团头鲂异源四倍体的建立方法

摘要

本发明公开了一种团头鲂异源四倍体的建立方法。本发明将亲缘关系较远的三角鲂与团头鲂进行杂交，把不同的遗传距离组合与物理诱导相结合，利用鱼类种间杂交自发形成四倍体的趋势，结合物理休克处理，提高四倍体的诱导比例，从而成功地获得了可育的团头鲂异源四倍体。将团头鲂异源四倍体鱼与与团头鲂二倍体鱼杂交可获得异源倍间杂交三倍体鱼，从而提供了鱼类种质创新的一种有效的新途径。

说明书

技术领域

本发明涉及鱼类的选育领域，更具体地涉及通过利用染色体组操作技术建立团头鲂异源四倍体鱼的方法。

背景技术

自20世纪70年代中期以来，国内外在十多种养殖鱼类中进行过染色体组操作研究，取得了一定的进展，表现在如下方面：

1.同源四倍体的诱导

通过物理休克(冷休克、热休克和静水压)诱导技术，抑制鱼类受精卵的第一次有丝分裂可获得四倍体。迄今为止，各国学者进行过奥利亚罗非鱼、虹鳟、金鲈、丁、鲶、鳙、水晶彩鲫、鲤等鱼类的四倍体诱导。

2.异源四倍体的诱导

远缘杂交可诱导产生四倍体。远缘杂交是指杂交亲本之间的亲缘关系较远，超过种内关系的杂交。远缘杂交可分为种间杂交、属间杂交、亚科间杂交等。由于受卵子的成熟状态、精卵的相互作用或异种精卵和分裂周期差异的影响，远缘杂交可促使杂合胚胎或受精卵的染色体组复制，使得杂种胚胎或受精卵的核内有丝分裂受阻，从而产生四倍体胚胎，进而自发形成四倍化个体。国内外异源四倍体可育群体的建立主要通过远缘杂交自发形成这一单一方式获得，如远缘杂交四倍体“湘鲫”和兴国红鲤♀×红鲫♂异源四倍体。然而，远缘杂交的难点在于寻找到理想的远缘杂交对象，许多鱼类因为缺乏合适的远缘杂交对象而无法进行异源四倍体的诱导。

目前，通过理化诱导或远缘杂交产生性成熟的人工同源四倍体有一定困难。主要表现在诱导率低、畸形率高及非整倍体比率高等，这些问题导致四倍体鱼在幼鱼阶段即过早夭折，难以建立四倍体的繁育群体。至今国内外学者诱导的大多数四倍体鱼不能正常生长和发育，尤其是长成的雌鱼一般都不可育或繁殖力很差，从而严重限制了四倍体繁育群体的建立及其应用。

然而，可育四倍体奠基群体一旦建立，就有可能采用倍间杂交的方式来批量地生产不育三倍体，这种途径不仅可以避免人工直接诱导三倍体鱼所带来的休克损伤，从而提高三倍体鱼的早期存活率，实现三倍体鱼的大规模产业化生产。另外，三倍体鱼是否长的快，除了与其生产方法(是通过直接诱导，还是倍间杂交)有关外，还与其是同源三倍体还是异源三倍体鱼有关。一般认为，异源三倍体的生长速度要快一些。例如，湘云鲫的父本是异源四倍体，其母本日本白鲫是鲫鱼中生长较快的品种，因此，湘云鲫是异源三倍体鱼，其生长速度得到很大提高。

因此，获得鱼类异源四倍体的可育群体，进而采用异源四倍体×二倍体获得异源倍间杂交三倍体鱼是鱼类种质创新的一种有效的途径。而可育鱼类异源四倍体的建立迫切需要选择合适的远缘杂交组合；建立合适的四倍体诱导加倍条件；建立准确、快速的四倍体筛选技术。

团头鲂“浦江1号”是一种新选育的鱼类良种，生长较快、体型较好、纯度高。中国专利申请CN02110699.1中公开了其选育方法。然而，为了进一步提高鱼的经济性状、生长速度，本领域迫切需要开发不育但个体大的团头鲂；而制备可育团头鲂四倍体鱼群体是其先决条件。然而，目前还没有一种有效的产生可育的团头鲂四倍体的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以有效地建立团头鲂可育异源四倍体的方法。

在本发明的一个方面，提供一种团头鲂异源四倍体鱼的建立方法，它包括步骤：

(a)将团头鲂与三角鲂作为杂交组合，选取成熟的雌雄亲鱼，进行正交和/或反交，从而获得杂种受精卵；

(b)对步骤(a)的杂种受精卵进行诱导，抑制受精卵的第一次有丝分裂，并阻止第一次胚胎分裂，从而形成四倍体胚胎；

(c)培养步骤(b)中获得的四倍体胚胎，从而获得四倍体幼鱼；

(d)对步骤(c)中的幼鱼进行检测，从而排除二倍体幼鱼，获得团头鲂异源四倍体鱼。

在本发明的一个优选例中，在步骤(a)中，其中的正交为二倍体团头鲂♀×二倍体三角鲂♂，反交为二倍体三角鲂♀×二倍体团头鲂♂。

在本发明的一个优选例中，采用的诱导方法选自：热休克，冷休克、静水压或其组合。

在本发明的一个优选例中，在步骤(b)中还包括：对步骤(b)的成活胚胎进行胚胎期染色体制片和成活率统计，根据胚胎期的四倍化比例和成活率之间的关系，确定诱导条件，并根据确定的诱导条件进行诱导。

在本发明的一个优选例中，在步骤(d)之后，还包括步骤(e)：进行形态特征分析和性腺发育程度检测，以获得可育四倍体。

在本发明的一个优选例中，当步骤(a)为正交时，在步骤(b)中的热休克诱导条件为：对受精后1.40τ₀的受精卵，采用40.0℃热休克持续2分钟。

在本发明的一个优选例中，当步骤(a)为反交时，在步骤(b)中的热休克诱导条件为：对受精后1.30τ₀的受精卵，采用39.0℃热休克持续2分钟。

在本发明的一个优选例中，步骤(a)中，还包括用促排卵素2号(LHRHa)和绒毛膜促性腺激素(HCG)对雌鱼进行混合催产；或者在杂交时采用干法授精法进行杂交。

在另一优选例中，在步骤(c)中，获得的四倍体幼鱼的体重大于或等于50g。

在本发明的第二方面，提供一种用所述的方法制备的团头鲂异源四倍体鱼。

在另一优选例中，还提供了用所述的方法制备的团头鲂异源四倍体鱼的用途，它被用于制备三倍体鱼。

在本发明的第三方面，提供一种团头鲂异源四倍体鱼的四倍体的体细胞或其二倍体的生殖细胞，它是用所述的方法制备的团头鲂异源四倍体鱼的四倍体的体细胞或其二倍体的生殖细胞。

附图说明

图1是在本发明一种优选例中所诱导的正交(团头鲂♀×三角鲂♂)的异源四倍体雌鱼的照片。该鱼与团头鲂接近，表明具有较强的母本效应。

图2是在本发明一种优选例中所诱导的正交(团头鲂♀×三角鲂♂)的异源四倍体雄鱼的照片。该鱼与团头鲂接近，表明具有较强的母本效应。

图3显示了对诱导产生的鱼进行快速倍性鉴定的照片，上图为未加倍的二倍体，下图为四倍体，四倍体的红细胞核体积为二倍体的2倍。

具体实施方式

发明人经过广泛而深入的研究和试验，意外地发现三角鲂特别适合作为与团头鲂进行远缘杂交的对象。本发明人将三角鲂与团头鲂进行远缘杂交，首次制备了可育的团头鲂四倍体鱼。在此基础上完成了本发明。

在另一优选例中，本发明人还经过条件优化，进一步提高了生产团头鲂四倍体鱼的效率。

在另一优选例中，本发明方法高度集成了远缘杂交、细胞工程诱导和快速倍性检测：

一是采用种间远缘杂交，利用杂种精卵的相互作用或异种精卵和分裂周期的差异，促使杂合胚胎或受精卵的染色体组复制，增加四倍体的诱导比例。

二是用细胞工程诱导技术，采用不同的热休克温度、处理持续时间和诱导起始时间组合，以便确立合适的四倍体诱导条件。

三是用大量诱导结合快速检测技术，形成较大的二倍体和四倍体混合群体，从中筛选出一定数量的四倍体，进而检测出性成熟个体以建立奠基群体。

可用于本发明的远缘杂交方法没有特别限制，可以采用本领域常规的远缘杂交和选育技术。在一优选例中，本发明的四倍体建立方法可包括：远缘杂交；细胞工程诱导；快速倍性检测；强化培育；性腺发育检测；形态学分析等方面，所涉及的技术详细描述如下：

(1)选择合适的遗传交配组合。

亲缘关系较远的生物彼此杂交所得的杂种，因生理功能不协调、生殖系统遭受扰乱而不能成活。本发明人经过研究发现，团头鲂和三角鲂种间分类关系较接近，其杂种可以成活。但是，由于关系接近，杂种胚胎或受精卵的核内有丝分裂不发生紊乱，因此，仅通过杂交不能诱导产生多倍体，还必须加以诱导才能获得四倍体。

(2)细胞工程诱导。

可采用常规的诱导技术抑制受精卵的第1次有丝分裂，从而阻止第1次胚胎分裂，以形成一定比例的四倍体胚胎。

在另一优选例中，本发明人还在不同的诱导条件下进行大量试验，对成活胚胎进行胚胎期染色体制片和成活率统计，研究胚胎期的四倍化比例和成活率之间的关系，探索出了最佳的诱导条件。

(3)大量诱导和快速检测技术。

可采用常规的检测技术检测四倍体。然而，由于四倍体诱导率和成活率均很低，需要进行大量诱导，获得大量不同倍性个体。然而，诱导产生的大量幼鱼在外形上很难区分出来，因此，寻求一个准确而又简便的方法来确定染色体的倍性就显得十分重要。目前，所采用的方法如染色体计数(准确但费时，且要伤及鱼)、DNA含量测定(费用昂贵，难以大规模测定)、血涂片测红细胞体积(耗时、受涂片质量影响及误差较大)等各具有优缺点。

在本发明的优选例中，采用颗粒计数仪(Coulter counter)自动分析红细胞核体积的分布范围，方便、快速、准确，对四倍体检测的可靠率近乎100％，因而适合于生产上大规模检测。

(4)强化培育技术

强化培育技术为任选步骤。由于诱导产生的四倍体生命力较弱，因此如果需要，可在优选例中通过常规的强化培育，以便提高四倍体的检测比例。

(5)性腺发育检测

在优选例中，还可通过常规的性腺发育情况检测可获得性成熟的四倍体，以进行四倍体群体的繁衍和传代。

(6)形态鉴别。

在本发明的优选例中，还通过对鱼体进行形态学测量和框架分析，获得四倍体有别于双亲的形态特征标记，以便进行区分和鉴别。

获得的正交异源四倍体鱼雄鱼与团头鲂接近，具有母本效应，形态差异主要由躯干部引起，可作为四倍体的遗传标记。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明选择属于同一属、但不同种、亲缘关系较远的三角鲂与团头鲂进行杂交，首次获得了团头鲂异源四倍体的可育群体。

(2)首次把不同的遗传距离组合与物理诱导相结合，即利用鱼类种间杂交白发形成四倍体的趋势，结合物理休克处理，提高四倍体的诱导比例。

(3)本发明在建立最佳诱导模式后，进行大量诱导和快速倍性检测相结合，大量诱导可获得大量的不同倍性个体，而快速倍性检测能够准确又简便地确定染色体的倍性。

(4)本发明采用物理诱导与子代筛选相结合，诱导并建立了团头鲂同源四倍体的基础繁育群体，为实现团头鲂种质的进一步创新，为生产具有肉质改良和生态安全特点的倍间杂交三倍体良种创制了四倍体中间育种材料。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，未详细说明的技术为常规技术。

实施例1最佳诱导条件的建立

正交为二倍体团头鲂♀×二倍体三角鲂♂；反交为二倍体三角鲂♀×二倍体团头鲂♂。

设置从受精后1.0τ₀～2.6τ₀(即水温为22℃时从27min～60min；24℃时从17min～50min，τ₀与水温和时间成正比)，在团头鲂受精卵第1次有丝分裂期的不同阶段，每隔3min，分别以41.0℃、40.0℃与39.0℃三种不同的温度进行热休克处理，处理持续时间为2min或3min。受精卵粘于培养皿上，热休克在恒温水浴箱内进行，每个实验组设3-4个平行，进行胚胎期染色体分析以便确立合适的四倍体诱导条件。

结果可知，正交的热休克诱导条件为：采用40.0℃热休克持续2min，分别对受精后1.40τ₀的受精卵进行处理，测得胚胎期四倍体化比例高达18.2％；反交的热休克诱导条件为：采用39.0℃热休克持续2min，分别对受精后1.30τ₀的受精卵进行处理，测得胚胎期四倍体化比例高达16.6％。

实施例2团头鲂异源四倍体的建立

本实施例中，共分三个组进行试验：

试验组1：采用以下(1)-(7)的异源四倍体建立步骤；

试验组2：采用以下(1)-(7)的异源四倍体建立步骤；

试验组3：仅进行团头鲂♀×三角鲂♂种间杂交，不经过热休克诱导步骤。

(1)选择不同的远缘杂交遗传距离组合：正交为团头鲂♀×三角鲂♂；反交为三角鲂♀×团头鲂♂。

(2)选取成熟良好的雌、雄亲鱼，采用促排卵素2号(LHRHa)和绒毛膜促性腺激素(HhCG)进行混合催产、干法授精。

(3)进行正反杂交。

(4)对前述正反杂交获得的杂种受精卵进行热休克诱导，采用实施例1中获得的诱导条件。

(5)对成活下来的鱼进行养殖，获得大量的二倍体和四倍体混合幼鱼，规格在50g以上。

(6)采用倍性测量仪(Coulter counter，Beckman-Coulter Company，USA)对步骤(g)中的幼鱼进行快速检测，获得四倍体。

(7)通过培育获得四倍体成鱼，进行形态特征分析和性腺发育程度检测，获得可育四倍体群体。

表1团头鲂异源四倍体的建立结果

幼角数(尾)异源四倍体数(尾)获得四倍体的比例  雌雄比例  试验1    364      34    9.33％  4♀∶5♂  试验2    1100      34    3.1％  4♀∶5♂  试验3    100      2    2％  1♀∶1♂

由表1可见，获得的异源四倍体鱼雌雄比例为4♀∶5♂，性别比例较为正常。在试验1获得的340尾成活个体中共鉴定出异源四倍体34尾，比例为9.33％；在试验2获得的1100尾幼鱼中，共鉴定出异源四倍体34尾，比例为3.1％。

采用颗粒计数仪自动分析红细胞核体积的分布范围，发现异源四倍体和杂交二倍体的红细胞核平均体积分别为19.1±0.3μm³和9.8±0.3μm³，可见异源四倍体的红细胞核体积为杂交二倍体的2倍。

对诱导产生的鱼进行快速倍性鉴定的照片见图3，上图为未加倍的二倍体，下图为四倍体，四倍体的红细胞核体积为二倍体的2倍。

本实验获得的幼鱼能够正常生长和发育，雄鱼在2⁺龄、雌鱼在3⁺龄可正常性成熟。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。