黄瓜霜霉菌孢子囊离体保存方法

摘要

本发明提供的是一种黄瓜霜霉菌孢子囊离体保存方法。它包括黄瓜霜霉菌孢子囊的保存处理方法及条件、保存后孢子囊萌发率及致病性的测定等过程。本发明的方法是将黄瓜霜霉菌孢子囊保存于10％二甲基亚砜加5％脱脂乳的混合液中，并存放于－20℃、－70℃或预先在－20℃条件下处理24小时，然后在－70℃的条件下进行保存。其中以预先在－20℃冷冻处理24小时，然后在－70℃条件下保存的方法保存效果最好，保存12个月后孢子囊的萌发率为46％，接种黄瓜子叶7天后发病率与病情指数分别为50％和40，保持了较高的致病力。采用本发明的方法适于黄瓜霜霉病菌的离体长期保存，可以从根本上解决黄瓜霜霉菌离体保存致病力下降严重的问题。

说明书

(一)技术领域

本发明涉及的是一种黄瓜霜霉菌孢子囊长期离体保存方法。

(二)背景技术

黄瓜霜霉病是保护地黄瓜上的一种毁灭性病害。该病害是由鞭毛菌亚门，卵菌纲，霜霉科，古巴假霜霉菌〔Pseudoperonospora cubensis(Berk.&M.A.Curtis)Rostovzev〕侵染引起的一种气传病害。迄今为止，对该病害的生理分化及遗传多样性的研究尚不完善。究其原因主要是因为古巴假霜霉菌是专性寄生菌，用人工培养基无法培养和保存。目前菌种保存方法主要有：①寄主活体保存：在适宜环境条件下，定期将病菌接到新的寄主上。这是一种简单却费时的方法，并且要求一定的设备，但可较长期保存。②离体叶保存：沈阳农业大学的傅淑云(1983)研究出了带菌叶的离体培养法，在-5℃条件下，可将病叶保存26天，但其孢子囊萌发率只有3.5％。台湾的Tsai W.(1987)研究的离体叶保存法，可使病叶保存1个月。Parkas小时(1989)用含有5％蔗糖液或者一定浓度激动素液的棉花保湿，可将病叶保存30d。③低温冷冻保存：周凤珍等人1987年报导，采用低温保存，在-20℃条件下，孢子囊保存60天后仍有致病力。石延霞(2002，2005)等通过对低温和干燥对病菌孢子囊致病力的影响的研究指出，低温(-20℃)降低了霜霉病菌孢子囊的致病力，低温时间越长，孢子囊的致病力越低，同时低温使潜育期延长。离体叶片冷冻保存10个月的霜霉菌仍然具有致病力，但致病力下降，病情指数仅为1.60，而对照病情指数已达96.2，同时冷冻菌种潜育期长达17d，而对照潜育期为4d。④液氮保存：Gulya于1993年报道向日葵等霜霉病菌的干孢子囊无需冷冻保护剂可在液氮中保存，但该方法需对孢子囊进行干燥预处理，处理不好孢子囊容易丧失致病性，且保存时需要有液氮设备，并常年存放于液氮中。

从上述关于黄瓜霜霉病菌菌种的保存方法中可见，到目前为止还没有找到理想的、简单有效的保存方法。因此开发确立病菌离体长期保存方法，是对黄瓜霜霉病进行深入研究的基础。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、有效的黄瓜霜霉病菌离体长期保存方法。

本发明的目的是这样实现的：采集黄瓜霜霉病新鲜病叶，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，在20℃～25℃，保湿24小时，待长出大量浓密新鲜的孢子囊之后，用消毒软毛刷将孢子囊刷入10％二甲基亚砜与5％脱脂乳的混合保存液中，然后在-20℃～-80℃条件下保存。

本发明的保存可以在如下条件下进行：

1、在-20℃条件下保存。

2、在-70℃条件下保存。

3、先在-20℃条件下处理24小时，然后在-70℃～-80℃条件下保存。

本发明的有益效果是，黄瓜霜霉病菌离体孢子囊在上述保存液和三种不同温度条件下保存12个月后孢子囊的萌发率分别为16％、11％和46％，接种黄瓜子叶7天后发病率分别为33.3％、33.3％和50％；病情指数分别为23.3、30和40。病菌孢子囊仍然保持较高的致病力。其中以孢子囊预先在10％二甲基亚砜加5％脱脂乳的混合液中-20℃冷冻24小时，然后放入-70℃～-80℃条件下保存的效果最好。应用此方法解决了长期以来黄瓜霜霉病菌离体保存致病力下降严重的问题。以此方法保存的孢子囊可进一步用于黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜霜霉病菌生理小种分化、致病力的遗传变异等方面的研究。

(四)、具体实施方案

下面举例对本发明做更详细的描述：

具体实施方式一：采集黄瓜霜霉病新鲜病叶，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，在20℃～25℃，保湿24小时，待长出大量浓密新鲜的孢子囊之后，用消毒软毛刷将孢子囊刷入重量百分比浓度为10％二甲基亚砜与5％脱脂乳的水溶液的混合保存液中，然后在-20℃条件下保存。

具体实施方式二：采集黄瓜霜霉病新鲜病叶，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，在20℃～25℃，保湿24小时，待长出大量浓密新鲜的孢子囊之后，用消毒软毛刷将孢子囊刷入重量百分比浓度为10％二甲基亚砜与5％脱脂乳的水溶液的混合保存液中，然后在-70℃条件下保存。

具体实施方式三：采集黄瓜霜霉病新鲜病叶，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，在20℃～25℃，保湿24小时，待长出大量浓密新鲜的孢子囊之后，用消毒软毛刷将孢子囊刷入重量百分比浓度为10％二甲基亚砜与5％脱脂乳的水溶液的混合保存液中，先在-20℃条件下处理24小时，然后在-80℃条件下保存。

上述具体实施方式的步骤为：

1.菌种来源

采集来自田间发生黄瓜霜霉病的新鲜病叶，冲去叶面上的杂物和原有的孢子囊，在20℃～25℃，保湿24小时，待长出大量浓密新鲜的孢子囊之后，用于病菌的保存。

2.保存方法和步骤

用消毒软毛刷将孢子囊刷入10％二甲基亚砜和5％脱脂乳的混合保存液中，放入1.5ml ep管中。然后视具体条件，在-20℃、-70℃或先在-20℃条件下处理24小时，然后在-70℃的不同条件下进行保存。其中以先在-20℃条件下处理24小时，然后在-70℃条件下保存的方法保存效果最好。

保存一定时间后，当进行黄瓜品种的抗病性鉴定、黄瓜霜霉病菌生理小种分化、致病力的遗传变异等方面的研究时，可随时将保存在离心管保存液中的孢子囊从冰箱中取出，首先测定其孢子囊的萌发率及致病力，然后用于上述研究。

3.保存黄瓜霜霉病菌所需条件

在黄瓜霜霉病发生盛期采集黄瓜霜霉病病叶并进行上述处理。

-20℃和-70℃～-80℃冰箱。

黄瓜霜霉病菌孢子囊萌发及人工苗期接种致病性鉴定条件。

4.本发明的技术要点

本发明的技术要点之一是离体孢子囊保存在10％二甲基亚砜和5％脱脂乳的混合保存液中。二甲基亚砜又名甲基亚砜、亚硫酰基双甲烷，简称DMSO。是一种重要的精细化工原料，具有高极性、高吸湿性、高沸点及可燃性，毒性极低，热稳定性好，是一种强极性溶剂；二甲基亚砜的冰点是18.45℃，沸点是189.0℃，兼有高温溶剂和低温溶剂的双重作用。在医学上可用于骨髓、血液、器官低温保存的防冻剂等。本研究即根据二甲基亚砜的这一特点，用于霜霉病菌的保存。同时在保存液中加入一定量的脱脂乳，提供给病原菌以一定的营养，延长保存期。

本发明的技术要点之二是保存液中的孢子囊在低温下保存。可根据具体条件在-20℃、-70℃～-80℃或先在-20℃预处理24小时，然后在-70℃保存。其中以在-20℃条件下预处理24小时，然后在-70℃条件下保存的孢子囊致病力最强，保存效果最好。

5.保存一定时间后孢子囊的致病力测定方法

(1)孢子囊萌发率的测定

在灭菌的载玻片上滴入以上不同条件下保存的孢子囊溶液，放入垫有湿滤纸的无菌培养皿中20℃保温培养，从培养后1小时开始进行观察，每次观察10个视野。每个处理3次重复。记载孢子囊萌发率。以当年病叶新病斑上的孢子囊为对照。

(2)致病力测定方法

采用子叶人工接种方法测定孢子囊的致病性。寄主选用感病品种长春密刺。将其种子消毒后播种于灭菌土中，每处理设3次重复，共计30钵。在子叶期取保存于上述不同条件下的孢子囊悬浮液，浓度为2000个孢子囊/ml进行点滴接种，接种量为0.04ml。接种后置于保湿箱中防止空气中其他菌源污染。并保持温度白天为20℃～25℃，夜间10℃～15℃，相对湿度90％～100％，接种后7天调查发病率及病情指数。病情分级标准如下：

0级：无病症

1级：接种点有微小病斑，其直径小于0.5cm

2级：病斑直径0.5～1.3cm

3级：接种点黄化面积占整个面积的1/3以下，坏死斑占1/3以下

4级：坏死斑面积占整个面积的1/3～2/3

5级：坏死斑面积占整个面积的2/3以上或全株枯死

计算病情指数，公式为：