法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-10-09
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12N15/11 授权公告日:20081112 终止日期:20171012 申请日:20061012
专利权的终止
2008-11-12
授权
授权
2007-08-22
实质审查的生效
实质审查的生效
2007-06-27
公开
公开
技术领域
本发明涉及核酸技术领域,具体地说涉及抑制人类乳头瘤病毒11型复制和蛋白表达的siRNA分子及其应用。
背景技术
尖锐湿疣是一种危害我国人民健康和家庭幸福的性传播疾病,由人类乳头瘤病毒(HPV)引起。HPV不仅可引起皮肤粘膜上皮的疣状增生,还与多种鳞状细胞癌的发生发展有关,亚洲地区尖锐湿疣的病原体主要为HPV6b和11型。目前临床治疗尖锐湿疣主要通过物理性治疗结合上调皮损局部或机体全身非特异性的抗病毒免疫,但由于缺乏直接的特异的抗HPV的药物,物理治疗的彻底性不佳以及免疫增强剂针对人类乳头瘤病毒的特异性差等原因,尖锐湿疣的复发率始终保持在50%-70%。
发明内容
本发明的目的是提供有效抑制人类乳头瘤病毒11型E7基因表达,从而抑制蛋白表达和病毒复制的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7),基因序列为:SEQ ID NO.1正义链5’-ACAAGACGCACAACCUUUATT-3’,SEQ ID NO.2反义链5’-UAAAGGUUGUG CGUCUUGUTT-3’。
所要解决的技术问题是有效抑制人类乳头瘤病毒11型复制和蛋白表达的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7)的设计合成和发夹状小干扰RNA表达载体构建。为此本发明采用以下技术方案:siRNA为双链RNA分子,正义链和反义链的长度均为21个核苷酸,它们各自的3’端为两个连续的脱氧胸苷酸(TT),两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补形成双链;正义链自5’端开始的19个核苷酸序列和HPV11E7核苷酸序列中连续两个碱基为腺嘌呤(A)的核苷酸之后的19个核苷酸序列完全一致,每条链中碱基为鸟嘌呤(G)的核苷酸数量和碱基为胞嘧啶(C)的核苷酸数量之和占除去3’端的TT以外的19个核苷酸数量的比例(即G/C比例)为42.1%,介于25%和75%之间;核苷酸序列及其一个核苷酸的突变体和已知人类基因无同源性。“无同源性”在此是指核苷酸序列反义链和其任意一个位置的核苷酸突变体和已知人类基因和基因表达片段无100%相同。
上述小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7)为人工合成,正义链和反义链各自的3’末端有两个脱氧胸苷酸(TT),其它19个核苷酸的碱基可以是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)或尿嘧啶(U);两条链除去3’端的TT以外的19个核苷酸上的碱基互补(A和U,C和G)形成双链,它们3’端的两个TT以单链的形式存在。
人类乳头瘤病毒属乳多空病毒科的A属成员,为一种闭环状的双链DNA病毒,目前报道已鉴定的人类乳头瘤病毒已达130种亚型。HPV直径45-55nm,无被膜,衣壳呈对称二十面体,含有72个壳微粒。其基因组由7200-8000bp左右的核苷酸组成,分子量为5.2×10kDa。人类乳头瘤病毒编码9个开放阅读框架,分为以下3个功能区基因:
E区(早期转录区)长4500bp,按功能可分为E1-E7开放阅读框架,主要编码与病毒复制、转录、翻译、调控和细胞转化有关的蛋白。据HPV基因序列分析表明,癌基因E6/E7进入体内后表达非结构早期蛋白E6/E7,后者可影响细胞周期的调控等,被认为在细胞恶性转化及在肿瘤形成中起了重要作用。E7蛋白是其重要的转化蛋白之一,可以与许多细胞蛋白(如pRb,p107,p130,cyclin A、E等)结合,永生化人类原代角质形成细胞,转化啮齿类细胞系,参与细胞周期的调节,并与细胞凋亡的敏感性有关。最近的研究表明它也可能参与了中心体的复制。
L区(晚期转录区)长2500bp,分为L1和L2,分别编码主要衣壳蛋白和次要衣壳蛋白,后两者组成了病毒自身结构蛋白且与病毒的增殖有关。
LCR区(长效调控区),又称URR(上游调节区),NCR(非编码区)是E8区与L1区间长为1000bp的DNA片段,可负责病毒转录和复制的调控,含有内含子,增强子序列,为变异性较大的一个区段。
迄今为止,由于人乳头瘤病毒具有高度的种属特异性,严格的嗜上皮性,不能在常规培养系统中繁殖等特点,HPV在体外难以培养,目前尚无成功建立的病毒株或动物感染模型。本课题组将HPV11型E7基因克隆至pcDNA3.1(+)质粒并经转染筛选得出稳定表达11E7基因的细胞株用于以下实验。
本发明提供的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7)能够在细胞内通过形成RNA介导的沉默复合体(RISC RNA-induced silencing complex)有效地降解人类乳头瘤病毒11E7mRNA分子,从而阻断病毒致病基因的复制、扩增,进而抑制与致病密切相关的E7蛋白的合成,利于机体清除被HPV 11型感染的细胞并恢复正常的生理机制,为治疗尖锐湿疣以及其它HPV感染相关性疾病开辟了新的有效的手段。
本发明所提供的有效抑制人类乳头瘤病毒致病基因复制和蛋白表达的小干扰RNA分子还包括针对以上所提到的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7)的序列的任何部份或全部经化学修饰后所形成的的小干扰RNA分子。
本发明所提供的有效抑制人类乳头瘤病毒复制和蛋白表达的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7siRNA)可以应用于制备预防或治疗尖锐湿疣以及与人类乳头瘤病毒感染相关的任何疾病的药物或制剂中的应用。
本发明首次利用siRNA技术对低危型人类乳头瘤病毒E7基因表达进行干预,以期达到抑制病毒复制及清除病毒感染的目的,为基因治疗人类乳头瘤病毒感染相关性疾病提供研究基础。
附图说明
图1是siRNA-HPVII E7对人类乳头瘤病毒HPVII E7基因mRNA表达抑制的时效性。
图2是不同浓度的siRNA-HPVII E7对HPV11E7基因表达的抑制。
图3是siRNA-HPVII E7不同干预途径下对小鼠体内HPVII E7基因表达的抑制作用。
具体实施方式
本发明结合实施例和附图,作进一步的说明。
实施例1 siRNA的合成
siRNA的合成委托公开对外开展合成业务的商业公司:上海生工生物工程技术服务有限公司。RNA分子经过2位上脱保护、脱盐、纯化、和退火形成双链处理,然后溶于DEPC处理的蒸馏水中。所采用的合成方法均为通用的方法,比如以下文献公开的方法:Scaringe SA,Wincott FE,and Caruthers MH.Novel RNA Synthesis Method Using 5′-Silyl-2′-Orthoester Protecting Groups.JAm Chem Soc 1998;120:11820-11821.
本发明提供的小干扰RNA分子(siRNA-HPV11E7)的制备方法也可采用现有的固相化学合成法。该方法可参见:Wincott F,DiRenzo A,Shaffer C,GrimmS,Tracz D,Workman C,Sweedler D,Gonzalez C,Scaringe S and Usman N.Synthesis,deprotection,analysis and purification of RNA and ribozymes.NucleicAcids Res.1995,23:2677-84。
整个化学合成可大致分成四个的过程(1)寡聚核糖核酸的合成;(2)脱保护;(3)纯化分离;(4)脱盐退火无菌消毒。
经过纯化后的siRNA的纯度和鉴定有两种比较常用的办法。其一用毛细管凝胶电泳法来鉴定siRNA的纯度,该方法可参见Paulus A,Ohms JI.Analysis ofoligonucleotides by capillary gelelectrophoresis.J Chromatogr 1990,507:113-123。其二是用MALDI-TOF质谱来准确测量其分子量,从而确定siRNA的化学结构组成。
本发明所述siRNA-HPV11E7可根据siRNA分子的基因序列采用上述方法制备及鉴定。
实施例2 siRNA的转染
1、HPV11E7阳性细胞株的建立
将重组质粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV11E7用Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Lipofectamine2000试剂盒转入B16细胞后,以G418(浓度为1000ug/ml)筛选出阳性细胞克隆,在荧光显微镜下观察绿色荧光表达和Real-time PCR反应检测mRNA水平。每次均设未经逆转录的RNA为模板的PCR反应为阴性对照组,以排除实验过程中DNA污染而得到假阳性的可能,保证检测结果确为mRNA水平的转录。从诸多克隆中筛选出稳定高表达HPV11E7mRNA的细胞株,其体外培养用含10%小牛血清的RPMI 1640培养基,并且始终用G418抗性筛选来维持其稳定表达HPV11E7基因。
2、siRNA的转染:siRNA转入人乳头瘤病毒11E7阳性细胞株借助于Invitrogen(www.invitrogen.com)公司的Oligofectamine来进行,具体步骤按照说明书来进行。简述如下,5×104的细胞接种于24孔培养板24h后进行转染,将siRNA按作用终浓度25nM及50nM以无血清1640培养基稀释成总体积102μl的溶液。混匀上述试剂共120μl,室温静置20-25分钟,复合物形成后滴于覆有480μl无血清1640培养基的细胞株上。置37℃,5%CO2孵箱孵育6h后加含30%小牛血清的1640培养基400μl继续孵育。
3、细胞内人类乳头瘤病毒11E7mRNA水平的检测:人类乳头瘤病毒11E7mRNA量用实时荧光定量PCR的技术来测定。具体方法简述如下:用Invitrogen公司(www.invitrogen.com)生产的TRizol提取HPV11E7阳性细胞的总RNA,然后将其浓度均调整到0.2μg/μl。人类乳头瘤病毒11E7mRNA和内参照基因GAPDH mRNA的表达量用博日(BIOER)公司制造的Line-Gene定量PCR测定仪来检测。PCR所用的11E7引物的序列分别是5’-CAGCAACGTCCGACTGGTT-3’,5’-GCCCAGCAAAAGGTCTTGTAGT-3’,探针序列为5’-TGGAGTCACAGACGGAGACATCAGA-3’;GAPDH引物的序列分别是5’-CTTAGCACCCCTGGCCAAG-3’,5’-GATGTTCTGGAGCCCCG-3’,荧光探针序列为5’-CATGCCATCACTGCCACCCAGAAGA-3’。PCR的具体操作步骤均按照博日(BIOER)公司的说明书来进行。
实施例3 siRNA对人类乳头瘤病毒11E7基因表达的抑制作用
1.人类乳头瘤病毒11E7阳性细胞模型的选择:本实施例采用建立的人类乳头瘤病毒11E7阳性细胞株为标准细胞模型,该细胞株由含人类乳头瘤病毒11E7基因的重组质粒DNA转染B16后经鉴定筛选形成。人乳头瘤病毒11E7基因可在此细胞株内长期稳定复制并产生靶蛋白。
2.siRNA的选择:针对靶基因不同区域,序列不同的siRNA分子的抑制作用也不尽相同,为了最大程度地阻断致病基因的表达,本发明按照siRNA设计原则选择了一对最佳siRNA分子来干扰靶基因的复制。
3.siRNA-HPV11E7对人乳头瘤病毒11E7基因表达的抑制作用:
A、浓度为25nmol/L的siRNA对病毒靶mRNA作用的时效性:
用25nmol/L的siRNA作用于人乳头瘤病毒11E7阳性细胞株6h、12h、24h、48h、72h、96h、120h后,细胞内人乳头瘤病毒11E7 mRNA分别被抑制了12.6%、31.415%、41.93%、42.93%、74.35%、39.41%、22.20%,其中siRNA作用72h后对病毒靶基因水平的抑制最为有效,参见图1,图1为25nmol/L siRNA作用于HPV11E7阳性细胞株不同时间后对其细胞内HPV11E7 mRNA水平的影响,对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理,纵坐标表示对照组和siRNA处理组的HPV11E7 mRNA水平的相对值,图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
B、siRNA-HPV11E7对病毒靶mRNA作用的剂量效应:
用作用终浓度为100nmol/L、50nmol/L、25nmol/L、12.5nmol/L、6.25nmol/L、3.13nmol/L、1.56nmol/L、0.78nmol/L的siRNA分子作用于人乳头瘤病毒11E7阳性细胞株72h后发现,对HPV11E7mRNA的抑制率分别达67.00%、62.06%、70.06%、53.7%、55.60%、47.00%、9.00%、0,参见图2,图2为不同浓度的siRNA-HPV11E7作用于HPV11E7阳性细胞株72小时后对其细胞内HPV11E7 mRNA水平的影响,对照组是指细胞在等同条件下用转染试剂作处理,纵坐标表示siRNA处理后细胞内HPV11E7 mRNA表达被抑制了的比率,图中的每一个数据表示三个重复实验的平均值。
siRNA分子对HPV11E7 mRNA的抑制作用在一定范围内和它的作用终浓度呈正相关,而且在极微量浓度(3.13nmol/L水平)仍能达到明显抑制作用。
C、siRNA-HPV11E7在体内对病毒靶mRNA的作用:
瘤内注射100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L以及尾静脉注射400nmol/L的siRNA-HPV11E7(含与siRNA分子等比例的脂质体Oligofectamine)各100μl,每3天注射一次,各注射3次后分析其对小鼠体内靶基因mRNA表达的干预作用。瘤内注射100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L以及尾静脉注射400nmol/L的siRNA-HPV11E7后小鼠体内HPV11E7mRNA表达分别被抑制了14.38%、37.92%、54.86%、23.54%,参见图3,图3为将HPV11E7阳性细胞株注射到C57BL/6雌性小鼠背部皮下荷瘤后,瘤内注射100nmol/L,200nmol/L,400nmol/L以及尾静脉注射400nmol/L的siRNA-HPV11E7各100ul,每3天注射一次,各注射3次后分析其对小鼠体内靶基因mRNA表达的干预作用,对照组是指荷瘤小鼠在等同条件下用转染试剂作处理,纵坐标表示siRNA处理后小鼠体内HPV11E7mRNA浓度相对于对照组的比率。图中的每一个数据表示每个干预组5个样本两次重复实验的平均值。
结果显示瘤内注射siRNA-HPV11E7对靶基因干预作用亦具有一定的量效性,且siRNA-HPV11E7以不同途径进入体内的作用效果有区别,瘤内注射组明显优于尾静脉注射组。
实施例4 siRNA的修饰
小干扰RNA分子的化学修饰包括主要包括以下三类:第一、对连接相邻两个核苷酸的磷酸二酯键的部份修饰或用其它任何化学键取代。典型的磷酸二酯键的部份修饰是将磷酸双键上的氧置换成硫(硫化)或其它元素,或将磷酸单键上的氧变成氮(氮化)或其它元素和化学基团;对磷酸二酯键本身的全部取代,也包括对其本身或其部份以及和它相连的两个核糖的部份或全部改变,典型的例证是将磷酸二酯键和两个相邻的核糖变成肽键,使得核酸变成肽核酸(peptide nucleic acid,PNA);第二、对核苷中核糖的五元环进行改变或其侧链上的化学基团作修饰。改变核糖环的典型例证如将五元的核糖环变成六环的Morpholino环;对核糖侧链上的修饰主要是指将核糖2’位上OH变成其它元素(如卤素元素),或用其它化学基团替代OH中的H(例如烷基)。第三、将核苷酸上的碱基环作整体的改变或侧链的修饰。每一类中有许多变化,因此它们各自的合成方法不尽一样。这里列举两种最为常见的siRNA修饰方法。并且,下述的方法并不限制本发明所述的有关对siRNA修饰的保护范围。
1、硫化
硫化是指将核苷磷酸二酯键上的一个氧原子转变成硫原子形成核苷硫代磷酸二酯。由于整个siRNA的其它组成结构没有变化,因此它的合成和实施例2的SiRNA合成过程基本一样。只需将合成过程中的氧化反应变成硫化反应,在此反应中加入适当的硫化试剂,例如3H-1,2-benzodithiol-3-one 1,1-dioxide(又称Beaucage试剂)。
2、核苷2’位羟基的修饰
核苷2’位羟基的修饰是指用各种饱和烷氧基或不饱和烷氧来取代核苷五员糖环上的2’位羟基,其中最常见的是用甲氧基来取代核苷2’位的羟基。siRNA的核苷2’位甲氧基化的合成和实施例2的siRNA的合成步骤基本一致,只需要在偶合反应中用2’-甲氧基核苷亚磷酰胺来取代2’-叔丁基二甲基硅氧基核苷亚磷酰胺即可。
无需进一步详细阐述,相信采用前面所公开的内容,本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此,前面的实施方案应理解为仅是举例说明,而非以任何方式限制本发明的范围。
机译: 利用DSG3分子预测癌症的恶性程度作为分子靶标并利用RNA干扰序列抑制DSG3表达的临床应用方法在头颈癌中的应用
机译: 利用DSG3分子预测癌症的恶性程度作为分子靶标并利用RNA干扰序列抑制DSG3表达的临床应用方法在头颈癌中的应用
机译: 利用DSG3分子预测癌症的恶性程度作为分子靶标并利用RNA干扰序列抑制DSG3表达的临床应用方法在头颈癌中的应用