玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用

摘要

本发明公开了一种玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用。该筛选方法包括以下步骤：1)用盐酸羟胺突变剂对玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA在70－80℃温浴条件下进行随机突变；2)将经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和作为对照的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选阳性单克隆；3)将阳性克隆划线接种于Conberg加富固体培养平板上，在35－39℃下培养；4)用碘－碘化钾溶液对在Conberg加富固体培养平板上长出的单菌落进行染色，与对照菌落的颜色进行比较，比对照颜色深的为突变体菌株，再经测序验证，得到玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体。本发明的玉米胚乳ADP－葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法将在玉米的品种改良中发挥重要作用。

说明书

技术领域

本发明涉及植物的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与应用，特别是涉及来源于玉米胚乳的ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法与该突变体及其编码基因在玉米品种改良中的应用。

背景技术

淀粉在人类生活中占有重要地位，因此研究人员对于淀粉合成的研究一直没有中断过。在农业和林业领域，人们长期致力于提高农作物(如玉米等)产量，为持续增长的世界人口提供足够的食物和工业原料。同时，从可持续发展和环境保护的角度出发，对玉米生产的产量和质量的需求将会日益增加和提高。此外，因为淀粉含量高的植物细胞或器官吸收脂肪或煎炸油少，因而可用于生产低热量的“更健康”的产品。据统计，全世界80％以上的淀粉来自于玉米，其中美国的这一比例更高达95％以上，我国在这方面的研究还存在许多缺陷，因此，加速工业用高淀粉玉米品种的培育和改良已势在必行。

在淀粉合成过程中涉及到一系列酶的参与：ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(ADP-Glucose pyrophosphorylase，简写为AGPase)、淀粉合成酶(strarchsynthase，简写为SS)、淀粉分支酶(starch branching enzyme，简写为SBE)、淀粉去分支酶(starch debranching enzyme，简写为DBE)等。其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶是细菌糖原和植物淀粉合成的关键酶，催化1-P-Glucose和ATP生成的ADPG作为淀粉合成酶的底物参与直链淀粉和支链淀粉的合成，它的活性高低是决定淀粉积累速率的关键因素。在高等植物中，该酶具有一复杂的异源四聚体结构。到目前为止，AGPase已从玉米、小麦、菠菜、甜菜、拟南芥、大麦和马铃薯等多种植物中得到分离和纯化。

AGPase活性的高低受多种因素的调节，其中别构调节是一种重要的调节方式，该方式通过调节激活剂3-PGA和抑制剂无机磷的比例来达到控制酶活性的目的。1969年，Cattaneo等(Cattaneo J，O.M.，Sigal N，Sanchez-Medina G，Puig J.Geniticstudies of E.coliK12 mutants with alterations in glycogenesis and propertiesof an altered AGPase.Biochem Biophys Res Commun.1969，34：694-701.)发现了大肠杆菌(E.coli)K12株系中的一个突变菌株，其糖原含量比野生型菌株提高了33％以上。进一步的研究证实突变体糖原提高的原因是由于控制糖原合成的关键酶AGPase发生了突变，改变了该酶对别构调节剂的反应，即对别构调节不敏感(LeeY M，K.A.，Preiss J.Amino acid sequence of an E.coli ADPglucose synthetaseallostefric mutants as deduced from the DNA sequence of the glgCgene.NucleicAcids Res，1987，15：10603.)。1992年，Monsanto公司的Stark等人(David M.Stark，Kurt P.Timmerman et al.Regulation of the amount of starch in planttissues by AGPase.Science，258：287-291.)将突变的AGPase基因转入马铃薯，获得了淀粉含量提高的转基因植株，平均含量比对照提高了35％，有的可达60％，这是利用基因工程手段提高植物淀粉含量第一个成功的例子。

为深入研究AGPase的催化及调控性质，从而达到调控淀粉合成的目的，研究人员用化学修饰和突变的方法研究了该酶的底物及别构剂结合位点。结果证实，该酶含有多个配体结合位点，除底物ATP和G-1-P催化位点外，还存在激活剂3-PGA的结合位点及无机磷的抑制结合位点。同时，也得到了一些相应的突变体，如对激活剂3-PGA比较敏感的突变体(Greene，T.W.，I.H.Kavakli，et al.Generation ofup-regulated allosteric variants of potato ADP-glucose pyrophosphorylase byreversion genetics.″Proc Natl Acad Sci USA.1998，95(17)：10322-10327.)等。但研究较多的是来源于马铃薯块茎的AGPase和菠菜叶片的AGPase，而玉米胚乳AGPase的突变体相对较少。用转座子诱导突变的方法诱导玉米胚乳中AGPase的大亚基基因(Shrunken-2)产生突变，突变株的种子重量比野生型增加了11-18％，进一步的分析表明，种子重量的增加是由于突变的AGPase降低了对抑制剂无机磷的敏感性(Giroux，M.J.，J.Shaw，et al.A single mutation that increases maizeseed weight.Proc Natl Acad Sci USA.1996，93(12)：5824-5829.)。此外，玉米胚乳的AGPase是一热不稳定的酶，Green等(Greene，T.W.and L. C.Hannah.Enhanced stability of maize endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase isgained through mutants that alter subunit interactions.″Proc Natl Acad SciUSA.1998，95(22)：13342-13347.)利用突变技术得到了一个热稳定的突变体，分析结果表明热稳定的原因是由于大小亚基之间相互作用增强的结果。

虽然玉米胚乳的AGPase与马铃薯块茎和菠菜叶来源的AGPases在氨基酸序列上具有很高的同源性，但在亚细胞定位、调控性质以及热稳定性方面，玉米胚乳AGPase与二者来源的AGPase存在着很大的区别，如马铃薯块茎AGPase定位于储藏器官的淀粉体内，而玉米胚乳的AGPase主要定位于淀粉体外的胞质中；马铃薯块茎AGPase对激活剂和抑制剂相当敏感，在没有激活剂存在的情况下，其活性可以忽略不计(检测活性比较困难)，而玉米胚乳AGPase不同，在无激活剂存在的情况下，酶活性仍然较高，而且激活剂的存在可以部分弥补抑制剂对活性的影响；此外，马铃薯AGPase可以受不同水平的调控，如转录水平、转录后水平以及翻译后还原修饰调控等。而在玉米的籽粒中，AGPase的大小亚基的含量变化与其编码基因Shrunken-2和Brittle-2的转录水平一致，目前还没有发现其它水平的调控；在热稳定性方面，由于马铃薯块茎AGPase两个小亚基N端均有半胱氨酸，因此形成了比较稳定的二硫键结构，而玉米AGPase的大小亚基均没有此结构。因此，深入对玉米胚乳AGPase的探讨不仅有助于揭示单子叶植物与双子叶植物在淀粉合成途径中的异同点，同时，对进一步提高玉米淀粉含量也有帮助。

发明内容

本发明的目的是提供一个简便易行的筛选酶活性提高的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体的方法。

本发明所提供的筛选玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体的方法，包括以下步骤：

1)用盐酸羟胺突变剂对玉米胚乳AGPase大小亚基基因(Sh2和Bt2)的cDNA在70-80℃温浴条件下进行随机突变；所述盐酸羟胺突变剂配方为：0.15-0.25g盐酸羟胺，125mM pH7.0的焦磷酸钠1.0-1.6mL，1M的NaCl0.2-0.4mL，500mM pH8.0的EDTA10-14μl，用无离子水定容至3mL；

2)将步骤1)中经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和作为对照的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA分别转化大肠杆菌glgC突变菌株，筛选分别转化有经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的阳性单克隆；

3)将步骤2)筛选的阳性克隆接种于Conberg加富固体培养平板上，在35-39℃下培养12-24小时；所述Conberg加富固体培养基配方为：磷酸二氢钾8-9g，磷酸氢二钾10-12g，酵母提取物5-7g，葡萄糖8-12g，琼脂15-25g，用水定容至1L，最终pH7.0；

4)用碘-碘化钾(I₂-KI)溶液对在步骤3)中Conberg加富固体培养平板上长出的单菌落进行染色，与对照菌落的颜色进行比较，比对照颜色深的为突变体菌株，测序，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体；所述碘-碘化钾溶液是含0.08-0.12mol/L碘和0.25-0.35mol/L碘化钾的水溶液。

在上述筛选方法中，步骤1)中的温浴温度优选为75℃，盐酸羟胺突变剂的配方优选为：0.2084g盐酸羟胺，125mM的焦磷酸钠(pH7.0)1.2mL，1M的NaCl0.3mL，500mM的EDTA(pH8.0)12μl，无离子水1.488mL。

步骤2)中经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA和作为对照的野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA可通过含有经突变的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA或野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的原核表达载体转化大肠杆菌glgC突变菌株，所述原核表达载体可为任意可在大肠杆菌中表达外源基因的原核表达载体，如pGEX-KG、pET28a、pET30a、pET-11c、pET-22b等。

步骤3)中的接种方式优选为划线接种，培养温度优选为37℃；Conberg加富固体培养基的配方优选为：磷酸二氢钾8.5g，磷酸氢二钾11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，琼脂20g，用水定容至11，最终pH7.0。

步骤4)中的碘-碘化钾溶液的配方优选为：含0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化钾的水溶液。

此外，为筛选出活性更高的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体，可将上述筛选方法中的步骤1)-4)重复1-3次。

用上述方法筛选获得的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体也属于本发明的保护范围。

所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体，名称为AGPase-10-3-53，可具有下述氨基酸残基序列之一：

1)序列表中的SEQ ID NO：1；

2)将序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加具有AGPase活性的蛋白质。

序列表中的SEQ ID NO：1由475个氨基酸残基组成，与未突变的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶相比，自氨基端(N端)第323位由Ile突变为Met，自氨基端第499位由Met突变为Arg。

编码上述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体的基因(AGPase-10-3-53)，是下述核苷酸序列之一：

1)序列表中SEQ ID NO：2的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO：1的DNA序列；

3)与序列表中SEQ ID NO：2限定的DNA序列具有90％以上同源性且具有AGPase活性的核苷酸序列；

4)在高严谨条件下可与序列表中的SEQ ID NO：2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。

所述高严谨条件为：用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在65℃下杂交并洗膜。

序列表中的SEQ ID NO：2由1428个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1428位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，自5’端第967-969位碱基编码突变氨基酸残基Met，自5’端第1345-1347位碱基编码突变氨基酸残基Arg。

含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-10-3-53的表达载体、转基因细胞系和宿主菌，以及扩增AGPase-10-3-53中任一片段的引物也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供一种提高玉米种子淀粉含量的方法。

本发明所提供的提高玉米种子淀粉含量的方法，是将所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-10-3-53导入玉米组织或细胞，玉米种子的淀粉含量得到提高。

所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-10-3-53可通过含有所述ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体基因AGPase-10-3-53的植物表达载体导入玉米组织或细胞。

用于构建所述植物表达载体的出发载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它的参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3’端转录的非翻译区等均具有类似功能。

使用AGPase-10-3-53构建植物表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型启动子或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、根部特异表达启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

具体来讲，用于构建所述植物表达载体的出发载体可为pCAMBIA2301、pBI121、pCAMBIA1301或pCAMBIA1300等。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

携带有本发明AGPase-10-3-53的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化玉米组织或细胞，并将转化的玉米组织或细胞培育成植株。

本发明提供了一种玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法。该筛选方法是对野生型玉米胚乳AGPase基因随机突变后，转化大肠杆菌glgC突变菌株，再将重组子接种于Conberg加富固体培养基上，最后用碘染色法对长出的单克隆进行筛选，得到玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体。该筛选方法具有简单易行，稳定可靠的优点，此外，检测结果表明，用本发明筛选方法获得的玉米胚乳AGPase突变体的酶活性是野生型AGPase的134％，且该AGPase突变体在大肠杆菌中积累糖原的能力与野生型AGPase相比也得到显著提高；动力学及调控性质分析结果表明，与该突变体对底物(ATP和G-1-P)的亲和力增强，但对激活剂和抑制剂的敏感性与野生型AGPase相同，说明该突变体对底物亲和力增强是该突变体酶活提高及糖原积累能力提高的原因。本发明的玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其筛选方法将在玉米的品种改良中发挥重要作用，应用前景广阔。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为RT-PCR扩增的玉米胚乳AGPase大、小亚基基因cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果

图2为玉米胚乳AGPase大小亚基基因原核表达载体pGEX-KG-Sh2-Bt2的部分结构示意图

图3为玉米胚乳AGPase大小亚基基因在无glgC活性的大肠杆菌突变菌株中表达情况的SDS-PAGE检测结果及与glgC的功能互补实验结果

图4为玉米胚乳AGPase大小亚基经随机突变后的第一轮筛选结果

图5为突变体10-3和10-3-53与对照的碘染色深浅比较结果

图6为玉米胚乳AGPase突变体与其它来源的AGPase小亚基部分的氨基酸残基序列比对结果

图7为经纯化的玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53的SDS-PAGE检测结果

具体实施方式

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所用引物合成和测序工作均由上海生工完成。

实施例1、玉米胚乳ADP-葡萄糖焦磷酸化酶突变体及其编码基因的获得

一、玉米胚乳AGPase大、小亚基cDNA的获得

1、引物设计

根据玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2和小亚基基因Brittle-2的cDNA序列(GenBank号分别为：M81603，AF334959)设计两对RT-PCR引物(Sh和Bt)，同时为了便于载体构建，在设计引物时针对以下2点做了特殊设计：a.在Shrunken-2的5’端添加限制性内切酶NdeI的识别位点，3’端添加限制性内切酶SmaI和SacI的识别位点；b.因Brittle-25’端ATG的位置存在一个限制性内切酶NcoI识别位点，于是将Brittle-2自5’端第39位的A突变为C，去掉在该位点存在的第二个NcoI识别位点，并在Brittle-23’端添加限制性内切酶SacI识别位点，引物序列如下：

扩增玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2 cDNA的引物对Sh：

Sh2F：5’-CCCATATGCAGTTTGCACTTGCATTGGACACG-3’

Sh2R：5’-GAGAGCTCCCCGGGCTATATGACAGACCCATCGTTGATG-3’；

扩增玉米胚乳AGPase小亚基Brittle-2 cDNA的引物对Bt：

Bt2F：5’-CAAACCATGGACATGGCTTTGGCGTCTAAAGCCTCCCCTCCGCCCTGGAATGCCACCGCCGCCG-3’

Bt2R：5’-GAGCTCTCATATAACTGTTCCACTAGGGAGTAAAGC-3’。

2、第一链cDNA的合成

用Trizol RNA提取试剂盒(购自天为时代公司)并参照试剂盒说明书提取授粉后18天玉米种子的总RNA，并以此为模板反转录合成其第一链eDNA：取1μLOligo(dT)₁₈加到10μL浓度为200ng/μL的总RNA溶液中，70℃反应5分钟后置于冰上冷却5分钟，然后用Promega公司的AMV Reverse Transcriptase并参照说明书加入以下成分：5×反转录缓冲液(试剂盒自带)5μL，dNTPs(每种10mM)2.5μL，RNasin核糖核酸酶抑制剂(浓度为50U/μL)1μL，AMV反转录酶(30U/μL)3μL，用DEPC处理水定容至25μL。反应条件为：室温10min，42℃60min，70℃10min，冰浴2min。

3、PCR扩增

以步骤2合成的第一链cDNA为模板，分别在引物对Sh和引物对Bt的引导下，PCR扩增Shrunken-2和Brittle-2 cDNA，反应体系为：10×缓冲液5μL，dNTPs(每种10mM)1μL，引物Sh2F(Bt2F)(浓度为10μM1μL，引物Sh2R(Bt2R)(浓度为10μM)1μL，Ex-Taq(5U/μL，TaKaRa公司)1μL，第一链cDNA(浓度为10ng/uL)5μL，用灭菌水定容至50μL。PCR反应条件为：先94℃5min；然后94℃1min，62℃45s，72℃2min，10个循环；再94℃1min，65℃45s，72℃2min，25个循环；最后72℃10min，4℃保存。反应结束后，对PCR扩增产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图1所示(泳道Sh2：PCR扩增的Shrunken-2，泳道Bt2：PCR扩增的Brittle-2，经PCR扩增出约1.5kbp的Shrunken-2cDNA片段和1.4kbp的Brittle-2 cDNA片段，与预期结果相符。回收并纯化这两个目的片段，将其分别克隆入载体pGEM^-T Easy(购自Promega公司)中，对含有Shrunken-2 cDNA片段的克隆载体用限制性内切酶BamHI和SmaI进行双酶切鉴定，经酶切获得了1.5kbp和3.0kbp的DNA片段，与预期结果相符；对含有Brittle-2 cDNA片段的克隆载体用限制性内切酶EcoRI进行单酶切鉴定，经酶切获得了1.4kbp的DNA片段，与预期结果相符：再将上述克隆质粒进行测序，测序结果表明，除了预期的Brittle-2自5’端第39位的碱基A突变为C外，其它序列均与GenBank上登录的序列一致，表明经RT-PCR扩增获得序列正确的玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2和小亚基基因Brittle-2的cDNA。

二、玉米胚乳AGPase大小亚基基因在无glgC活性的大肠杆菌突变菌株中的异源表达

1、原核表达载体pGEX-KG多克隆位点的改造

由于马铃薯块茎AGPase大小亚基的N端和C端对该酶的调控性质起到重要作用，所以为使玉米胚乳AGPase大小亚基基因在利用载体pGEX-KG(购自Invitrogen公司，该载体的物理图谱、构建方法参见文献，Guan KL，Dixon JE.Eukaryotic proteinsexpressed in Escherichia coli：an improved thrombin cleavage and purificationprocedure of fusion proteins with glutathione S-transferase. Anal Biochem.1991，192(2)：262-7)进行原核表达时不产生融合蛋白，现对该载体进行改造，使载体上的GST蛋白既能提前终止表达，不产生融合蛋白，又不影响目的蛋白的表达，设计的多克隆位点(MCS)如下：

CTA GGA TCC TAA TAA CCG GGC AGG TCT AGA CCA TGG GAG CTC

     BamHI stop codon        Xbal   Ncol  Sacl

CAC CAC CAC CAC CAC CAC AAG CTT ACC

       His Tag     Hindlll

合成该多克隆位点片段，对其用限制性内切酶BamHI和HindIII进行双酶切后，与经相同酶双酶切的原核表达载体pGEX-KG用T4 DNA连接酶相连，连接体系及反应条件如下：10×连接酶缓冲液2ul，pGEX-KG BamHI和HindIII双酶切片段2ul，MCSBamHI和HindIII双酶切片段10ul，T4 DNA连接酶(TaKaRa公司)1ul，灭菌蒸馏水5ul，16℃连接12-24小时。反应结束后，将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，将转化细胞在37℃下培养12-24小时，挑取在LB抗性平板(含100mg/L氨苄青霉素)上长出的单克隆，提质粒，分别用限制性内切酶BamHI、EcoRI、XhoI和XbaI进行单酶切鉴定，结果与预期结果相符，再挑取其中一个单克隆进行测序，测序结果表明新合成的多克隆位点片段替代了原载体中的多克隆位点，将改造后的载体pGEX-KG命名为pGEX-KG1。

2、玉米胚乳AGPase大小亚基基因原核表达载体的构建

对步骤一扩增的玉米胚乳AGPase大亚基基因Shrunken-2的cDNA用限制性内切酶NdeI和SacI进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET30a(+)(购自Novagen公司)连接，得到含有Shrunken-2 cDNA的重组载体，命名为pET30Sh2；对步骤一扩增的玉米胚乳AGPase小亚基基因Brittle-2的cDNA用限制性内切酶NcoI和SacI进行双酶切后，与经相同酶双酶切的载体pET28a(+)(购自Novagen公司)，得到含有Brittle-2 cDNA的重组载体，命名为pET28Bt2；再以pET28Bt2为模板，在引物SD：5’-CGGAGCTCTTTAAGAAGGAGATATACC-3’和Bt2R的引导下，PCR扩增Brittle-2的eDNA及其上游的核糖体结合位点，扩增结束后，回收约3.0kbp的目的片段，将其用限制性内切酶SacI进行单酶切后，与经相同酶酶切的重组载体pET30Sh2连接，经鉴定后，得到连接有玉米胚乳AGPase大小亚基基因及各自核糖体结合位点的重组载体，命名为pET30Sh2-Bt2；最后用限制性内切酶XbaI和SacI对pET30Sh2-Bt2进行双酶切，回收并纯化约3.0kbp的具有各自核糖体结合位点的玉米胚乳AGPase大小亚基基因，将其与经相同酶双酶切的载体pGEX-KG1连接，得到玉米胚乳AGPase大小亚基基因的原核表达载体，命名为pGEX-KG-Sh2-Bt2，其部分结构示意图见图2。

3、玉米胚乳AGPase大小亚基基因在无glgC活性的大肠杆菌突变菌株中的异源表达及功能互补实验

1)玉米胚乳AGPase大小亚基基因在无glgC活性的大肠杆菌突变菌株中的异源表达

将步骤2构建的玉米胚乳AGPase大小亚基基因原核表达载体pGEX-KG-Sh2-Bt2转化无ADP-葡萄糖焦磷酸化酶活性的大肠杆菌突变菌株BL21-dglgC(菌株购自北京天为时代公司，筛选方法参见文献，Govons S，Vinopal R，Ingraham J，Preiss J.Isolation of mutants of Escherichia coli B altered in their ability tosynthesize glycogen.J Bacteriol.1969 Feb；97(2)：970-972)，筛选阳性克隆，挑取阳性单克隆接种于2mL LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，于37℃振荡培养12-24小时，然后按1∶100的比例转接到50mL LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.3-0.5，加入不同浓度的IPTG(终浓度分别为0、0.005、0.01、0.1mM)，继续于37℃振荡培养3-4小时诱导目标蛋白的表达，当菌液的OD₆₀₀为1.0时结束培养。培养结束后，10000rpm离心5分钟，弃除上清液，向沉淀加入等体积的1×上样缓冲液(250mM Tris·HCl(pH6.8)，500mM巯基乙醇，10％SDS，0.5％溴酚蓝，50％甘油，4℃保存，使用时稀释10倍)，充分悬浮菌体，沸水中煮沸变性5min，再冰浴2min，然后4℃、12000rpm离心1分钟，上样进行SDS-PAGE检测，以BSA标准品为对照，检测结果见图3中的图A(泳道1为终浓度为0.1mmol/L IPTG诱导的pGEX-KG1，泳道2为终浓度为0.1mmol/L IPTG诱导的pGEX-KG，泳道3为没加IPTG诱导的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道4为终浓度为0.005mmol/L IPTG诱导的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道5为终浓度为0.01mmol/L IPTG诱导的pGEX-KG-Sh2-Bt2，泳道6为终浓度为0.1mmol/L IPTG诱导的pGEX-KG-Sh2-Bt2)，经IPTG诱导，玉米胚乳AGPase 57kDa的大亚基和52kDa的小亚基蛋白均获得表达，且不同浓度IPTG(0，0.005，0.01，0.1mM)诱导的玉米胚乳AGPase大小亚基的表达量并没有明显差异，进一步的实验结果表明，所加IPTG浓度越高(如1mM)，玉米胚乳AGPase大小亚基的表达量反而越低。

2)与glgC(ADP-葡萄糖焦磷酸化酶基因，GenBank号：NC_000913)的功能互补实验

挑取步骤1)获得的玉米胚乳AGPase大小亚基基因表达菌株的单菌落，接种于2mLLB液体培养基中，37℃振荡培养12-24小时，然后于Conberg加富培养基(磷酸二氢钾8.5g，磷酸氢二钾11g，酵母提取物6g，葡萄糖10g，琼脂15g，用水定容至1L，最终pH7)上进行划线，37℃培养12-24小时，用碘-碘化钾(I₂-KI)溶液(0.1mol/L碘和0.3mol/L碘化钾)进行染色，结果如图3中的图B所示(1为对照：大肠杆菌glgC突变菌株，2为转化有玉米胚乳AGPase大小亚基基因的重组大肠杆菌glgC突变菌株)，转化有玉米胚乳AGPase大小亚基基因的重组大肠杆菌glgC突变菌株生长状况良好，表明玉米胚乳AGPase大小亚基在大肠杆菌glgC突变菌株中共表达，可使该glgC突变菌株在Conberg加富培养基上合成糖原，互补了所缺失的glgC的功能。

三、玉米胚乳AGPase大小亚基的随机突变

盐酸羟胺突变剂：0.2084g盐酸羟胺，1.488mL ddH₂O，1.2mL 125mM焦磷酸钠(pH7.0)，0.3mL 1M NaCl，12μl 500mM EDTA(pH8.0)。

用限制性内切酶NdeI和SacI对pGEX-KG-Sh2-Bt2进行双酶切，回收并纯化约3.0kbp的玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA片断，然后取盐酸羟胺突变剂1-3mL，将纯化的待突变的20-30μg玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA片断加到1mL突变剂溶液中，75℃温浴条件下进行随机突变，分别于10、20、30、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130分钟时各取出50ul，立即放置冰上，待样品取完后，统一回收DNA片断，然后将随机突变片段连接入原核表达载体pGEX-KG中，电转化大肠杆菌glgC突变菌株，用与步骤二相同的碘染色法筛选突变菌株。

进行第一轮筛选时，大部分突变菌株经碘染色后呈浅黄色；一部分突变菌株经染色后的颜色与转化有野生型玉米胚乳AGPase大小亚基cDNA的大肠杆菌glgC突变菌株(对照)相似，呈棕色，只有少量的突变菌株经染色后变成深棕色。此轮筛选共挑选出大约12000个单克隆，接种于96孔板中，37℃下振荡培养12-24小时，然后划线于Conberg加富培养基上，再37℃培养12-24小时，用碘染色法进行筛选，经3轮筛选后，获得了2个碘染色颜色比对照深的突变菌株，分别为命名为8-2和10-3，第一轮筛选的最后结果如图4所示(CK：野生型菌株)。

提取筛选到的2个突变菌株的质粒，进行测序，测序结果表明10-3和8-2均是玉米胚乳AGPase小亚基基因Brittle-2自5’端第1345-1347位由编码Met(M)的碱基突变为编码Arg(R)的碱基。

再以突变菌株10-3为原始材料，用与上述相同的方法进行第二次随机突变，以获得活性更高的突变菌株。结果共获得了4个较好的突变菌株，分别命名为10-3-14、10-3-24、10-3-33和10-3-53。经重复实验，突变菌株10-3-53重复性较好，其中，突变菌株10-3-53(53)与突变菌株10-3及对照菌株(CK)的碘染色情况如图5所示。

提取突变菌株10-3-53的质粒，测序，结果该玉米胚乳AGPase大小亚基突变体基因是在突变菌株10-3的玉米胚乳AGPase大小亚基基因的基础上突变的，命名为AGPase-10-3-53，具有序列表中SEQ ID NO：2的核苷酸序列，由1428个碱基组成，其编码序列为自5’端第1-1428位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质，将该蛋白命名为AGPase-10-3-53，自5’端第967-969位碱基编码突变氨基酸残基Met(野生型为Ile)，自5’端第1345-1347位碱基编码突变氨基酸残基Arg(野生型为Met)。AGPase-10-3-53与其它来源AGPase小亚基部分的氨基酸残基序列比对结果如图6所示，自氨基端第323位的Ile在玉米胚乳和叶、大麦胚乳和叶、小麦种子来源的AGPase中是高度保守的，而来源于所有已知的双子叶植物、玉米胚和水稻胚乳、叶的AGPase该位置的氨基酸残基是Val。

实施例2、玉米胚乳AGPase突变体酶活及糖原含量测定

一、玉米胚乳AGPase突变体粗提液的AGPase活性测定

1、玉米胚乳AGPase突变体粗提液的获得

分别挑取含野生型玉米胚乳AGPase基因的大肠杆菌glgC突变菌株(对照)及实施例1经筛选获得的突变菌株10-3和10-3-53的单菌落，接种于LB液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃培养12-24小时，然后按1∶100的比例将过夜培养的菌液转接到新鲜的LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm下振荡培养3-4小时至OD₆₀₀为0.6-0.8后，加终浓度为0.1mM IPTG于常温下诱导12-24小时。培养结束后，6000rpm离心收集菌体，称重，-20℃放置12-24小时，向每克菌体中添加5mL蛋白提取缓冲液(50mM Hepes(pH7.5)，5mM MgCl₂，1mM EDTA(pH8.0)，20％蔗糖，100μM ATP，30％硫酸铵，10mM Pi，5mM DTT，500μg/mL溶菌酶(Lysozyme)，1μg/mL胃蛋白酶抑制(Pepstatin)，1μg/mL亮抑酶肽(Leupeptin)，1mM Benzamidine，1mM PMSF，10μg/mL丝氨酸蛋白酶抑制剂(Chymostatin))，重悬菌体，冰浴30min后超声10-15min，最后30000rpm离心20min，收集上清作为酶活测定的粗提液。

2、AGPase活性测定

取10μl步骤1获得的蛋白粗提液，与40μl反应缓冲液(80mM pH8.0 Hepes，5mM MgCl₂，0.5mg/mL BSA，1mM ADPGlc，5mM 3磷酸甘油酸，2mM Dithiotreitol，10μM 1，6-2磷酸葡萄糖)混合，然后加入2mM焦磷酸钠溶液开始反应，25℃反应10分钟，煮沸5分钟，5000rpm离心5分钟，吸取上清，向上清中加入380μl ddH₂O，测定OD₃₄₀作为A1，然后再加入70μl反应缓冲液(100mM pH7.5 Hepes，0.1mg/mL BSA，5mM MgCl₂，1mM NADP，0.8U/mL磷酸葡萄糖变位酶，0.7U/mL 6-磷酸葡萄糖脱氢酶)，25℃反应10分钟，测OD₃₄₀作为A2，以OD₃₄₀的变化计算AGPase活性。

对照、10-3和10-3-53 AGPase粗提液的AGPase活性分别为0.058unit/mg、0.066unit/mg和0.078unit/mg，表明粗提液AGPase的活性高低与实施例1中的碘染色结果一致，突变菌株10-3 AGPase粗提液的AGPase活性是野生型玉米胚乳AGPase的113％，突变体菌株10-3-53 AGPase粗提液的AGPase活性是野生型玉米胚乳AGPase的134％。从碘染色结果和粗提液AGPase活性分析结果的一致性来看，本发明的筛选方法简单易行，可用于筛选AGPase活性提高的玉米胚乳AGPase突变体。

2、糖原含量分析

分别挑取含野生型玉米胚乳AGPase基因的大肠杆菌glgC突变菌株(对照)及实施例1经筛选获得的突变菌株10-3和10-3-53的单菌落，接种于Conberg加富液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃培养12-24小时，然后12000rpm离心10min，收集菌体，称重后用蒸馏水重悬菌体，再在100℃下培养15min，然后加入DMSO和盐酸，60℃培养30min，用0.5M NaOH溶液调培养液pH值至4.5，加3-5U的淀粉糖苷酶，在醋酸钠(含有50mM醋酸纳，pH5.2)培养缓冲液中，55℃反应40min降解糖原，然后按葡萄糖的测定方法测定由糖原降解产生的葡萄糖含量：加10μl培养物于250ul糖反应缓冲液(100mM pH6.9 Imidazao-HCl，5mM MgCl₂，2mM NAD，1mM ATP)中，加入1-2μl(1-2μ/μl)6-磷酸葡萄糖脱氢酶，室温反应10min，在340nm波长测吸光值，加入1-2μl己糖激酶(Hexokinase，HK)，测葡萄糖含量。

对照、10-3和10-3-53的糖原含量测定结果分别为32.6mg/g、46.2mg/g和71.9mg/g，结果与实施例1的碘染色结果基本一致，即碘染色浅的其糖原含量低，而碘染色深的其糖原含量相对较高，上述检测结果表明，与野生型玉米胚乳AGPase相比，用本发明方法筛选的玉米胚乳AGPase突变体的AGPase活性不仅得到了提高，而且其在大肠杆菌中积累糖原的能力也得到了相应的提高，进一步证明了该筛选方法的可靠性。

实施例3、玉米胚乳AGPase突变体的纯化

1、蛋白的可溶性分析

首先将实施例2获得的经IPTG诱导12-24小时的玉米胚乳AGPase突变菌株10-3-53的菌液于4℃、5000rpm离心5分钟，收集诱导细胞，弃除上清液，用1/10体积的TE(50mM Tris-HCl pH 8.0，0.2mM EDTA)重悬细胞沉淀，再加入10mg/mL溶菌酶(用新鲜的TE缓冲液配制)至终浓度为100μg/mL，然后加入1/10体积的Triton-100，30℃培养15分钟，将离心管放入冰水浴中，超声波处理，再4℃、12000rpm离心15分钟，取上清液和沉淀物分别进行SDS-PAGE电泳：上清液含有可溶性蛋白，可以加入等体积的2×SDS上样缓冲液后，煮沸5分钟，室温下12000rpm离心5分钟，取30mL上清液进行SDS-PAGE电泳分析；沉淀含有包涵体，可使用1×SDS上样缓冲液重悬后，煮沸5分钟，室温下12000rpm离心5分钟，取30mL上清液进行SDS-PAGE电泳分析。电泳分析结果表明，玉米胚乳AGPase突变体蛋白大部分存在于沉淀中(即胞内表达)，只有少量蛋白存在于上清中。

2、蛋白的大量诱导及粗提液的制备

用与实施例2步骤1中相同的方法将含野生型玉米胚乳AGPase基因的大肠杆菌glgC突变菌株(对照)和突变菌株10-3-53的单菌落接种于LB液体培养基(含100μg/mL的氨苄青霉素)中，37℃培养12-24小时，然后按1∶100的比例将过夜培养的菌液转接到新鲜的LB液体培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，在37℃、200rpm下振荡培养3-4小时至OD₆₀₀为0.6-0.8后，加终浓度为0.1mM IPTG于常温下诱导12-24小时。培养结束后，6000rpm离心收集菌体，称重，-20℃放置12-24小时，向每克菌体中添加5mL蛋白提取缓冲液，重悬菌体，冰浴30min后超声10-15min，最后30000rpm离心20min，收集上清，将沉淀再用1/2体积的蛋白提取缓冲液重洗一次，合并上清，得到玉米胚乳AGPase的蛋白粗体液，备用。

3、可溶性蛋白的硫酸铵的分级沉淀

分别用25％、35％、45％、55％、65％、75％的饱和硫酸铵溶液对步骤2获得的AGPase蛋白粗体液进行分级沉淀，各个浓度段的沉淀用透析缓冲液(50mMHepes(pH8.0)，5mM MgCl₂，1mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose)悬浮，4℃分别透析12-24小时，然后取少量蛋白进行SDS-PAGE及AGPase活性测定，确定最适的硫酸铵沉淀浓度。结果表明大部分AGPase蛋白在45％-55％的硫酸铵浓度下沉淀下来，收集此浓度段的蛋白沉淀，将沉淀重悬于3mL的透析缓冲液中，4℃透析12-24小时。

4、离子交换层析

利用快速蛋白液相层析(简称FPLC)将步骤3经透析的蛋白样品先过离子交换层析柱子，样品过柱前，先用离子交换层析buffer A(50mM Hepes(pH8.0)，1mM MgCl₂，5mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose，5mM Pi，0.5mM DTT)平衡Mono Q5/50柱子(购自Pharmacia公司)，平衡稳定后再上样，上样前先将经透析的蛋白样品调pH值至8.0，上柱后先用5个柱床体积的离子交换层析buffer A继续漂洗柱子，直至流出液的紫外吸收值达到稳定，然后再用0-50％梯度的洗脱bufferB(50mM Hepes(pH7.0)，1mM MgCl₂，5mM EDTA(pH8.0)，20％Sucrose，5mM Pi，0.5mM DTT，1M NaCl)洗脱柱子，流速8.0mL/min，收集流出液，迅速放于冰上暂时保存。取少量不同吸收峰的样品进行SDS-PAGE，结果AGPase蛋白大约在400mM NaCl时被洗脱下来。收集该峰值的样品流出液，测定AGPase酶活，结果表明此峰值下洗脱液的AGPase活性较高，合并该峰值的收集液，加固体硫酸铵至75％的终浓度进行样品的浓缩，用透析缓冲液重悬沉淀，4℃透析12-24小时，于-80℃保存备用。

5、凝胶过滤层析

将步骤4于-80℃保存的经透析的蛋白样品再过FPLC的Hiload 16/60 superdex75柱子(购自Pharmacia公司)，上样前，先对灭菌的蒸馏水进行超虑处理，尽可能的去掉水中的气泡，然后用其洗涤柱子至稳定，再用凝胶过滤层析bufferC(50mMHepes(pH7.5)，10mM MgCl₂，5mM EDTA(pH8.0)，5％Sucrose，200mM KCl，1mM DTT)平衡柱子，稳定后再上样，上样4mL(最大量为5mL)，压力0.5Mpa，用同样的bufferC进行洗脱，0.2mL/管收集流出液，进行SDS-PAGE检测，确定目的蛋白的洗脱峰，洗脱蛋白的SDS-PAGE检测结果如图7所示(泳道M为Marker，泳道1-3为经纯化的目的蛋白AGPase-10-3-53)，表明获得了纯度较高的目的蛋白，同时测定该峰值收集液的AGPase活性，最后合并有活性的部分，分装后于-80℃保存。

实施例4、玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53的动力学及调控性质分析

对实施例3经纯化的用本发明方法筛选的玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase(对照)按如下方法进行动力学及调控性质分析：

1)配制不同浓度的两种底物(ATP和1-P-G，购自Sigma公司)，即0、500nM、1μM、10μm、50μM、100μm、500μm、1mM和5mM，分别在上述不同浓度的底物中测定AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶活力，计算反应速度v，以1/v对1/[S]作图得一直线，其横轴截距为-1/Km，纵轴截距为1/Vmax。

不同底物(ATP和1-P-G)下玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶学动力学常数如表1所示，与野生型玉米胚乳AGPase比较，本发明的突变体AGPase-10-3-53对底物的亲和力增加，分析引起该突变体对底物亲和力增加的原因，可能与经突变后Shrunken-2和Brittle-2大小两个亚基相互作用增强有关，因为小亚基自氨基端第323位的突变位点Ile位于由55个氨基酸残基形成的“motif”结构内，该“motif”结构的作用是调控大小两个亚基之间的相互作用(Joanna M.Cross，Maureen Clancy，Janine R，Shaw et al.A polymorphic motifin the small subunit of AGPase modulates interactions between the small andlarge subunits.The Plant Journal.2005，41，501-511) 。

表1  不同底物下玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳

AGPase的酶学动力学常数

    底物    Km，mM    野生型AGPase  突变体  AGPase-10-3-53    ATP    1-P-G    0.048(0.006)    0.0177(0.0024)  0.012(0.0056)  0.0068(0.0003)

2)配制不同浓度的激活剂3-磷酸甘油酸(购自Sigma公司)和抑制剂无机磷(购自Sigma公司)的浓度，即0mM、0.05mM、0.1mM、0.25mM、0.5mM、1mM、2.5mM、5mM和10mM，分别在上述不同浓度的激活剂或抑制剂中测定AGPase-10-3-53及野生型玉米胚乳AGPase的酶活力，以检测不同浓度的激活剂或抑制剂对酶活力的影响。

检测结果表明，本发明玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53对激活剂和抑制剂的敏感性同野生型玉米胚乳AGPase，证明玉米胚乳AGPase突变体AGPase-10-3-53对底物亲和力增强是该突变体酶活提高及糖原积累能力提高的原因。

序列表

<160>2

<210>1

<211>475

<212>PRT

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>1

Met Asp Met Ala Leu Ala Ser Lys Ala Ser Pro Pro Pro Trp Asn Ala

1               5                   10                  15

Thr Ala Ala Glu Gln Leu Ile Pro Lys Arg Asp Lys Ala Ala Ala Asn

            20                  25                  30

Asp Ser Thr Tyr Leu Asn Pro Gln Ala His Asp Ser Val Leu Gly Ile

        35                  40                  45

Ile Leu Gly Gly Gly Ala Gly Thr Arg Leu Tyr Pro Leu Thr Lys Lys

    50                  55                  60

Arg Ala Lys Pro Ala Val Pro Leu Gly Ala Asn Tyr Arg Leu Ile Asp

65                  70                  75                  80

Ile Pro Val Ser Asn Cys Leu Asn Ser Asn Ile Ser Lys Ile Tyr Val

                85                  90                  95

Leu Thr Gln Phe Asn Ser Ala Ser Leu Asn Arg His Leu Ser Arg Ala

            100                 105                 110

Tyr Gly Ser Asn Ile Gly Gly Tyr Lys Asn Glu Gly Phe Val Glu Val

        115                 120                 125

Leu Ala Ala Gln Gln Ser Pro Asp Asn Pro Asn Trp Phe Gln Gly Thr

    130                 135                 140

Ala Asp Ala Val Arg Gln Tyr Leu Trp Leu Phe Glu Glu His Asn Val

145                 150                 155                 160

Met Glu Phe Leu Ile Leu Ala Gly Asp His Leu Tyr Arg Met Asp Tyr

                165                 170                 175

Glu Lys Phe Ile Gln Ala His Arg Glu Thr Asn Ala Asp Ile Thr Val

            180                 185                 190

Ala Ala Leu Pro Met Asp Glu Lys Arg Ala Thr Ala Phe Gly Leu Met

        195                 200                 205

Lys Ile Asp Glu Glu Gly Arg Ile Ile Glu Phe Ala Glu Lys Pro Lys

    210                 215                 220

Gly Glu Gln Leu Lys Ala Met Met Val Asp Thr Thr Ile Leu Gly Leu

225                 230                 235                 240

Asp Asp Val Arg Ala Lys Glu Met Pro Tyr Ile Ala Ser Met Gly Ile

                245                 250                 255

Tyr Val Phe Ser Lys Asp Val Met Leu Gln Leu Leu Arg Glu Gln Phe

            260                 265                 270

Pro Glu Ala Asn Asp Phe Gly Ser Glu Val Ile Pro Gly Ala Thr Ser

        275                 280                 285

Ile Gly Lys Arg Val Gln Ala Tyr Leu Tyr Asp Gly Tyr Trp Glu Asp

    290                 295                 300

Ile Gly Thr Ile Ala Ala Phe Tyr Asn Ala Asn Leu Gly Ile Thr Lys

305                 310                 315                  320

Lys Pro Met Pro Asp Phe Ser Phe Tyr Asp Arg Phe Ala Pro Ile Tyr

                325                 330                 335

Thr Gln Pro Arg His Leu Pro Pro Ser Lys Val Leu Asp Ala Asp Val

            340                 345                 350

Thr Asp Ser Val Ile Gly Glu Gly Cys Val Ile Lys Asn Cys Lys Ile

        355                 360                 365

Asn His Ser Val Val Gly Leu Arg Ser Cys Ile Ser Glu Gly Ala Ile

    370                 375                 380

Ile Glu Asp Ser Leu Leu Met Gly Ala Asp Tyr Tyr Glu Thr Glu Ala

385                 390                 395                 400

Asp Lys Lys Leu Leu Ala Glu Lys Gly Gly Ile Pro Ile Gly Ile Gly

                405                 410                 415

Lys Asn Ser Cys Ile Arg Arg Ala Ile Ile Asp Lys Asn Ala Arg Ile

            420                 425                 430

Gly Asp Asn Val Lys Ile Leu Asn Ala Asp Asn Val Gln Glu Ala Ala

        435                 440                 445

Arg Glu Thr Asp Gly Tyr Phe Ile Lys Gly Gly Ile Val Thr Val Ile

    450                 455                 460

Lys Asp Ala Leu Leu Pro Ser Gly Thr Val Ile

465                 470                 475

<210>2

<211>1428

<212>DNA

<213>玉米属玉米(Zea mays L.)

<400>2

atggacatgg ctttggcgtc taaagcctcc cctccgccct ggaatgccac cgccgccgag      60

cagctaattc caaagcgtga caaagccgct gcaaatgatt caacatacct caatcctcaa     120

gctcatgata gtgttcttgg aatcattctg ggaggtggtg ctgggactag attgtacccc     180

ttgacaaaga agcgtgccaa gcctgcagtg ccattgggtg ccaactatag actgattgat     240

attcctgtca gcaattgtct caacagcaac atatccaaga tctatgtgct aacgcaattt     300

aactctgctt ccctcaaccg tcacctctca agagcctacg ggagcaacat tggagggtac     360

aagaatgaag ggtttgttga agtcttagct gcacagcaga gcccagataa tccaaactgg     420

tttcagggta ctgcagatgc tgtaaggcag tacttgtggt tgtttgagga gcataatgtg     480

atggaatttc taattcttgc tggcgatcac ctgtaccgga tggactatga aaagttcatt     540

caggcacaca gagaaacaaa tgctgatatt accgttgctg ccctaccgat ggatgagaaa     600

cgtgcaactg catttggcct catgaaaatt gatgaagaag ggaggatcat tgagtttgct     660

gagaaaccga aaggagagca gttgaaagca atgatggttg acaccaccat acttggcctt     720

gatgacgtga gggcaaagga aatgccttat attgctagca tgggtatcta tgttttcagc     780

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gaggttattc caggtgcaac cagcattgga aagagggttc aggcttatct gtatgatggt     900

tactgggaag atatcggtac cattgcggca ttttataatg caaacttggg aataaccaag     960

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tgtgttatta aaaactgcaa gataaaccat tctgtagttg gactccgatc ttgcatatct    1140

gaaggtgcta tcatagagga cagtttacta atgggtgcgg actactatga gacagaagct    1200

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gtcacagtga tcaaggatgc tttactccct agtggaacag ttatatga                 1428