一种灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油含量的检测方法

摘要

本发明公开了一种灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油含量的检测方法。本发明的测定方法是通过灵芝孢子油制剂中总灵芝酸、灵芝酸E含量测定实现；其中其检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂(相当于生药灵芝孢子5g)中含总灵芝酸以灵芝酸E(C30H54O7)计，不得少于1.0mg，灵芝酸E的含量为0.001mg～0.050mg之间，即灵芝酸E的含量在0.010％～0.50％之间；本发明测定方法使灵芝孢子油制剂质量的检测稳定、可控。

说明书

技术领域

本发明涉及药品检测方法领域，特别是涉及一种灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油含量的检测方法。

背景技术

灵芝孢子(Ganoderma lucidiumspore)是灵芝生长成熟期从菌盖弹射出来极其细小的孢子，为灵芝的生殖细胞，具有灵芝的全部遗传活性物质。灵芝孢子的药理作用主要有抗肿瘤、免疫调节、调节血脂以及对神经、心血管和呼吸系统有调节改善作用。灵芝孢子油为灵芝孢子通过破壁后采用超临界萃取或有机溶剂提取等方法获得的油质状提取物。灵芝孢子油的化学成分复杂，主要含油脂类、脂肪酸类、  甾醇类和三萜类等成分。现代药理研究表明灵芝孢子油是灵芝孢子抗肿瘤、免疫调节、调节血脂的的主力。而三萜类成分特别是灵芝酸类成分为灵芝、灵芝孢子中活性最强的成分。

现有的检测灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油含量的方法是采用可见分光光度法检测药物中总三萜(以熊果酸计)的含量，其标准为总三萜含量15～24.9％以上。因该方法在总三萜化合物的测定过程中，采用了熊果酸作为对照品，但在灵芝、灵芝孢子粉、灵芝孢子油的三萜成分的研究结果中，未发现有熊果酸存在，在测定过程中应采用其三萜中的代表成分作为对照品更为妥当；而且该方法在总三萜化合物的测定过程中，采用了以高氯酸氧化显色、用可见分光光度法比色测定，在测定过程中，随着显色的时间、显色的温度、测定的时间等不同而测定结果的差异较大，测定结果的重现性差，测定结果不稳定；又因该方法在总三萜化合物的测定过程中，没有对总三萜进行分离，直接采用了灵芝孢子油以高氯酸氧化显色，而灵芝孢子油中存在的大量的长链脂肪烃类成分亦能被高氯酸氧化显色，从而使测定出现假阳性结果，应用该方法测定其它食用植物油也能测出较高含量，无法与药物中灵芝孢子油三萜成分的含量形成一一对应的关系，因此，以灵芝孢子油直接用高氯酸氧化显色，来检测灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油三萜成分的含量容易受到灵芝孢子油其它成分的干扰，不利于在生产中控制和监测药品的质量。

发明内容

本发明的口的在于克服现有灵芝孢子油含量检测方法上存在的不足，提供一种检测质量稳定，容易控制的灵芝孢子油含量的检测方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

1、灵芝孢子油制剂中灵芝酸E的含量测定：

对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品，加甲醇制成每1ml含0.001～0.100mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：精密称定灵芝孢子油制剂5.0～15.0g，加石油醚50～150ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(10g，18mm×400mm)上，加入100～200ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝65～75∶35～25的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入100～200ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～90∶20～10的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

用高效液相色谱法测定：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％甲酸或乙酸溶液28～45∶72～55为流动相；检测波长为252nm；理论板数按灵芝酸E峰计算，不低于1500；

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算；检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂中灵芝酸E的含量在0.001mg～0.050mg之间，即灵芝酸E的含量应在0.010％～0.50％之间。

上述的灵芝孢子油制剂为胶囊(包括灵芝孢子油软胶囊、自乳化灵芝孢子油软胶囊、灵芝孢子油充液胶囊)、乳剂、颗粒剂、针剂、滴丸、膜剂或气雾剂等临床可接受的剂型。

当灵芝孢子油制剂为灵芝孢子油软胶囊、自乳化灵芝孢子油软胶囊或灵芝孢子油充液胶囊时，灵芝酸E的含量测定方法还可采用如下方法：

色谱条件：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；乙腈-0.1％甲酸溶液31∶69为流动相；检测波长为252nm；理论板数按灵芝酸E峰计算，不低于1500；

对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品，加甲醇制成每1ml含0.010mg的溶液，即得对照品溶液；

供试品溶液的制备：取灵芝孢子油软胶囊或自乳化灵芝孢子油软胶囊或灵芝孢子油充液胶囊样品30粒，剪开，倾出内容物，混匀，精密称取10.0g，加石油醚100ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(10g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝70∶30的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

测定结果：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，计算；检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂中灵芝酸E的含量在0.001mg～0.050mg之间，即灵芝酸E的含量应在0.010％～0.50％之间。

2、灵芝孢子油制剂中总灵芝酸含量测定：

对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品2.5～7.5mg，置于25ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，每1ml中含灵芝酸E为0.1～0.3mg；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置10ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液至刻度，摇匀；以相应的饱和NaHCO₃溶液为空白，照紫外-分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：取灵芝孢子油制剂1～5g，精密称定，加石油醚10～50ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(8g，18mm×400mm)上，加入100～150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝10～25∶75～90的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入100～150ml乙酸乙酯∶甲醇＝80～95∶5～20的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加氯仿20ml，超声2min溶解，转移置分液漏斗中，用饱和NaHCO₃萃取4次，每次20ml，合并萃取液，置100ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。照分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝酸E的重量，计算，即得；检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂中含总灵芝酸以灵芝酸E计，应不少于1.0mg。

上述的灵芝孢子油制剂为胶囊(包括灵芝孢子油软胶囊、自乳化灵芝孢子油软胶囊、灵芝孢子油充液胶囊)、乳剂、颗粒剂、针剂、滴丸、膜剂或气雾剂等临床可接受的剂型。

当灵芝孢子油制剂为灵芝孢子油软胶囊、自乳化灵芝孢子油软胶囊或灵芝孢子油充液胶囊时，总灵芝酸的含量测定方法还可采用如下方法：

对照品溶液的制备：精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品5.0mg，置于25ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液溶解，并稀释至刻度，摇匀，每1ml中含灵芝酸E为0.2mg；

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、2.5ml、5.0ml、7.5ml、10.0ml，分别置10ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液至刻度，摇匀；以相应的饱和NaHCO₃溶液为空白，照紫外-分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，以吸收度为纵坐标、浓度为横坐标，绘制标准曲线；

测定法：灵芝孢子油软胶囊或自乳化灵芝孢子油软胶囊或灵芝孢子油充液胶囊样品20粒，剪开，倾出内容物，混匀，精密称取3.0g，加石油醚50ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(8g，18mm×400mm)上，加入120ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入120ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，加氯仿20ml，超声2min溶解，转移置分液漏斗中，用饱和NaHCO₃萃取4次，每次20ml，合并萃取液，置100ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。照分光光度法，在262nm波长处测定吸收度，从标准曲线上读出供试品溶液中灵芝酸E的重量，计算，即得；检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂中含总灵芝酸以灵芝酸E计，应不少于1.0mg。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：灵芝孢子油中三萜类化学成分为灵芝孢子油中活性很高的成分，而三萜酸类成分为灵芝孢子油中三萜类成分的主成分，且含量与灵芝孢子油含量在一定条件下成线性关系。故在用比色法测定总灵芝酸含量的基础上，将灵芝孢子油中灵芝酸类成分之一灵芝酸E的含量进行测定，以此来检测灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油的含量，从而使灵芝孢子油制剂中灵芝孢子油含量质量标准得以完善、提高，切实做到灵芝孢子油制剂质量的稳定、可控。

本发明对灵芝孢子油制剂中的总灵芝酸进行先分离，以总灵芝酸中的灵芝酸E为标准，用紫外分光光度法进行的含量测定，此法成熟、准确可靠。为了进一步地控制灵芝孢子油制剂的质量，本发明对灵芝孢子油制剂中灵芝酸E的含量首次用高效液相色谱法进行了测定，此法准确、稳定、重现性好、回收率高，测定无干扰。

附图说明

图1为灵芝酸E对照品紫外吸收光谱图；

图2为灵芝孢子油供试品紫外吸收光谱图。

具体实施方式

实施例1 灵芝孢子油中灵芝酸E含量的测定

(1)仪器与试药

高效液相色谱仪，包括Waters1525泵，2487双通道紫外检测器，Waters柱温箱，Breeze液相色谱工作站，Brasson超声清洗仪。灵芝酸E对照品(灵芝孢子中提取分离获得，经mp、IR、UV、MS、¹H-NMR等鉴定为灵芝酸E，HPLC归一化法测定测得纯度为99.6％)，乙腈为美国Tedia色谱纯，水为超纯水，其它试剂均为分析纯。待测药物样品为灵芝孢子油软胶囊(批号：051114、051217、060123)。

(2)色谱条件

色谱柱：Kromasil C18，4.6mm×250mm，5μm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.1％甲酸溶液(31∶69)；检测波长252nm；流速：1.0ml/min。

(3)检测波长的选择

取灵芝酸E对照品溶液，在200～400nm范围内扫描，结果在252nm处有最大吸收，故选择252nm作为检测波长。

(4)对照品溶液的制备

精密称取经五氧化二磷干燥过夜的灵芝酸E对照品2.675mg，置25ml的量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品溶液。其浓度为每1ml含0.107mg。

(5)供试品溶液的制备

取灵芝孢子油软胶囊30粒，剪开，倾出内容物，混匀，精密称取10.0g，加石油醚100ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(10g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝70∶30的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝85∶15的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至2ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得供试品溶液；

(6)供试品溶液制备中洗脱溶剂的选择

分别以石油醚→石油醚∶乙酸乙酯(90∶10)→石油醚∶乙酸乙酯(80∶20)→石油醚∶乙酸乙酯(70∶30)→石油醚∶乙酸乙酯(60∶40)→石油醚∶乙酸乙酯(50∶50)→石油醚∶乙酸乙酯(40∶60)→石油醚∶乙酸乙酯(35∶65)→石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)→石油醚∶乙酸乙酯(10∶90)→乙酸乙酯→乙酸乙酯∶甲醇(90∶10)→乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)的顺序进行洗脱，收集每→段的洗脱液，浓缩后进行含量测定分析，结果发现，在石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)以前的洗脱段和乙酸乙酯∶甲醇(8∶2)的洗脱段中均未发现灵芝酸E，显示灵芝酸E的最佳洗脱顺序为以石油醚∶乙酸乙酯(25∶75)以前的洗脱段洗脱杂质，以乙酸乙酯∶甲醇(90∶10)以后的洗脱段洗脱灵芝酸E。

(7)供试品溶液制备中洗脱溶剂用量的选择

分别以石油醚∶乙酸乙酯(40∶60)150ml→乙酸乙酯(30∶70)150ml→乙酸乙酯∶甲醇(85∶15)150ml→乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)150ml依次洗脱，收集各部分洗脱液，分别蒸干，并加甲醇定容到2ml。然后分别进样10μl进行含量测定，结果在乙酸乙酯(40∶60)洗脱部分含大量脂肪油，在石油醚∶乙酸乙酯(30∶70)和乙酸乙酯∶甲醇(80∶20)部分均未发现灵芝酸E的色谱峰，在乙酸乙酯∶甲醇(85∶15)部分发现灵芝酸E的色谱峰，说明洗脱溶剂的用量为150ml既可以有效的除去杂质，又能将灵芝酸E充分的洗脱下来。

(8)高效液相色谱流动相

考察灵芝酸E在Kromasil C18柱，不同流动相中的各参数，结果以乙腈-1％甲酸或乙酸水溶液(31∶69)、甲醇-1％甲酸或乙酸水溶液(48∶52)条件下灵芝酸E的峰形良好，分离度大于1.5，均可作为流动相。

(9)线性关系考察

分别精密量取灵芝酸E对照品溶液(0.107mg/ml)5μl、10μl、15μl、20μl、25μl的溶液，分别注入液相色谱仪，以进样量(μg)为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。结果见表1。

表1、线性关系实验数据(n＝5)

进样量(μg)0.535 1.070 1.605 2.140 2.675峰面积314433.5 652515.8 990598.0 1328680.1 1666762.1

Y＝631929.1X-23648.2，R＝0.9999。

以上结果表明：灵芝酸E在0.535μg～2.675μg范围内，呈良好的线性关系。

(10)精密度试验：精密吸取灵芝酸E对照品溶液(0.107mg/ml)10μl，重复进样5次，灵芝酸E峰面积值的RSD＜2％，结果见表2。

表2 精密度试验数据(n＝5)

试验序次    1  2  3  4  5  均值  RSD峰面积  652576.8  652497.4  653341.9  649978.3  653117.7  652302.4  0.206％

试验证明，精密度良好。

(10)稳定性试验：取样品供试液(批号051114)分别于0小时，2小时，4小时，8小时，16小时，24小时，分别进样10μl，测得样品中灵芝酸E峰面积的RSD＜2％，结果见表3。

表3 稳定性试验数据

试验结果表明，样品供试液在24小时内稳定性良好。

(11)重现性试验：照含量测定项下操作，对同一批样品(批号051114)5份进行测定，求得相对标准偏差RSD为1.077％。

表4 重现性试验数据

测定序次1 2345 6 RSD(％)灵芝酸E含量(mg/g)0.01414 0.014280.01403 0.01434 0.01399 0.01416 1.077

表4试验结果表明，灵芝酸E测定重现性良好。

(12)回收率试验：用加样回收，精密称取已知含量的样品(批号：051114，0.01416mg/g)的样品10.0g，分别精密加入灵芝酸E对照品溶液(0.04276mg/ml)5ml，照含量测定项下操作，按下式计算回收率，结果见表5。

表5 灵芝酸E回收率试验结果

样品中的含量(mg) 检出量 (mg) 加入量 (mg)回收量(mg) 回收率 (％) 平均值 (％)RSD(％)0.1416 0.3548 0.3537 0.3496 0.3512 0.3483 0.3527 0.2138 0.2132 0.2121 0.2080 0.2096 0.2067 0.2111 99.72 99.20 97.29 98.04 96.68 98.74 98.281.18％

试验结果表明加样回收率良好。

照上述含量测定的方法操作，测定了6批灵芝孢子油制剂中灵芝酸E的含量，结果见表6。

表6 样品中灵芝酸E的含量测定结果(n＝2)

    批号    含量(mg/g)    051114    051217    060123    060322    060417    060429    0.01416    0.00719    0.02047    0.01547    0.00252    0.04618

测得每1g灵芝孢子油中灵芝酸E的含量在0.00252～0.04618mg之间。

测得每1.0g灵芝孢子油制剂(相当于生药5g)灵芝酸E含量在0.00252～0.04618mg之间，考虑到工业放大中的损耗误差，在此基础上，行上下浮动，因此得到的检测标准为每1.0g灵芝孢子油制剂(相当于生药5g)灵芝酸E含量在0.001～0.050mg之间(即灵芝酸E含量在0.01％～0.50％之间)。

实施例2灵芝孢子油中总灵芝酸含量的测定

(1)仪器与试药

UV Agilent8453紫外-可见分光光度计(美国安捷伦科技有限公司)。待测药物样品为灵芝孢子油软胶囊(批号：051114、051217、060123)，灵芝酸E对照品(自制，纯度为99.6％)；所用试剂均为分析纯。

(2)对照品溶液的配制

精密称取灵芝酸E对照品5.36mg，置25ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶液。

(3)供试品溶液制备

取供试品内容物3g，精密称定，加石油醚50ml溶解，加入已处理好的硅胶柱(8g，18mm×400mm)上，加入150ml乙酸乙酯∶石油醚(60～90℃)＝25∶75的混合溶液洗脱，弃去洗脱液，硅胶柱继续加入150ml乙酸乙酯∶甲醇＝90∶10的混合溶液洗脱，收集洗脱液，回收溶剂至干，残渣加氯仿20ml，超声2min溶解，转移置分液漏斗中，用饱和NaHCO₃萃取4次，每次20ml，合并萃取液，置100ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液稀释至刻度，作为灵芝孢子油供试品溶液。

(4)方法可行性考察

分别取上述灵芝酸E对照品溶液、供试品溶液，以饱和NaHCO₃溶液稀释一倍，在200～400nm波长范围内进行紫外扫描，记录紫外扫描图，见图1，结果灵芝酸E对照品、灵芝孢子油的紫外光谱图基本一致，且均在262nm波长处有最大吸收。故确定以饱和NaHCO₃溶液为溶剂，测定波长确定为262nm。

(5)标准曲线制备

分别精密吸取灵芝酸E对照品溶液(0.2144mg·ml-1)0.5、2.5、5.0、7.5、10.0ml，置10ml量瓶中，加饱和NaHCO₃溶液稀释至刻度，在262nm波长处测定吸收值，以浓度为横坐标，吸收度为纵坐标，计算标准曲线，结果灵芝酸E在0.01072～0.2144 mg·ml-1范围内呈良好的线性关系；回归方程为Y＝9.671X+0.0866，r＝0.9995。

(6)稳定性试验

取供试品(批号051114)内容物，照(3)项下方法制备灵芝孢子油供试品溶液，分别在0、0.5、1、2、4、8、12、24 h，于262nm波长处测定吸收值，结果表明，24h内吸收值无明显变化，RSD为1.57％。

(7)重复性试验

取供试品(批号051114)内容物5份，分别照(3)项下方法制备供试品溶液，在262nm波长处测定吸收值，计算各瓶样品中总灵芝酸的含量(以灵芝酸E计)。结果R S D为1.84％(n＝5)。

(8)回收率测定

精密称取供试品(批号051114)内容物2.0g，共5份，分别精密加入灵芝酸E对照品氯仿溶液(0.502mg·ml-1)3.0ml，照(3)项下方法制备供试品溶液，在262nm波长处测定吸收值，计算，结果平均回收率为99.42％，RSD为0.57％，结果见表7。

表7回收率试验结果

 序 号    样品中灵芝    酸量(mg)  加入量  (mg)  测得量  (mg)  回收量  (％) 回收率 (％)平均值(％)RSD(％) 1 2 3 4 5    3.132    3.132    3.132    3.132    3.132  1.506  1.506  1.506  1.506  1.506  4.643  4.621  4.629  4.624  4.631  1.511  1.489  1.497  1.492  1.499 100.33 98.87 99.40 99.07 99.4499.420.57

试验结果表明加样回收率良好。

照上述灵芝孢子油制剂中总灵芝酸的含量测定的方法操作，测定了6批灵芝孢子油制剂中总灵芝酸的含量，结果见表8。

表8 样品中总灵芝酸的含量测定结果(n＝2)

    批号    含量(mg/g)    051114    051217    060123    060322    060417    060429    1.566    1.017    3.204    2.547    1.252    5.743