基于T细胞表位的抗日本血吸虫感染的肽－DNA双疫苗

摘要

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗日本血吸虫感染的T细胞表位蛋白与DNA混合疫苗。所说的抗日本血吸虫感染的肽－DNA双疫苗，是在带有表位肽编码基因的真核表达载体外包裹有含该表位肽的蛋白，所说的T细胞表位肽的氨基酸序列为AKQYNICCKFKELLD。该肽－DNA双疫苗可通过阳离子肽负载技术制得。本发明所说的抗日本血吸虫感染的肽－DNA双疫苗，注射入体内后能高效抵抗体内DNA酶的降解从而大大减少疫苗的用量；易于进入抗原递呈细胞并使抗原被高效递呈；有利于同时刺激细胞免疫与体液免疫应答。

说明书

技术领域

本发明属于免疫学领域，具体涉及一种抗日本血吸虫感染的蛋白与DNA混合疫苗。

背景技术：

近年来，我国血吸虫病疫情又出现回升势头，再次将依靠科技进步来巩固和提高血吸虫病防治效果的迫切需求提到议事日程上来。鉴于疫苗在许多传染病控制中无可比拟的作用，试图发展抗血吸虫病疫苗，获取化疗“短效”作用与疫苗接种诱导较“长效”的免疫预防作用相结合的双重效益来解决血吸虫病控制的期盼是近20-30年来世界各国有关科学家为之奋斗的目标，也是WHO/TDR自上世纪80年代以来在世界范围内协调血吸虫病疫苗研制努力的初衷。

随着基因工程技术的发展，血吸虫重组亚单位疫苗的研制工作大量开展，但迄今仍然主要针对曼氏血吸虫。1997年，TDR推荐了6个有希望的曼氏血吸虫病疫苗候选抗原分子(Bergquist NR.Mem Imst Oswaldo Cruz 1998，93Suppl；1：95-101)：谷胱甘肽转移酶(Sm28 GST)、MAP-4(来源于TPI的合成肽段)、62kDa肽段(IrV-5)、副肌球蛋白Sm97、MAP-3(来源于Sm23的合成肽段)和Sm14。其中以Sm28 GST为研究较多、较深入的疫苗候选抗原。而我国目前所研究的几个日本血吸虫疫苗抗原分子，多是借鉴曼氏血吸虫研究所取得的工作经验发展起来的。例如，已克隆到一系列曼氏血吸虫抗原的同系物，如日本血吸虫26kDa谷胱甘肽转移酶(Sj26GST)、TPI、肌球蛋白的62kDa肽段(Sj62)、23kDa、22.6kDa(Sj22.6)、32kDa抗原(Sj32)等，并已有一些分子在牛、猪、羊等大动物进行了保护性试验。然而，无论在曼氏还是日本血吸虫，这些采用单一抗原分子制备的疫苗在免疫/攻击感染实验中虽能诱导产生较高水平的抗体应答，却多不能稳定地获得高于40％的保护力，且多数分子所诱导的宿主保护力和免疫应答相关性也未阐明(McManus DP.Int JParasitol 2000，30：265-271)。也有人尝试将多个分子或其中的抗原表位共同使用以组成复合多价疫苗，保护性虽略有提高，但仍不能稳定地获得高于40％的保护力。究其原因可能在于：一、现行疫苗研制的策略是希望模拟血吸虫自然感染过程中宿主产生保护性免疫应答的机制，因而现在所采用的疫苗分子均为血吸虫自然感染过程中虫体优势表达的分子，其编码基因的获得途径，主要是用感染病人或动物血清从血吸虫基因文库中筛选得到，其免疫保护机制主要是诱导宿主的抗体应答。但是可能由于在宿主与血吸虫长期共进化过程中，血吸虫对宿主免疫系统的选择性压力已产生免疫适应性演化，故在自然感染状态下，这些分子不能诱导宿主产生有效的保护力；二、可能是现有的单一亚单位疫苗或组合在“鸡尾酒”疫苗内的亚单位或肽表位的选择与诱导所希望的保护性免疫应答并不匹配；三、迄今研制的疫苗制剂形式主要是重组蛋白疫苗和DNA疫苗，常规(皮下、肌肉、静脉)注射后，前者作为可溶性小分子蛋白，一般主要诱导抗体应答；而后者用量大，且主要引起较弱的细胞免疫应答。

因此，上述已克隆和表达的曼氏和/或日本血吸虫重组疫苗候选分子，包括WHO推荐深入研究的在内，皆未获得可期待的保护效果(＜40％)(P.S.Coulson，Adv.Parasitol.39(1997)271-336.)。然而，根据流行区现场的实验研究，至少要达到高于50％以上的保护力才能真正起到有效减低传播的作用(McManusDP.Int J Parasitol 2000，30：265-271)。因此，提高血吸虫病疫苗的免疫原性以诱导更高的保护力的目标应受到特别重视。

辐照致弱尾蚴模型是迄今最经得起时间考验的可产生高水平保护力的模型。在曼氏血吸虫，哺乳动物经接种γ射线辐照致弱尾蚴后可产生高水平的针对正常尾蚴攻击感染的保护力。在C57BL/6小鼠，经一次接种，保护力可达60％～70％，在非人灵长类动物，经3次接种，保护力＞50％。如果在予小鼠接种致弱尾蚴时，加用重组IL-12，平均保护水平几乎可达90％，其中有些甚至出现消除性免疫现象。在日本血吸虫，用紫外线(UV)致弱尾蚴接种FischerF344大鼠，1次接种，保护力可达77.5％，三次则提高到90％，且这种高保护力可持续40周之久；UV致弱日本血吸虫尾蚴接种在猪可诱导产生高达95％或92％的保护力，且在现场应用至水牛时，也成功地获得了高达89.1％的保护力。这一模型显示的高水平保护效果不仅彰显血吸虫疫苗开发是一个可期待的目标，而且为这一目标提供了具有导向意义的模板。关于辐照致弱尾蚴的效应机理，已经有的研究揭示了若干特征：(1)T辅助细胞(Th)在这一模型应答中起主要作用，进而证明INFγ是这一应答的关键因素，表明涉及的Th属Th1亚型；(2)IL-12(IFN-γinducer)在这一模型的INFγ产生中是关键的诱导因子，或说是决定启动免疫应答向Th1应答方向极化的必要条件；(3)用辐照致弱尾蚴多次免疫C57BL/6小鼠，可导致保护水平增高(从59％增至82％)，此时，抗体水平升高(IgG1和总IgE)，似乎增加的保护力是由抗体介导的。很可能一次免疫和多次免疫诱导了不同的Th亚型应答。一次免疫主要是Th1应答，而多次免疫除Th1应答外，还呈现Th2型应答(IL-4，IL-5和IgG1)，或者说是Th1/Th2混合应答。辐照致弱尾蚴模型提示了血吸虫特异性T辅助细胞(Th)应答在宿主抗血吸虫感染高保护力表达中的主要作用。

综上所述，辐照致弱尾蚴模型中诱导的高保护力是由多种免疫应答相互作用的复杂过程，因此在模仿这些免疫特征来组合疫苗构建时，不仅需要B细胞表位，更需要T细胞表位。但是，前述已有的血吸虫疫苗候选分子中具体的MHC高亲和力的T表位尚不清楚。

肽-DNA双疫苗(PDDV)，是指以带有抗原肽编码基因的质粒(DNA)为核心、在其外面包裹该抗原肽(蛋白质)，从而形成一种类似于病毒颗粒状、直径为10-15纳米的肽-DNA混合疫苗。现有研究表明可以借鉴阳离子肽负载技术构建蛋白质-核酸双疫苗(Hong-Li Liu，et al.ImmunologyLetters 89(2003)167-173)(Yu-Zhang Wu，et al.Journal of Virology 76(2002)10264-10269)，从而制成更易于诱导细胞免疫应答的PDDV这一剂型。但是，目前还没有利用T细胞表位构建抗日本血吸虫感染的肽-DNA双疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于T细胞表位的抗日本血吸虫感染肽-DNA双疫苗。

发明人用SYFPEITHI和TEPITOPE等多种软件对日本血吸虫22.6kDa表膜蛋白全长抗原(Sj22.6GeneBank号：DNA AF030404；蛋白质AAC67308)进行T细胞表位的预测及分析，再经同源性比对及酶切位点排除后选定分值最高的表位，其氨基酸序列为AKQYNICCKFKELLD，基于发明人经筛选得到的上述序列，提出了本发明的技术方案：

所说的抗日本血吸虫感染的肽-DNA双疫苗，是在带有表位肽编码基因的真核表达载体外包裹有含该表位肽的蛋白，所说的表位肽的氨基酸序列为AKQYNICCKFKELLD。

常规的真核表达载体都能用于本发明，但为了达到较好的效果，推荐使用带有单核、巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)的真核表达质粒，优选pUMVC1-mGM-CS。

本发明还提供了所说抗日本血吸虫感染的肽-DNA双疫苗的制备方法：

1)在序列为AKQYNICCKFKELLD表位肽的氨基端加上18个赖氨酸，得到合成肽KKKKKKKKKKKKKKKKKKAKQYNICCKFKELLD，从而使整个合成肽带上正电荷；

2)将表位肽AKQYNICCKFKELLD编码DNA序列插入真核表达载体，构建重组质粒；

3)将上述得到的合成肽和重组质粒，利用阳离子肽负载方法，以重组质粒为核心，在其外包裹合成肽，构建成蛋白质-核酸双疫苗。

上述步骤2)具体可以是：将表位肽AKQYNICCKFKELLD编码DNA序列的5’端加Sal I酶切位点，在3’端加EcoR I酶切位点，插入质粒pUMVC1-mGM-CSF中，制备质粒。

本发明的基于T细胞表位的PDDV疫苗可通过以下途径来提高抗日本血吸虫感染的保护力：

(1)通过T细胞表位的选取和特殊剂型(PDDV)的应用来诱导宿主产生以细胞免疫应答为主的全面的抗血吸虫免疫应答，从而来提高疫苗的保护力；

(2)筛选获取具有较强免疫刺激能力的T细胞表位，减少了使用全长肽段可能带来的交叉反应等不良作用：

(3)PDDV为直径为10-15纳米的颗粒抗原，能高效进入抗原递呈细胞，高效诱导宿主产生以细胞免疫应答为主的全面的抗血吸虫免疫应答。

(4)PDDV类似病毒的结构(外表是蛋白质，内为核酸)使其能够有效抵抗体内DNA酶的消化，因此，与传统蛋白疫苗或DNA疫苗相比，PDDV用量可减少一个数量级(近10倍)。

在本发明较好的技术方案中，PDDV的骨架为含有GM-CSF的质粒，可作为分子内佐剂刺激宿主抗原递呈细胞(主要是DC)的增殖、成熟，从而有利于整体免疫应答的增强。

附图说明

图1是PDDV疫苗的构建过程示意图

图2是ELISA法检测血清中抗体水平示意图

图3是ELISA法检测细胞培养上清中IL-4细胞因子水平示意图

图4是ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ细胞因子水平示意图

图5是细胞增殖试验结果示意图

图6是血吸虫感染引起的肝脏虫卵肉芽肿病理改变示意图。

具体实施方式：

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

本发明实施例中所提及的表达载体pUMVC1-mGM-CSF可从aldevron公司购买(货号为4014)。

实施例一：PDDV制备

用SYFPEITHI和TEPITOPE等多种软件对日本血吸虫22.6kDa表膜蛋白全长抗原进行T细胞表位的预测及分析，再经同源性比对及酶切位点排除后选定分值最高的表位，其氨基酸序列为AKQYNICCKFKELLD(Ala Lys Gln Tyr Asn Ile Cys Cys Lys Phe Lys Glu Leu Leu Asp)。

构建过程如图1所示，

1)从Invitrogen公司订购上述序列的肽段并在合成时在其氨基端加上18个赖氨酸KKKKKKKKKKKKKKKKKKAKQYNICCKFKELLD(纯度≥99％)，从而使整个合成肽带上正电荷，将其命名为P5。另外，为设置对照组，我们同时订购了一段仅含有18个赖氨酸KKKKKKKKKKKKKKKKKK的肽段(纯度≥99％)，将其命名为18K。

2)将表位肽AKQYNICCKFKELLD编码DNA序列的5’端加Sal I酶切位点，在3’端加EcoR I酶切位点(tcgacatg atcactgaacttgaagatgttgcagagagagaacgattaaaagcgg)，插入质粒pUMVC1-mGM-CSF中，以Qiagen中量质粒抽提试剂盒制备质粒，我们将此重组质粒命名为pGT。

3)按下列方法计算核酸及肽的用量，制备两种PDDV疫苗用于后续的小鼠免疫/攻击感染实验：一种是P5和pGT制备的PDDV，我们将其命名为T5-PDDV；另一种是18K和空DNA质粒制备的PDDV，我们将其命名为18K-PDDV，用于对照。具体细节如下：

制作PDDV的核酸的浓度可以为50～100ng/μL，总量根据最终疫苗的需要量而定。肽的用量根据下述公式计算：M_p＝K·r·M_d，，其中K为常数，r为肽所带阳离子电荷与核酸所带阴离子电荷的比值，通过DNA阻滞实验、DNase消化实验及电镜观察确定，采用此r时阳离子与质粒DNA能够最佳结合且形成20nm左右大小的颗粒；M_d为所用核酸的量(公式的推导及K值的计算参见赵建平硕士论文《“模拟病毒”的分子设计及其在体诱发特异性CTL应答的研究》，2001年5月)。

A.K值的计算

1μg质粒DNA分子的负电荷数目：

(1μg÷330g/mol)×6.023×10²³个/mol×1e^-/个＝1.83×10¹⁵e^-

1μg阳离子肽所带正电荷数目(表位肽的分子量为3907.12)：

(1μg÷3907.12g/mol)×6.023×10²³个/mol×18e⁺/个＝2.77×10¹⁵e⁺

每中和1μg质粒DNA所带负电荷所需的阳离子肽的量用K表示，则

K＝1.83×10¹⁵e-÷2.77×10¹⁵e⁺＝0.66

B.如制备疫苗所需核酸量为100μg，即M_d为100μg，r值通过DNA阻滞实验、DNase消化实验及电镜观察确定为4，则

M_p＝K·r·M_d＝0.66×4×100＝264μg即当阴阳离子电荷比值为4时，用100μg质粒DNA制备PDDV需要阳离子肽为264μg

C.核酸及阳离子肽HEPES buffered saline(HBS)溶液的配制溶液中NaCl终浓度为150mM时，阳离子与质粒DNA能够最佳结合且形成10-15nm左右大小的颗粒。用HEPES调节溶液PH值为7.35～7.45。

D.仍以上述计算结果为例详述核酸及阳离子肽HBS溶液的配制，先配制终浓度为150mM的NaCl溶液、终浓度为40mM的HEPES溶液，若制备PDDV溶液的终体积确定为800μL(此量由免疫动物时所采用溶剂的体积决定)，则分别制备核酸及阳离子肽的HBS溶液各400μL

核酸HBS溶液的配制

质粒DNA(10μg/μL)            10μL

5M NaCl                       24μL

1M HEPES                      32μL

ddH₂O                         334μL

阳离子肽HBS溶液的配制

阳离子肽(20μg/μL)           13.2μL

5M NaCl                       24μL

1M HEPES                      32μL

ddH₂O                         330.8μL

E.制备PDDV：将阳离子肽的HBS溶液以5μL/次的量逐滴加入至核酸的HBS溶液中，每5分钟加一次。整个加样过程中保持核酸或者制备的溶液在Thermomixer(Eppendorf，德国)上以1400/rpm的速度涡旋，温度设置25℃。加样完成后，样品继续涡旋30min或者1h.

实施例二：以实施例一制得的PDDV疫苗进行免疫/攻击感染实验

清洁级C57BL/6小鼠：购自南京大学国家小鼠遗传资源庆贺中心，8周龄，雌性。

第一次实验：

A)将小鼠随机分为三组，每组14只，分别命名为T5-PDDV组、18K-PDDV组和对照组。

B)每周免疫一次，每次在小鼠背部皮下分别注射100μl的T5-PDDV溶液(含28μg P5肽段和5μg重组真核表达质粒DNA)、18K-PDDV溶液(含28μg 18K肽段和5μg空真核表达质粒DNA)或PBS溶液。

C)PDDV疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答检测：①免疫前和末次免疫2周后采小鼠尾静脉血样，用于ELISA检测免疫前后血清抗体的含量；②末次免疫2周后，每组杀7只小鼠，取小鼠脾脏和淋巴结制备脾和淋巴结的单个细胞悬液，1×10⁶个/mL铺于细胞培养板，在不同的抗原刺激P5(10ug/ml)，18K(10ug/ml)，或无抗原刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养48h，收集培养上清用于检测细胞因子；③末次免疫2周后，每组杀7只小鼠，取小鼠脾脏和淋巴结细胞制备脾和淋巴结的单个细胞悬液，2×10⁵个/mL铺于细胞培养板，在不同的抗原刺激P5(10ug/ml)，18K(10ug/ml)，或无抗原刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养48h，以³H掺入法检测抗原肽对脾和淋巴细胞的刺激增殖作用。

D)PDDV疫苗的保护力(减虫率与减卵率)检测：末次免疫2周后，剩余每组7只小鼠，每鼠以40条日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤感染。感染后6周，剖杀、灌注以收集成虫进行减虫率计算，并镜检小鼠肝脏内的虫卵进行减卵率计算。

第二、三次实验均采用如下方案：

A)将小鼠随机分为三组，每组14只，分别命名为T5-PDDV组、18K-PDDV组和对照组。

B)隔周免疫一次，每次在小鼠背部皮下分别注射100μl的T5-PDDV溶液(含28μg P5肽段和5μg重组真核表达质粒DNA)、18K-PDDV溶液(含28μg 18K肽段和5μg空真核表达质粒DNA)或PBS溶液。

C)PDDV疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答检测：①免疫前和末次免疫2周后采小鼠尾静脉血样，用于ELISA检测免疫前后血清抗体的含量；②末次免疫2周后，每组杀7只小鼠，取小鼠脾脏和淋巴结制备脾和淋巴结的单个细胞悬液，1×10⁶个/mL铺于细胞培养板，在不同的抗原刺激P5(10ug/ml)，18K(10ug/ml)，或无抗原刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养48h，收集培养上清用于检测细胞因子；③末次免疫2周后，每组杀7只小鼠，取小鼠脾脏和淋巴结细胞制备脾和淋巴结的单个细胞悬液，2×10⁵个/mL铺于细胞培养板，在不同的抗原刺激P5(10ug/ml)，18K(10ug/ml)，或无抗原刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养48h，以³H掺入法检测抗原肽对脾和淋巴细胞的刺激增殖作用。

D)PDDV疫苗的保护力(减虫率与减卵率)检测：末次免疫2周后，剩余每组7只小鼠，每鼠以40条日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤感染。感染后6周，剖杀、灌注以收集成虫进行减虫率计算，并镜检小鼠肝脏内的虫卵进行减卵率计算。

PDDV疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答检测实验：

1)ELISA法检测血清中抗体的水平：

A.包被：用100ul包被缓冲液及包被抗原SWAP 20μg/孔包被96孔板。4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用PBS-T洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

B.加样：加1∶50稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

C.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的IgG、IgG1或IgG2a酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

D.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃ 10～30分钟。

E.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

F.结果判定：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。结果如图2所示，T5-PDDV免疫小鼠后成功地诱导出了血吸虫抗原特异的IgG抗体(图2A)和IgG1、IgG2a抗体(图2B)

2)ELISA法检测细胞培养上清中IL-4和IFN-γ细胞因子的水平：参照细胞因子检测试剂盒说明书，用相应细胞因子抗体包板，其余方法完全同上述步骤1)。IL-4和IFN-γ检测试剂盒采用购自eBiosciense公司的Read-set-go试剂盒(货号分别为IL-4 88-7044-77，IFN-γ88-7314-77)

结果如图3、图4所示，T5-PDDV免疫小鼠后成功地诱导了IFN-γ(图3)和IL-4(图4)细胞因子的产生。

3)细胞增殖试验：将2)中的细胞调整细胞浓度为2×10⁵个/mL铺于细胞培养板，在不同的抗原刺激T5(10ug/ml)，18K(10ug/ml)，或无抗原刺激，37℃，5％CO₂孵箱培养3d.。细胞收获前16～18h加入³H-TdR，0.5uCi/孔。Beckman液闪仪测定cpm值，结果如图5所示，T5-PDDV免疫小鼠后能刺激脾和淋巴结细胞的增殖。

以上实验说明T5-PDDV的免疫可诱导小鼠的细胞免疫应答。

PDDV疫苗在小鼠体内诱导的免疫保护力观察实验：

1)末次免疫二周后，剩余每组8只小鼠，每鼠以40条日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤感染。感染后6周，剖杀、灌注，收集成虫及小鼠肝脏。

2)计数成虫数量，计算减虫率：减虫率＝(对照组平均检获成虫数-实验组平均检获成虫数)/对照组平均检获成虫数×100％。结果见表1.

3)取肝脏左、中、右叶部分，制作病理切片，HE染色，显微镜下观察虫卵肉芽肿的大小和数量。结果如图6所示，T5-PDDV免疫小鼠后，血吸虫感染引起的肝脏虫卵肉芽肿数量比对照组要少，面积比对照组要小。

4)将剩余肝脏用5％氢氧化钾37℃消化过夜，显微镜下计数虫卵数量，计算减卵率＝(对照组虫卵数量-实验组虫卵数量)/对照组虫卵数量×100％。

结果如表1所示在三次实验中，与对照组相比，T5-PDDV在小鼠体内应用后，分别使小鼠体内的成虫减少了39.3％、47.7％和33.8％，并使虫卵减少了55.8％、34.3％和33.3％，从而表明T5-PDDV可以诱导一定程度的抗血吸虫感染的保护力。

表1.PDDV在小鼠体内诱导的保护力(减虫率与减卵率)

Group 平均每鼠虫荷 (x±SE) 减虫率(％)  平均每鼠肝内虫  卵数(x±SE)  减卵率(％)T5-PDDVExp1 14.5±8.4 39.3^**  38000±2406  55.8^**Exp2 18.1±6.0 47.7^**  95750±3471  34.3^**Exp3 20.8±5.1 33.8^**  98000±3998  33.3^**18K-PDDVExp1 23.3±6.4 2.4  80333±2444  6.6Exp2 28.1±4.6 18.9  127250±5317  12.7Exp3 26.2±9.5 16.5  120000±3170  18.4ControlExp1 23.9±6.3 0  86000±2347  0Exp2 34.7±5.2 0  145750±3688  0Exp3 31.4±9.1 0  147142±3552  0

本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。