 1572±150 40 9D33 100μg 1110±43 890±78 80

B  抑制作用结果％

 TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 16 -8 2G2 10μg/mL 7 0 2G2 100μg/mL -7 -7 9D33 0.001μg/mL 18 8 9D33 0.01μg/mL 13 -2 9D33 0.1μg/mL 20 21 9D33 1μg/mL 43 55 9D33 10μg/mL 61 73 9D33 100μg/mL 78 86

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17m  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Phe134突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1045±98 740±160 71 TSH 19796±1401 20249±425 102 2G2 1μg/mL+TSH^b 20013±2808 19662±1329 98 2G2 10μg/mL+TSH^b 19219±3257 19001±657 99 2G2 100μg/mL+TSH^b 20722±1156 20770±594 100 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 20420±2123 22086±351 108 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 18407±1250 21142±1984 115 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 18571±1082 21620±1118 116 9D33 1μg/mL+TSH^b 13342±433 21312±1471 160 9D33 10μg/mL+TSH^b 9106±1056 16724±1503 184 9D33 100μg/mL+TSH^b 4341±1186 11788±760 2729D33 100μg 1193±108 1149±112 96

B  抑制作用结果％

 TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL -1 3 2G2 10μg/mL 3 6 2G2 100μg/mL -5 -3 9D33 0.001μg/mL -3 -9 9D33 0.01μg/mL 7 -4 9D33 0.1μg/mL 6 -7 9D33 1μg/mL 33 -5 9D33 10μg/mL 54 17 9D33 100μg/mL 78 42

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17n TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Asp160突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well)  (mean±SD；n＝3) 测试样品 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 521±32 483±60 93 TSH 16267±1932 12291±1040 76 2G2 1μg/mL+TSH^b 15536±1852 13116±693 84 2G2 10μg/mL+TSH^b 14976±1066 10613±759 71 2G2 100μg/mL+TSH^b 15211±1303 12054±447 79 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 12507±1070 14316±554 114 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 14146±50 11125±1618 79 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 13139±526 1312±116 10 9D33 1μg/mL+TSH^b 10290c 985±285 10 9D33 10μg/mL+TSH^b 3445±491 796±135 23 9D33 100μg/mL+TSH^b 2211±125 752±82 34 9D33 100μg 498±3 539±53 108

B  抑制作用结果％

 TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 4 -7 2G2 10μg/mL 8 14 2G2 100μg/mL 6 2 9D33 0.001μg/mL 23 -16 9D33 0.01μg/mL 13 9 9D33 0.1μg/mL 19 89 9D33 1μg/mL 63 92 9D33 10μg/mL 79 94 9D33 100μg/mL 86 94

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17o   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。

       抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

生成的环AMP(fmol/cell well)  (mean±SD；n＝3) 测试样品a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 371±17 264±29 71 TSH 13792±1706 12173±3906 88 2G2 1μg/mL+TSH^b 9996±1289 14200±5323 142 2G2 10μg/mL+TSH^b 12279±2013 10616±2142 86 2G2 100μg/mL+TSH^b 10520±1450 12789±902 122 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 10372^c 13874±1472 134 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 12431±2262 17223±6145 139 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 9470±865 14012±1217 148 9D33 1μg/mL+TSH^b 2920±597 10713±3015 367 9D33 10μg/mL+TSH^b 2828±744 3857±316 136 9D33 100μg/mL+TSH^b 2210±391 3220±261 146 9D33 100μg 260±76 320±12 123

B  抑制作用结果％

  TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度野生型TSHR突变TSHR 2G2 1μg/mL 28 -17 2G2 10μg/mL 1 1 13 2G2 100μg/mL 24 -5 9D33 0.001μg/mL 25 -14 9D33 0.01μg/mL 10 -42 9D33 0.1μg/mL 31 -15 9D33 1μg/mL 79 12 9D33 10μg/mL 79 68 9D33 100μg/mL 84 74

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝0.3ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17p  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Asp的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液346±47 405±38 117 TSH8666±185 5131±788 59 2G2 1μg/mL+TSH^b8025±514 3993±499 50 2G2 10μg/mL+TSH^b9382±722 4641±1139 49 2G2 100μg/mL+TSH^b6810±871 4838±543 71 9D33 0.001μg/mL+TSH^b6931±631 4903±880 70 9D33 0.01μg/mL+TSH^b7419±989 3778±300 51 9D33 0.1μg/mL+TSH^b6250 ±208 4025±1208 64 9D33 1μg/mL+TSH^b3686±390 2757±297 75 9D33 10μg/mL+TSH^b2197±141 1818±233 83 9D33 100μg/mL+TSH^b1293±113 1294±177 100 9D33 100μg437±30 294±46 67

B  抑制作用结果％

   TSH刺激作用的抑制％^c 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 7 22 2G2 10μg/mL -8 10 2G2 100μg/mL 21 6 9D33 0.001μg/mL 20 4 9D33 0.01μg/mL 14 26 9D33 0.1μg/mL 28 22 9D33 1μg/mL 57 46 9D33 10μg/mL 75 65 9D33 100μg/mL 85 75

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17q  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Tyr185突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

  生成的环AMP (fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 33^c 118±60 358 TSH 8951±1717 4807±518 54 2G2 1μg/mL+TSH^b 9852±2211 4219±193 43 2G2 10μg/mL+TSH^b 10415±1974 5199±1202 50 2G2 100μg/mL+TSH^b 10829±2611 5153±1552 48 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 11064±2932 5476±216 49 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 9945±366 5437±632 55 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 10451±299 3132±251 30 9D33 1μg/mL+TSH^b 2849±627 1717±219 60 9D33 10μg/mL+TSH^b 1955±582 1038±27 53 9D33 100μg/mL+TSH^b 1263±204 614±329 49 9D33 100μg 103±106 178±18 173

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL -10 12 2G2 10μg/mL -16 -8 2G2 100μg/mL -20 -7 9D33 0.001μg/mL -24 -14 9D33 0.01μg/mL -11 -13 9D33 0.1μg/mL -17 35 9D33 1μg/mL 68 64 9D33 10μg/mL 78 78 9D33 100μg/mL 86 87

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL 

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17r  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Tyr206突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 125±13 127±39 102 TSH 7714±372 6022±922 78 2G2 1μg/mL+TSH^b 9832±2099 7272±732 74 2G2 10μg/mL+TSH^b 6648±859 6423±781 97 2G2 100μg/mL+TSH^b 9666±1599 6251±289 65 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 7654±1675 6523±485 85 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 7699±770 7540±1313 98 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 8113±222 3392±190 42 9D33 1μg/mL+TSH^b 2495±581 1439±466 58 9D33 10μg/mL+TSH^b 2487±396 776±128 31 9D33 100μg/mL+TSH^b 920±210 832±207 90 9D33 100μg 117±31 132±10 113

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL -27 -21 2G2 10μg/mL 14 -7 2G2 100μg/mL -25 -4 9D33 0.001μg/mL 1 -8 9D33 0.01μg/mL 0 -25 9D33 0.1μg/mL -5 44 9D33 1μg/mL 68 76 9D33 10μg/mL 68 87 9D33 100μg/mL 88 86

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17s  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys209突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a  野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 638±46 173±26 27 TSH 14724±601 5685±1592 39 2G2 1μg/mL+TSH^b 15078±2313 10707±2563 71 2G2 10μg/mL+TSH^b 16435±427 11223±2495 68 2G2 100μg/mL+TSH^b 17412^c 7649±1735 44 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 13867^c 8335±691 60 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 19164±1515 7447±3118 39 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 18410^c 5547±2107 30 9D33 1μg/mL+TSH^b 7982±1605 1292±512 16 9D33 10μg/mL+TSH^b 3503±1401 772±89 22 9D33 100μg/mL+TSH^b 964±474 710±148 74 9D33 100μg 529±22 860±212 163

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 2 -88 2G2 10μg/mL -12 -97 2G2 100μg/mL -18 -35 9D33 0.001μg/mL 6 -47 9D33 0.01μg/mL -30 -31 9D33 0.1μg/mL -25 2 9D33 1μg/mL 54 77 9D33 10μg/mL 76 86 9D33 100μg/mL 93 88

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17t   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys250突变为Ala的

       TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的不

       同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型    (％) 仅有环AMP分析缓冲液 1068±164 1491±182 140 TSH 22245^c 15844±2736 71 2G2 1μg/mL+TSH^b 19749±2395 21309±1640 108 2G2 10μg/mL+TSH^b 17609±981 13048±1718 74 2G2 100μg/mL+TSH^b 22060±2265 17966±1997 81 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 21265±375 19697±2129 93 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 21435±3957 24374±4050 114 9D33 0.1μgmL+TSH^b 16626±1019 20358±2627 122 9D33 1μg/mL+TSH^b 10260±1863 17657±2149 172 9D33 10μg/mL+TSH^b 7115±1337 9725±1349 137 9D33 100μg/mL+TSH^b 2012^c 6387±916 317 9D33 100μg 1349±122 1714±144 127

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 11 -34 2G2 10μg/mL 21 18 2G2 100μg/mL 1 -13 9D33 0.001μg/mL 4 -24 9D33 0.01μg/mL 4 -54 9D33 0.1μg/mL 25 -28 9D33 1μg/mL 54 -11 9D33 10μg/mL 68 39 9D33 100μg/mL 91 60

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17u   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu251突变为Ala的

       TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的

       不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 636±116 779±119 122 TSH 23009±3972 11398±2719 50 2G2 1μg/mL+TSH^b 17299±1029 18350^c 106 2G2 10μg/mL+TSH^b 18521±472 11028±839 60 2G2 100μg/mL+TSH^b 17147^c 6999±631 41 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 19901^c 12930±1264 65 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 15319±2933 17445±1677 114 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 18030±4806 8723±1100 48 9D33 1μg/mL+TSH^b 7108±1592 4776±933 67 9D33 10μg/mL+TSH^b 4059±704 2300±680 57 9D33 100μg/mL+TSH^b 1809±1090 1546±614 85 9D33 100μg 718±122 954±49 133

B  抑制作用结果％

  TSH刺激作用的抑制％^d 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 25 -61 2G2 10μg/mL 20 -3 2G2 100μg/mL 25 39 9D33 0.001μg/mL 14 -13 9D33 0.01μg/mL 33 -53 9D33 0.1μg/mL 22 23 9D33 1μg/mL 69 58 9D33 10μg/mL 82 80 9D33 100μg/mL 92 86

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(9D33的阴性对照)

表17v   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg274突变Ala的

       TSHR的CHO细胞的生成。抗具有TSH拮抗剂活性的TSH受体(9D33)的

       不同稀释度的单克隆抗体的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP (fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品^a 野生型TSHR 突变 TSHR突变/野生型    (％) Cyclic AMP assay buffer only 621±37 157^c25 TSH 5355±1126 3335^c62 2G2 1μg/mL±TSH^b 4032^c 4830^c120 2G2 10μg/mL+TSH^b 4399±504 3099±40770 2G2 100μg/mL+TSH^b 4247^c 3292±27178 9D33 0.001μg/mL+TSH^b 3663±310 4012±591110 9D33 0.01μg/mL+TSH^b 3881±459 4330±631112 9D33 0.1μg/mL+TSH^b 4788±1443 721±11115 9D33 1μg/mL+TSH^b 741±104 169±323 9D33 10μg/mL+TSH^b 885^c 145^c16 9D33 100μg/mL+TSH^b 645±53 131^c20 9D33 100μg 637^c 710±23111

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％ 抗体的浓度 野生型TSHR 突变TSHR 2G2 1μg/mL 25 -45 2G2 10μg/mL 18 7 2G2 100μg/mL 21 1 9D33 0.001μg/mL 32 -20 9D33 0.01μg/mL 28 -30 9D33 0.1μg/mL 11 78 9D33 1μg/mL 86 95 9D33 10μg/mL 83 96 9D33 100μg/mL 88 96

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^c两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(对9D33的阴性对照)

表18    突变(相对于野生型)对抑制鼠单克隆抗体9D33引起的、TSH介导

       的环AMP刺激作用的影响的总结

氨基酸突变9D33引起的、TSH介导的环AMP刺激作用的抑制Lys58突变为Ala明显减少Ile60突变为Ala没有影响Arg80突变为Ala明显减少Arg80突变为Asp明显减少Tyr82突变为Ala明显减少Glu107突变为Ala没有影响Glu107突变为Arg明显减少Arg109突变为Ala明显减少Arg109突变为Asp明显减少Lys129突变为Ala明显减少Lys129突变为Asp明显减少Phe130突变为Ala没有影响Phe134突变为Ala明显减少Asp160突变为Ala效果增强Lys183突变为Ala没有影响Lys183突变为Asp没有影响Tyr185突变为Ala没有影响Tyr206突变为Ala没有影响Lys209突变为Ala没有影响Lys250突变为Ala有些减少Glu251突变为Ala没有影响Arg255突变为Asp效果增强Arg274突变为Ala效果增强

表19a  来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 720±122 1003±85 139 HBDpool 787±125 848±153 108 G1 14546±1913 10329±1326 71 G9 9192^a 633±36 7 G15 10180±1530 5538±958 54 G17 6592±291 6897±77 105 G19 9042±1407 6907±621 76 G20 11821±1569 1895±702 16 G21 11951±1402 11911±2267 100 G22 10877±752 12125±2063 111 TSH(3ng/mL) 12439±1630 18231±1357 147 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 15900±1903 965±164 6

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19b    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 645±99 1208±141 187 HBD库 496±78 1150±206 232 G1 23914±3837 9108±130 38 G9 14026±2339 434^a 3 G15 9131^a 2592±1027 28 G17 6311±545 7947±733 126 G19 10232±1812 8840±135 86 G20 7893±359 1670±275 21 G21 11033±1326 12006±1256 109 G22 14261±686 15182±2888 106 TSH(3ng/mL) 26172±3344 18825±1323 72 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 22054±1743 830±44 4

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19c    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu107突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 467±55 1044±120 224 HBD库 349±31 563±16 161 G1 24022±2266 11449±1745 48 G2 10291±2092 9515±1660 92 G3 1750±89 945±68 54 G4 5654±902 630±105 11 G5 1997±429 841±90 42 G6 8862±648 2741±502 31 G7 8524±1333 563±9 7 G10 1072±78 862±57 80 TSH(3ng/mL) 21689±4541 14393±3517 66 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 20193^a 1269±214 6

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19d  来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1109±216 837±166 75 HBD库 469±68 538±156 115 G1 20487±2394 18398±2682 90 G11 1541±40 471±116 31 G15 12402±671 6619^a 53 G16 2382±166 508^a 21 G17 8351±142 240^a 3 G18 2160^a 271±33 13 G19 11235±1167 7134±458 63 G20 10485±1872 5486±231 52 TSH(3ng/mL) 22177±3724 18545±1365 84 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 18509±1980 8835^a 48

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19e    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1164±135 156±17 13 HBD库 684±9 142^a 21 G1 13261±1829 12183±440 92 G9 10959±1289 3985±714 36 G15 10163±1093 2895±372 28 G17 8802±1300 ud nd G19 9120±1226 7588±261 83 G20 9028±0 774±170 9 G21 11249±665 2711±47 24 G22 10929±605 592±159 5 TSH(3ng/mL) 13087±1240 12308±500 94 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 12318±513 29701^a 24

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19f    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys129突变为Ala的TSHR的CHO细的刺激作用

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 733±130 774±116 106 HBD库 555±82 676±63 122 G1 14504±1914 12217±1309 84 G9 11371±1268 6705±490 59 G15 8331±413 5896±841 71 G17 6769±1311 3642±534 54 G19 6232^a 5588±433 90 G20 6974±416 4561^a 65 G21 9638±923 6384±717 66 G22 11167±849 8579±1015 77 TSH(3ng/mL) 12021±597 10747±1097 89 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 15281±2616 5457±294 36

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

ud＝不可测试

nd＝未确定

表19g    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺激作用

 在环AMP分析缓冲液中的测试样品  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMp分析缓冲液 564^a 501±30 89 HBD库 388±7 423±83 109 G1 20190^a 13292±1339 66 G2 11793±1112 4213±350 36 G3 3406±149 2699±246 79 G4 3465±102 2473±302 71 G5 3850±297 4540^a 118 G6 2702±76 2148±262 79 G7 3666±72 11567±604 316 G10 3682±136 9445^a 257 TSH(3ng/mL) 15633±1329 15528±2057 99 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 12921±1927 2685±166 21 实验2 仅有环AMP分析缓冲液 609±103 824±115 135 HBD 767^a 847±82 110 G7 8582±919 21820±3119 254 G10 6900±1020 11315±582 164 TSH(3ng/mL) 6652±507 10158^a 153

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19h    来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液 1177±84 1060±129 90 HBD库 1083±90 818±87 76 G1 23805±711 16885±3813 71 G2 15218±742 5498±463 36 G3 6751±299 2222^a 33 G4 8658^a 1891±383 21 G5 9597±880 5432±502 57 G6 6452±251 6751±295 105 G7 9408±1016 8245±1419 88 G10 10221±634 5346±794 52 TSH(3ng/mL) 20683±1193 20430±1646 99 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 21674±6631 2288±332 11

amean两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表19i   来自8个患Graves病的病人血清的环AMP在表达野生型TSHR和Trp具有

       Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala双突变的TSHR的CHO细胞的刺激作

       用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 在环AMP分析缓冲液中 的测试样品 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液 971±158 852±39 88 HBD库 195±15 192±11 98 G1 23823±3713 10040^a 42 G15 16707^a 988±184 6 G16 5936^a 284±56 5 G18 4188±249 539±54 13 G19 9319±2112 1166±187 13 G21 18524^a 1131±90 6 G22 20146±599 10350^a 51 G23 3135±965 614±112 20 TSH(3ng/mL) 22914±3567 21673±2216 95 hMAb TSHR1 Fab(10ng/mL) 22605±2137 1228±48 5

a两个值的平均值

HBD＝健康血液供者血清库

G1-G23＝来自患有Graves病的病人血清

表20    突变(相对于野生型)对来自患有Graves病的病人血清(n＝8)的环

       AMP刺激作用的影响的总结

氨基酸突变 明显减 少 减少 影响小 没有影响 效果增强Arg80突变为Ala 2/8 1/8 2/8 3/8 0/8Arg80突变为Asp 3/8 1/8 1/8 3/8 0/8Glu107突变为Ala 2/8 4/8 1/8 1/8 0/8Arg109突变为Ala 3/8 3/8 1/8 1/8 0/8Arg109突变为Asp 5/8 1/8 1/8 1/8 0/8Lys129突变为Ala 0/8 2/8 5/8 1/8 0/8Lys183突变为Ala 0/8 1/8 4/8 1/8 2/8Lys183突变为Asp 1/8 4/8 2/8 1/8 0/8Arg255突变为Asp 8/8 0/8 0/8 0/8 0/8Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala 6/8 2/8 0/8 0/8 0/8

显示受到影响的血清数目/来自用于测试每一种突变的8个血清

表21a   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP

       在表达野生型TSHR和具有Arg80突变为Asp的TSHR的CHO细

       胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中 的测试样品    野生型TSHR    突变TSHR 突变/野生型  (％) 仅有环AMP分析缓冲液    484±74    880±142    182 hMAb TSHR1(10ng/mL)    15218±1052    1284±469    8 2G2(1μg/mL)    726±164    946±207    130 TSMAb1(1μg/mL)    4862±510    1480±160    30 TSMAb2(1μg/mL)    3390±459    945±200    28 TSMAbC(10ng/mL)    5261±472    1532±320    29 TSMAbD(1μg/mL)    6714±398    1255±316    19 TSMAbE(1μg/mL)    6861±1025    1083±199    16 TSMAbF(100ng/mL)    11271±1753    1424±279    13

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21b   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP

       在表达野生型TSHR和具有Glu107突变为Ala的TSHR的CHO细

       胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中 的测试样品  野生型TSHR    突变TSHR 突变/野生型    (％) 仅有环AMP分析缓冲液  470±85    1130±119    240 hMAb TSHR1(10ng/mL)  19175^a    1238±15    6 2G2(1μg/mL)  632±214    1057±129    167 TSMAb1(1μg/mL)  5986±374    1049±170    18 TSMAb2(1μg/mL)  4214±448    1106±105    26 TSMAbC(10ng/mL)  7181±678    1267±140    18 TSMAbD(1μg/mL)  10157^a    1149±120    11 TSMAbE(1μg/mL)  7425^a    1224±50    16 TSMAbF(100ng/mL)  13203±891    1158±137    9

^a两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21c   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP

       在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Ala的TSHR的CHO

       细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中 的测试样品  野生型TSHR   突变TSHR 突变/野生型  (％) 仅有环AMP分析缓冲液  727±41    1036±190    143 hMAb TSHR1(10ng/mL)  18093±2166    9972±697    55 2G2(1μg/mL)  935^a    718±161    77 TSMAb1(1μg/mL)  5622±381    526^a    9 TSMAb2(1μg/mL)  4325±731    444±86    10 TSMAbC(10ng/mL)  5807±708    3706±207    64 TSMAbD(1μg/mL)  8462±1673    3047±395    36 TSMAbE(1μg/mL)  6729±813    3246±612    48 TSMAbF(100ng/mL)  13964±1780    6727±791    48

^a两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21d   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP在表达

       野生型TSHR和具有Arg109突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

生成的环AMP(fmol/cell well)(mean±SD；n＝3)在环AMP分析缓冲液中的测试样品野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液630±22 413±1 66 hMAb TSHR1(10ng/mL)17787±1359 3733±395 21 2G2(1μg/mL)645±103 359±113 56 TSMAb 1(1μg/mL)4489±576 491±36 11 TSMAb 2(1μg/mL)4102±413 278^a 7 TSMAb C(10ng/mL)7440±548 709^a 10 TSMAb D(1μg/mL)9305±1019 591±30 6 TSMAb E(1μg/mL)8387±720 530±52 6 TSMAb F(100ng/mL)12292±1280 473^a 4

a两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21e   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP在表达野

       生型TSHR和具有Glu107突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺激作用

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的 测试样品野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液1196±28 1002±154 84 hMAb TSHR1(10ng/mL)28890±2504 10900±818 38 2G2(1μg/mL)1396±146 331^a 24 TSMAb 1(1μg/mL)6220±850 4700±840 76 TSMAb 2(1μg/mL)5706±792 3394±560 59 TSMAb C(10ng/mL)10288^a 540±186 5 TSMAb D(1μg/mL)13806±716 816±26 6 TSMAb E(1μg/mL)8746±968 656±82 8 TSMAb F(100ng/mL)20126±1972 2264^a 11

a两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21f   通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP在

       表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Ala的TSHR的CHO细胞的刺

       激作用

生成的环AMP(fmol/cell well)(mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的 测试样品野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ 仅有环AMP分析缓冲液717±98 601±83 84 hMAb TSHR1(10ng/mL)25794±1025 3182±771 12 2G2(1μg/mL)784±77 796±104 102 TSMAb 1(1μg/mL)4213^a 881±188 21 TSMAb 2(1μg/mL)3455±435 524^a 15 TSMAb C(10ng/mL)7935^a 655^a 8 TSMAb D(1μg/mL)9919±983 556±89 6 TSMAb E(1μg/mL)8487±1541 703±20 8 TSMAb F(100ng/mL)15068±1503 797±131 5

a两个值的平均值

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表21g    通过6个不同鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Asp的TSHR的CHO细胞的刺激作用

生成的环AMP fmol/cell well(mean±SD；n＝3) 在环AMP分析缓冲液中的测试样品野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型(％) 仅有环AMP分析缓冲液909±51 1005±136 111 hMAb TSHR1(10ng/mL)25297^a 1755±83 7 2G2(1μg/mL)1296±126 1256±134 97 TSMAb 1(1μg/mL)8228±1348 653±174 8 TSMAb 2(1μg/mL)8026±1398 370^a 5 TSMAb C(10ng/mL)10381±70 540±144 5 TSMAb D(1μg/mL)16466±5817 1350±98 8 TSMAb E(1μg/mL)10765±1543 325±13 8 TSMAb F(100ng/mL)17634±1701 390±34 2

a两个值的平均值 

2G2为抗甲状腺球蛋白的鼠单克隆抗体(阴性对照)

表22    突变(相对于野生型)对通过鼠甲状腺刺激单克隆抗体(mTSMAbs)生成的环AMP刺激作用的影响的总结

氨基酸突变明显减少减少影响小没有影响 Arg80 to Asp 6/6 0/6 0/6 0/6 Glu107 to Ala 6/6 0/6 0/6 0/6 Arg109 to Ala 2/6 3/6 1/6 0/6 Arg109 to Asp 6/6 0/6 0/6 0/6 Lys129 to Ala 4/6 2/6 0/6 0/6 Lys183 to Ala 6/6 0/6 0/6 0/6 Lys183 to Asp 6/6 0/6 0/6 0/6 Arg255 to Asp 6/6 0/6 0/6 0/6

显示受到影响的单克隆抗体数目/来自用于测试每一种突变的6个单克隆抗体

表23a  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Glu107突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。具有TSH拮抗剂活性的血清B3(表9)不同稀释度的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品稀释液^a 野生型TSHR  突变TSHR 突变/野生型 (％) B3 1000x 1041±143 1073±251 103 B3 1000x+TSH^b 15561±1630 10918±601 70 B3 100x 567^c 214±24 38 B3 100x+TSH^b 10246±469 478^c 5 B3 10x 161±23 168±33 104 B3 10x+TSH^b 165^c 156±26 95 HBD 1000x 877±154 1518±195 173 HBD 1000x+TSH^b 18086±1390 11896±1044 66 HBD 100x 931±73 1001±244 108 HBD 100x+TSH^b 18850±1541 11777±759 62 HBD 10x 563±302 515±308 91 HBD 10x+TSH^b 20456±1912 10284±146 50

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％ 具有TSH拮抗剂活性 的血清 野生型TSHR 突变TSHR B3 1000x 14 8 B3 100x 46 96 B3 10x 99 98

HBD＝健康血液供者血清库

^a测试样品在环AMP分析缓冲液中

^bTSH终浓度＝1.5ng/mL

^c两个值的平均值

测试样品与HBD的稀释度相同

表23b   TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Arg109突变为Ala的TSHR的

       CHO细胞的生成。具有TSH拮抗剂活性的血清B3(表9)不同稀释度的影响

A环AMP水平

    生成的环AMP(fmol/cell well)    (mean±SD；n＝3) 测试样品稀释液^a 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型 (％) B3 1000x 510±100 1224^c 240 B3 1000x+TSH^b 20938^c 12248±824 58 B3 100x 425^c 378±55 89 B3 100x+TSH^b 20790^c 10358±1447 50 B3 10x 226±18 269±16 119 B3 10x+TSH^b 349±64 294±46 84 HBD 1000x 419^c 473^c 113 HBD 1000x+TSH^b 21126±884 14225±2494 67 HBD 100x 462^c 478^c 103 HBD 100x+TSH^b 22146±919 11051^c 50 HBD 10x 378±14 302^c 80 HBD 10x+TSH^b 22973±514 14197±1977 62

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％ 具有TSH拮抗剂活 性的血清 野生型TSHR 突变TSHR B3 1000x 1 14 B3 100x 6 6 B3 10x 98 98

HBD＝健康血液供者血清库

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度＝1.5ng/mL

c两个值的平均值

测试样品与HBD的稀释度相同

表23c  TSH诱导的环AMP在表达野生型TSHR和具有Lys183突变为Ala的TSHR的CHO细胞的生成。具有TSH拮抗剂活性的血清B3(表9)不同稀释度的影响

A环AMP水平

  生成的环AMP(fmol/cell well)  (mean±SD；n=3)测试样品稀释液^a 野生型TSHR 突变TSHR突变/野生型   (％)        B3 1000x 535±52 549±31 103B3 1000x+TSH^b 12400±790 14656±2399 118B3 100x 389±36 267±12 69B3 100x+TSH^b 3420±159 2929±310 86B3 10x 149±6 150^c 101B3 10x+TSH^b 157±21 170^c 108HBD 1000x 569^c 648±65 114HBD 1000x+TSH^b 12762±150 13589±2282 106HBD 100x 548±16 404±237 74HBD 100x+TSH^b 13803±747 13112±1442 95HBD 10x 396±102 368^c 93HBD 10x+TSH^b 11959±940 14161±1648 118

B  抑制作用结果％

    TSH刺激作用^d的抑制％ 具有TSH拮抗剂活性的血清 野生型TSHR    突变TSHR B3 1000x 3 -8 B3 100x 75 78 B3 10x 99 99

HBD＝僻康血液供者血清库

a测试样品在环AMP分析缓冲液中

bTSH终浓度=1.5ng/mL

c两个值的平均值

d抑制作用％＝100×(1～TSH和血清B3中的cAMP

                      TSH和HBD中的cAMP

测试样品与HBD的稀释度相同

表24    突变(相对于野生型)对抑制具有TSH拮抗剂活性的血清B3(表9)

       引起的、TSH介导的环AMP刺激作用的影响的总结

氨基酸突变9D33引起的、TSH介导的环AMP刺激作用的抑制Glu107突变为Ala效果增强Arg109突变为Ala没有影响Lys183突变为Ala没有影响Arg255突变为Asp效果增强

表25  TSH、hMAb TSHR1 Fsb和9D33 MAb结合到野生型(无突变)和突变TSH受体制剂的Scatchard分析

  受体制剂 TSH的亲和性 hMAb TSHR1 Fab的亲和性 9D33 MAb的亲和性  野生型 6.0±0.9×10⁹L/mol 3.4±1.0×10¹⁰L/mol 1.8±0.7×10¹⁰L/mol  Asp43突变为Ala 3.4×10⁹L/mol 2.7×10¹⁰L/mol 1.4×10¹⁰L/mol  Lys58突变为Ala 5.9×10⁹L/mol 1.6×10¹⁰L/mol 不可测试9D33MAb结合  lle60突变为Ala 5.1×10⁹L/mol 4.4×10¹⁰L/mol 不可测试9D33MAb结合  Glu61突变为Ala 2.4×10⁹L/mol 3.4×10⁹L/mol 0.9×10¹⁰L/mol  Arg80突变为Ala 4.2×10⁹L/mol 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合 不可测试9D33MAb结合  Arg80突变为Asp 2.8×10⁹L/mol 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合 不可测试9D33MAb结合  Tyr82突变为Ala 4.0×10⁹L/mol 1.8×10¹⁰L/mol 不可测试9D33MAb结合  Glu107突变为Ala 3.7×10⁹L/mol 0.1×10¹⁰L/mol 0.6×10¹⁰L/mol  Glu107突变为Arg 不可测试TSH结合 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合 不可测试9D33MAb结合  Arg109突变为Ala 1.1×10⁹L/mol 2.3×10¹⁰L/mol 不可测试9D33MAb结合  Arg109突变为Asp 不可测试TSH结合 不可测试hNAb TSHR1 Fab结合 不可测试9D33MAb结合

表25续

  受体制剂 TSH的亲和性 hMAb TSHR1 Fab的亲和性  9D33 MAb的亲和性  Lys129突变为Ala 2.2×10⁹L/mol 0.3×10¹⁰L/mol  不可测试9D33MAb结合  Lys129突变为Asp 不可测试TSH结合 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合  不可测试9D33MAb结合  Phe130突变为Ala 2.4×10⁹L/mol 0.3×10¹⁰L/mol  0.9×10¹⁰L/mol  Phe134突变为Ala 2.1×10⁹L/mol 0.9×10¹⁰L/mol  0.5×10¹⁰L/mol  Glu157突变为Ala 不可测试TSH结合 2.2×10¹⁰L/mol  1.3×10¹⁰L/mol  Asp160突变为Ala 不可测试TSH结合 1.8×10¹⁰L/mol  1.0×10¹⁰L/mol  Glu178突变为Ala 1.0×10⁹L/mol 0.5×10¹⁰L/mol  1.3×10¹⁰L/mol  Lys183突变为Ala 16×10⁹L/mol nt  nt  Lys183突变为Asp 不可测试TSH结合 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合  不可测试9D33MAb结合  Tyr185突变为Ala 3.4×10⁹L/mol 0.4×10¹⁰L/mol  0.9×10¹⁰L/mol  Asp203突变为Ala 2.2×10⁹L/mol 1.9×10¹⁰L/mol  1.4×10¹⁰L/mol  Tyr206突变为Ala 不可测试TSH结合 nt  不可测试9D33MAb结合  Lys209突变为Ala 不可测试TSH结合 1.3×10¹⁰L/mol  0.8×10¹⁰L/mol  Asp232突变为Ala 不可测试TSH结合 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合  不可测试9D33MAb结合

表25续

  受体制剂 TSH的亲和性 hMAb TSHR1 Fab的亲和性 9D33 MAb的亲和性  Asp232突变为Arg J测试TSH结合 不可测试hMAb TSHR1 Fab结合 不可测试9D33MAb结合  Gln235突变为Ala 4.9×10¹⁰L/mol 2.5×10¹⁰L/mol 1.1×10¹⁰L/mol  Lys250突变为Ala 不可测试TSH结合 0.9×10¹⁰L/mol 0.6×10¹⁰L/mol  Glu251突变为Ala 2.0×10⁹L/mol 1.9×10¹⁰L/mol 0.8×10¹⁰L/mol  Arg255突变为Ala 2.3×10⁹L/mol 0.7×10¹⁰L/mol 0.8×10¹⁰L/mol  Arg255突变为Asp 不可测试TSH结合 0.3×10¹⁰L/mol 1.3×10¹⁰L/mol  Thr257突变为Ala 不可测试TSH结合 1.8×10¹⁰L/mol 0.7×10¹⁰L/mol  Trp258突变为Ala 不可测试TSH结合 1.4×10¹⁰L/mol 1.2×10¹⁰L/mol  Arg274突变为Ala 不可测试TSH结合 0.8×10¹⁰L/mol 0.5×10¹⁰L/mol  Asp276突变为Ala 5.5×10⁹L/mol 1.6×10¹⁰L/mol 1.3×10¹⁰L/mol  Tyr279突变为Ala 不可测试TSH结合 0.7×10¹⁰L/mol 0.6×10¹⁰L/mol  Ser281突变为Ala 3.4×10⁹L/mol 2.3×10¹⁰L/mol 0.9×10¹⁰L/mol  Arg255突变为Ala  和Trp258突变为Ala 不可测试TSH结合 1.0×10¹⁰L/mol 1.1×10¹⁰L/mol

nt＝未测试

表26   hMAb TSHR1 Fab和TSH对含有氨基酸突变的TSH受体结合亲和性，

      所述突变表现出激素和抗体对环AMP刺激作用的影响之间的区别

氨基酸突变TSH的亲和性hMAb TSHR1 Fab的亲和性Arg80突变为Ala没有变化不可测试的结合Arg80突变为Asp没有变化不可测试的结合Tyr82突变为Ala没有变化没有变化Glu107突变为Ala没有变化明显减少Arg109突变为Ala减少没有变化Arg109突变为Asp不可测试的结合不可测试的结合Lys129突变为Ala没有变化明显减少Lys129突变为Asp不可测试的结合不可测试的结合Phe130突变为Ala没有变化明显减少Lys183突变为Ala增加未测试Lys183突变为Asp不可测试的结合不可测试的结合Tyr185突变为Ala没有变化明显减少Asp232突变为Ala不可测试的结合不可测试的结合Arg255突变为Ala没有变化明显减少Arg255突变为Asp不可测试的结合明显减少Trp258突变为Ala不可测试的结合轻微减少Arg255突变为Ala和Trp突变为Ala不可测试的结合轻微减少

表27a    Glu157突变为Ala和Asp203突变为Ala的TSHR双突变对环AMP

     在通过hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影

     响

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1737±112 1136±109 65 0.3 5032±458 1686±419 34 1 9528±1680 2499±1359 26 3 14622±2685 6831±65 47 10 20515±3415 9527±1081 46 TSH(ng/mL) 0.01 953±166 1037±56 109 0.03 836±447 1128±57 135 0.1 2083±337 1114±113 53 0.3 13295±5822 1197±112 9 1 22327±1531 4622±245 21 3 20802±6167 7710±329 37 环AMP分析缓冲液 1108±206 1029±67 实验2 hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 2278±607 2489±91 109 0.3 4233±270 2856±227 63 1 13534±999 5506±1111 41 3 20909±500 13767±1284 66 10 23297±3180 19498±1786 84 TSH(ng/mL) 0.01 1071±531 1769±426 165 0.03 2110±36 2291±230 109 0.1 4574±181 2306±339 50 0.3 12723±362 2342±342 18 1 22463±916 6969±1339 31 3 24331±834 13458±745 55 环AMP分析缓冲液 877±118 2467±251

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表27b  Glu178突变为Ala和Asp203突变为Ala的TSHR双突变对环AMP在通过

      hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1845±349 2199±25 119 0.3 2995±74 2388±474 80 1 10614±386 7005±975 66 3 14298±3757 13707±903 96 10 17794±1486 14808±1165 83 TSH(ng/mL) 0.01 1682±329 2574±408 153 0.03 1913±132 3206±86 168 0.1 3881±290 3702±114 95 0.3 11501±1064 10892±616 95 1 17275±970 16664±1429 96 3 19963±2506 20605±1452 103 环AMP分析缓冲液 895±30 1531±114 实验2 hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1326±139 815±51 61 0.3 2244^a 1195±57 53 1 6558±1708 1965±89 30 3 14499±3232 5238±636 36 10 19735±1460 10913±2826 55 TSH(ng/mL) 0.01 949±64 637±93 67 0.03 1343±240 1106±98 82 0.1 4351±928 1367±120 31 0.3 9438±1460 2540±232 27 1 18296±2078 7852±1106 43 3 20253±735 13321±3239 66 环AMP分析缓冲液 613±45 500±55

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表27c Asp232突变为Ala和Arg255突变为Ala的TSHR双突变对环AMP在通过hMAb

     TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1653±187 609±20 37 0.3 2956±209 623±42 21 1 9782±1779 1153±516 12 3 13850±1496 1341±424 10 10 14827±1864 2713±289 18 TSH(ng/mL) 0.01 1031±94 604±39 59 0.03 2142±256 779±72 36 0.1 4658±332 1581±139 34 0.3 9352±995 3877±116 41 1 16490±2070 5499±486 33 3 14656±501 5532±1145 38 环AMP分析缓冲液 671±36 608±20 实验2 hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1166±68 849±33 73 0.3 2407±359 967±70 40 1 6155±2046 1227±129 20 3 13626±2714 1315±128 10 10 14114±3164 2830±386 20 TSH(ng/mL) 0.01 1373±284 1254±39 91 0.03 2761±611 1445±123 52 0.1 nd 2793±528 nd 0.3 10839±1399 5434±543 50 1 18337±2139 6879±748 38 3 16581±5023 6697±367 40 环AMP分析缓冲液 747±160 749±148

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表27b    Asp232突变为Arg和Arg255突变为Asp的TSHR双突变对环AM在通过

        hMAb TSHR1 和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD  (n＝3 ) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型％ hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1411±110 1098±86 78 0.3 5592^a 1036±91 19 1 8555^a 2660±164 31 3 16325^a 2976±246 18 10 20490^a 196±83 10 TSH(ng/mL) 0.01 1456±63 1018±106 70 0.03 1755±173 1079±17 61 0.1 5811±153 1087±95 19 0.3 10213±897 2613^a 26 1 20782±3649 2703^a 13 3 25952±435 2743^a 11 环AMP分析缓冲液 1233±208 1095±71 实验2 hMAb TSHR1(ng/mL) 0.1 1649±194 968±72 59 0.3 2786±320 1051±60 38 1 8364±344 949±305 11 3 13271±1940 794±316 6 10 17431±3371 399±83 2 TSH(ng/mL) 0.01 1185±49 1219±246 103 0.03 1745±269 1463±98 84 0.1 2938±462 1571±173 53 0.3 8603±1998 1274±300 15 1 19137±1060 1291±243 7 3 19796±947 832±330 4 环AMP分析缓冲液 1032±76 836±179

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表27e    Asp232突变为Ala和Trp258突变为Ala的TSHR双突变对环AM在通过

hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 环AMP分析缓冲液 0.1 1371±89 387±51 28 0.3 2655±312 299±173 11 1 9988±2996 161^a 2 3 12979±2336 178±28 1 10 11756±1444 161^a 1 TSH(ng/mL) 0.01 904±85 400±81 44 0.03 1555±196 391±50 25 0.1 3714±1022 203±185 5 0.3 9529^a 238±127 2 1 11451±782 163±32 1 3 11743±761 158±25 1 Cyclic AMP assay buffer 739±94 293±155 实验2 环AMP分析缓冲液 0.1 1735±359 880±62 51 0.3 3378±590 664±153 20 1 8934±3094 529±132 6 3 8362±1905 746±144 9 10 18753±1985 683±84 4 TSH(ng/mL) 0.01 nd 888±52 nd 0.03 1726±322 950±68 55 0.1 nd 973±211 nd 0.3 17281±542 749±24 4 1 14866±2236 657±134 4 3 22039±4147 610±59 3 Cyclic AMP assay buffer 755±305 647±203

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表27f    Asp232突变为Ala和Arg255突变为Ala的TSHR双突变对环AM在通过

hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 环AMP分析缓冲液 0.1 2232±344 757±111 34 0.3 4812±202 825±97 17 1 12703±1110 610±38 5 3 20706±7441 545±221 3 10 25117±2140 721±280 3 TSH(ng/mL) 0.01 1850±307 1282±278 69 0.03 2715±486 1177±341 43 0.1 5609±757 1327±31 24 0.3 14284±1250 771±320 5 1 21333±2573 1822±280 9 3 26438±4181 1156±501 4 Cyclic AMP assay buffer 997±249 752±95 实验2 环AMP分析缓冲液 0.1 1305±30 389±81 30 0.3 3818±743 328±33 9 1 8506±1163 309±56 4 3 18696±553 ud nd 10 27645±1765 ud nd TSH(ng/mL) 0.01 1234±104 423±138 34 0.03 1621±145 439±201 27 0.1 5228±415 809±257 15 0.3 15209±2728 ud nd 1 20651±720 364±110 2 3 25628±256 422±47 2 Cyclic AMP assay buffer 1346±29 374±126

a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表27g Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala的TSHR双突变对环AMP

     在通过hMAb TSHR1和TSH对含有TSHR的CHO细胞中的刺激作

     用的影响

    生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3)  实验1    野生型TSHR    突变TSHR 突变/野生型  (％)  hMAb  TSHR1(ng/mL)  0.1    1718±13    622±49    36  0.3    5342^a    792±100    15  1    9732±1608    995±223    10  3    16827±1629    1335±174    8  10    20111±1948    3233±1444    16  TSH(ng/mL)  0.01    1436^a    1304±105    91  0.03    1640±168    2394±891    146  0.1    4569±866    5146±407    113  0.3    12178±887    10690±1722    88  1    18346±4068    13288±2771    72  3    21378±1576    19801±2390    93  环AMP分析缓  冲液    548±62    625±57    114

^a两个值的平均值

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

表27h    Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala的TSHR双突变对环AM在通过

hMAb TSHR1和TSH含有TSHR的CHO细胞中的刺激作用的影响

  生成的环AMP(fmol/cell well)    mean±SD(n＝3) 实验1 野生型TSHR 突变TSHR 突变/野生型(％) 环AMP分析缓冲液 0.1 2376±212 1130±235 48 0.3 1982±366 1117±168 56 1 5949±822 2012±289 34 3 11555±2562 3347±546 29 10 14591±3475 5184±558 35 TSH(ng/mL) 0.01 793±87 1096±221 138 0.03 1184±307 2202±916 186 0.1 1761±122 nd nd 0.3 6254±381 nd nd 1 10869±1184 17880±2456 165 3 14479±246 20189±2735 139 Cyclic AMP assay buffer 625±72 668±39 实验2 环AMP分析缓冲液 0.1 1133±113 890±75 79 0.3 3122±134 941±31 30 1 8972±700 1477±82 16 3 14236±940 2406±337 14 10 16292±1113 4418±1000 27 TSH(ng/mL) 0.01 814±147 873±43 107 0.03 885±142 1409±177 159 0.1 2754±435 2339±116 85 0.3 6713±647 4650±871 69 1 13019±1190 13522±1159 104 3 17402±768 20202±1233 116 Cyclic AMP assay buffer 550±16 846±65

hMAb TSHR1 Fab在所有的实验中使用

nd＝未确定

表28    突变(相对于野生型)对含有突变TSHR的CHO细胞刺激作用的影响

       的总结

氨基酸突变TSH刺激作用hMAb TSHR1 Fab刺激作用Glu157突变为Ala和Asp203突变为Ala明显减少有些减少Glu178突变为Ala和Asp203突变为Ala没有影响没有影响Asp232突变为Ala和Arg255突变为Ala明显减少明显减少Asp232突变为Arg和Arg255突变为Asp明显减少明显减少Asp232突变为Ala和Trp258突变为Ala明显减少明显减少Asp232突变为Ala，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala明显减少明显减少Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala没有影响明显减少Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala没有影响明显减少

表29 TSH、hMAb TSHR1 Fab和9D33 MAb结合到野生型(无突变)和

    突变TSH受体制剂的Scatchard分析

受体制剂TSH的亲和性 hMAb TSHR1 Fab的亲和性9D33 MAb的亲和性野生型6.0±0.9×10⁹L/mol 3.4±1.0×10¹⁰ L/mol1.8±0.7×10¹⁰L/molAsp232突变为Ala和Arg255突变为Ala不可测试的TSH结合 nt不可测试的9D33MAb的结合Asp232突变为Arg和Arg255突变为Asp不可测试的TSH结合 不可测试的 hMAb TSHR1 Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Asp232突变为Ala和Trp258突变为Ala不可测试的TSH结合 不可测试的 hMAb TSHR1 Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Asp232突变为Ala，Arg255突变为Ala和Trp258突变为Ala不可测试的TSH结合 不可测试的 hMAb TSHR1 Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Glu157突变为Ala和Asp203突变为Ala不可测试的TSH结合 1.5×10¹⁰L/mol0.6×10¹⁰L/molGlu178突变为Ala和Asp203突变为Ala不可测试的TSH结合 0.2×10¹⁰L/mol0.8×10¹⁰L/molTyr185突变为Ala和Lys183突变为Ala13.9×10⁹L/mol nt0.6×10¹⁰L/mol

表29续    TSH、hMAb TSHR1 Fab和9D33 MAb结合到野生型(无突变)

        和突变TSH受体制剂的Scatchard分析

受体制剂TSH的亲和性hMAb TSHR1Fab的亲和性9D33 MAb的亲和性Trp258突变为Ala和Lys183突变为Ala不可测试的TSH结合不可测试的hMAb TSHR1Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala不可测试的TSH结合0.2×10¹⁰L/mol0.9×10¹⁰L/molArg255突变为Ala和Lys183突变为Ala不可测试的TSH结合不可测试的hMAb TSHR1Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Arg255突变为Ala和Tyr185突变为Ala不可测试的TSH结合0.1×10¹⁰L/mol0.9×10¹⁰L/molArg255突变为Ala，Lys183突变为Ala和Tyr185突变为Ala不可测试的TSH结合不可测试的hMAb TSHR1Fab的结合0.3×10¹⁰L/molTrp258突变为Ala，Lys183突变为Ala和Tyr185突变为Ala不可测试的TSH结合不可测试的hMAb TSHR1Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合Arg255突变为Ala，Trp258突变为Ala和Tyr185突变为Ala不可测试的TSH结合0.1×10¹⁰L/mol0.8×10¹⁰L/molArg255突变为Ala，Trp258突变为Ala，Tyr185突变为Ala和Lys183突变为Ala不可测试的TSH结合不可测试的hMAb TSHR1Fab的结合不可测试的9D33MAb的结合

nt＝未测试