一株聚乙烯醇降解酶产生菌及用该菌株发酵法制备聚乙烯醇降解酶

摘要

一株聚乙烯醇降解酶产生菌及用该菌株发酵法制备聚乙烯醇降解酶，属于生物工程技术领域。本发明提供一株枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)WSH－062，保藏编号为CCTCC No：M206125，该菌株是从印染厂的车间污水中经平板滴加碘－硼酸产透明圈筛选得到，为一株聚乙烯醇降解酶的产生菌，经液体深层发酵可得到聚乙烯醇降解酶，酶活达到5.0U/mL。该聚乙烯醇降解酶可用于棉纺织物的退浆处理。

说明书

技术领域

一株聚乙烯醇降解酶产生菌及用该菌株发酵法制备聚乙烯醇降解酶，属于生物工程技术领域。

背景技术

纺织工业是许多发展中国家的一大工业，同时也是我国的传统产业和支柱产业。纺织业是产生污染非常严重的工业，尤其是在退浆印染加工过程中，传统工艺耗费大量的水和化学品，不仅耗费资源，同时还造成环境污染，破坏生态平衡。这对实施可持续发展战略是极为不利的。要从根本上改变纺织工业高消耗、高污染的传统粗放型经济增长方式，必须大力推动和发展纺织工业清洁生产技术，实现纺织工业污染防治由“末端治理”向“源头预防”的转变。

在退浆印染加工过程中，用高效生物催化剂参与的酶处理工艺替代传统的化学处理工艺，可以①显著降低水耗、能耗，废水量显著减少并且容易处理；②节省染料并获得更稳定的染色效果；③织物的柔软度更好、强度更高；④操作更加安全和简便；⑤由于生物催化剂用量少，在使用成本上也具有竞争力，因而成为纺织工业清洁生产技术的未来发展方向。

在纺织前处理过程中，经聚乙烯醇(PVA)上浆的棉织物必须经过退浆处理，以增加棉织物对水的吸收性，目前常用的退浆方法是使用70～90℃的热水在棉织物表面洗脱PVA，有时使用氧化剂NaBrO₂等，这就导致纺织厂排出的废水中含有大量的PVA和氧化剂。由于PVA是一种生物可降解性较低的高聚物(1 mg/LPVA＝1.76mg/L CODcr，BOD/COD＝0.07)，PVA废水的大量排放对环境产生严重的负面影响。并且，在此退浆过程中严格控制操作条件，否则棉纤维会因高温和氧化而遭损伤。

随着人们对纺织工业清洁生产的关注，对PVA的生物降解的研究日益得到人们的关注。到目前为止，已报道筛选出来的PVA降解菌数目不多。同时在国内外的文献中枯草芽胞杆菌产PVA降解酶尚无报道，而且其他降解菌产PVA降解酶的酶活很低，远没有达到工业化的要求。

发明内容

本发明的目的是提供一株能降解聚乙烯醇的枯草芽胞杆菌的筛选和用该菌株发酵法生产聚乙烯醇降解酶。

本发明的技术方案：从印染厂的污水中分离得到一株枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)WSH-062，其基因组序列号为DQ785743，菌种保藏编号为CCTCC No：M206125。

枯草芽胞杆菌WSH-062的筛选方法是由印染厂的污水经平板培养，滴加碘-硼酸产透明圈情况筛选，并比较对聚乙烯醇降解的酶活大小而得到。印染厂的污水经筛选培养基筛选培养，涂平板，培养后滴加碘(12.5g I₂溶于25gKI/L)-硼酸(25g/L)于大小均匀的菌落上，选择透明圈直径较大的菌落进行摇瓶发酵培养，通过比较对聚乙烯醇降解的酶活大小，最终确定菌株。

筛选培养基组成(g/L)：聚乙烯醇1，酵母粉0.1，NH₄NO₃ 1，K₂HPO₄ 2，KH₂PO₄ 0.25，MgSO₄·7H₂O 0.06，CaCl₂ 0.05，FeSO₄·7H₂O 0.02，NaCl 0.02，pH7.2。

一个标准酶活单位(U)定义为：在690nm处每分钟使吸光值下降1×10^-3所需的酶量为一个酶活单位。在30℃下，5mL粗酶液和5mL 10g/LPVA溶液(PVA溶于0.1mol/L、pH7.0的磷酸缓冲液)水浴振荡6h，用722可见分光光度计测定反应前后吸光值的变化。

用菌株CCTCC No：M206125发酵法制备聚乙烯醇降解酶的方法，是采用枯草芽胞杆菌CCTCC No：M206125为出发菌株，经种子培养和液体深层发酵制备聚乙烯醇降解酶。

种子培养基(g/L)：糊精25～30，蛋白胨2.0～2.3，酵母膏7.6～7.8，pH7.2；培养时间为12～16h，温度30℃，摇瓶转速200rpm。

发酵培养基(g/L)：聚乙烯醇30，酵母粉10.0～10.5，NaNO₃ 6.0～6.2，K₂HPO₄ 2，KH₂PO₄ 0.25，NaCl 0.02，pH7.2；发酵时间35～36h，温度30℃，摇瓶转速200rpm。

枯草芽胞杆菌CCTCC No：M206125发酵制备所得的聚乙烯醇降解酶酶活达到5.0U/mL，可用于棉纺织品的退浆处理。

本发明的有益效果：筛选得到了一株能降解聚乙烯醇的枯草芽胞杆菌，用该菌株经液体深层发酵可得到聚乙烯醇降解酶，酶活达到5.0U/mL，可用于棉纺织品的退浆工艺，可有效地改变现有的棉纺织品退浆工艺，改善环境和棉纺织产品品质。

生物材料样品保藏

一株聚乙烯醇降解酶产生菌枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)WSH-062，保藏日期2006年11月19日，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M206125。

具体实施方式

从斜面上刮取两环菌种，置于装有30mL种子培养基的250mL的三角瓶中进行种子培养。种子培养基为(g/L)：糊精25～30，蛋白胨2.0～2.3，酵母膏7.6～7.8，pH7.2；培养时间为12～16h，温度30℃，摇瓶转速200rpm。

再以6％的接种量接入装有30mL发酵培养基的250mL三角瓶中进行发酵培养。发酵培养基(g/L)：聚乙烯醇30，酵母粉10.0～10.5，NaNO₃ 6.0～6.2，K₂HPO₄ 2，KH₂PO₄ 0.25，NaCl 0.02，pH7.2。发酵时间35～36h，温度30℃，摇瓶转速200rpm。经10,000×5min离心弃沉淀可得到聚乙烯醇降解酶的粗酶液，其酶活5.0U/mL左右。