选择性切断生物体高分子的非共价键等并分析的方法和装置

摘要

本发明提供一种分析方法，其特征在于，通过利用电喷雾电离生物体样品溶液，同时向样品溶液照射红外激光光，使生物体高分子解离为其构成要素。这样，可以只选择性地切断生物体高分子的非共价键而进行分析。

说明书

技术领域

本发明涉及一种选择性切断生物体高分子的非共价键、其它键并分析的方法和装置。

背景技术

在质量分析装置等离子分析装置中，需要对待分析的样品进行电离。因而，在这些离子分析装置的前段设有电离装置。

电喷雾电离(ESI：electrospray ionization)法为离子分析装置中使用的电离法之一。

电喷雾电离(ESI)法作为可以使DNA或蛋白质等生物体高分子电离的方法之一被广泛使用。ESI法可以温和地电离DNA或蛋白质，以非共价键形成的多个DNA或蛋白质构成的配位化合物也可以以原有的形式电离。由于具有这样的特征，ESI法被用于生物体分子的结构功能分析。

生命活动是通过各种生物体分子相互作用而实现的。因而，在理解生命现象的基础上，利用生物体分子的相互作用形成的配位化合物的整个分子质量是重要的信息，了解其相互作用的强度也很重要。

为了通过质量分析来解析ESI法产生的配离子的分子间相互作用的强度，通常使用组合ESI法和碰撞活化的方法。该方法如下所述。即，用ESI法电离由多个生物体分子亚单元构成的配位化合物，观测配位化合物的分子量相关离子。接着，将该离子导入真空中，用电场加速该离子，使其与真空中的气体分子碰撞，进行碰撞活化，使其解离成形成配位化合物的各构成要素，考察已赋予的碰撞活化能和键的强度的相关关系。

如同酶与辅酶或药物受体与药物等那样，在是蛋白质-低分子化合物配位化合物的情况下，在该方法中蛋白质或低分子化合物不发生分解而只切断非共价键，从而各分子解离，可以考察相互作用的强度。

然而，如同双链DNA和蛋白质构成的配位化合物那样，静电相互作用或氢键成为配位化合物形成的主要因素，而且构成的分子的结构不十分稳定，此时，如果使用上述方法，不仅切断非共价键，还切断弱的共价键，其片断(fragment)也被合在一起观测。例如也可能切断双链DNA部分的共价键。这是因为，用于碰撞活化的能量被消耗在配位化合物的解离和碎裂(fragmentation)两方面。所以，得到的光谱变得复杂，在通常的ESI-碰撞活化的方法中，难以正确地定量解析相互作用的强度。例如参照下面的文献。

Activation Energies for Dissociation of Double Strand OligonucleotideAnions：Evidence for Watson-Crick Base Paring in Vacuo Schnier PD，Klassen JS，Strittmatter EF and Williams ER JACS(1998)120，9605-9613。

生物体高分子的离子分析中的另一个问题是，有时生物体样品溶液中会不可避免地含有界面活性剂。另外，为了提取例如脂溶性蛋白质，需要界面活性剂。如果在生物体样品溶液中含有界面活性剂，则ESI法难以气化蛋白质，难以电离。

发明内容

本发明提供一种可以只选择性地切断生物体高分子的非共价键并分析的方法。

本发明还提供一种选择性地切断包括生物体高分子的非共价键的各种键并进行分析的方法。

本发明还提供一种与是否存在界面活性剂无关而可以分析蛋白质等生物体高分子的方法。

本发明还提供一种适用于上述的选择性切断的分析装置。

利用本发明的生物体高分子的分析方法是，将含有生物体样品的溶液导入毛细管中，在施加的电场下向从毛细管的顶端流出的样品溶液照射第1红外激光光，使溶液中的生物体高分子解离成构成要素，将解离的构成要素离子或生物体高分子离子导入到分析装置的主要部分的方法。在生成的带电液滴中也会发生生物体高分子向构成要素的解离。分析装置的主要部分是指产生对已解离的构成要素离子或生物体高分子离子进行鉴定的数据的部分(通常该主要部分被称为分析装置)。作为一个例子，红外激光光是具有10.6μm的波长的激光。

利用电喷雾法，在电场下，从毛细管的顶端喷雾含有生物体高分子的样品溶液。利用第1红外激光光照射，由很多生物体分子构成的配位化合物在溶液中被分解为其构成要素(亚单元分子)。被分解的构成要素利用第1红外激光光照射，与电喷雾法相比，极大地促进了气相电离。另外，配位化合物只有其非共价键被红外激光光照射选择性地切断，其它共价键等不被切断。这样，作为配位化合物的构成要素的生物体分子不被断片化，而从配位化合物解离，而且促进气相离子的产生，所以通过将其导入分析装置的主要部分，配位化合物或生物体分子的高敏感度检测及其解析成为可能。另外，即使在生物体样品溶液中含有界面活性剂，通过第1红外激光光照射，生物体样品也容易气化、电离，所以可以进行其分析。

在切断没有被红外激光光切断的共价键等的情况下，向上述配位化合物或构成要素照射第2激光光。第2激光光的波长可以根据欲切断的键的种类等来确定。

根据需要，优选对生物体样品进行加热、冷却等温度控制。通过冷却，可以处理用通常的温度(例如室温)难以观测的非常弱的键构成的配位化合物。

另外，使激光光的强度改变，将在各激光光强度中产生的构成要素离子导入到分析装置的主要部分即可。由于激光光强度产生的构成要素离子不同，所以对阐明键的强度有帮助。

包括如下步骤即可：将在未照射第1红外激光光的状态下电离的生物体高分子导入到分析装置的主要部分的步骤；将在照射第1激光光的状态下产生的构成要素离子导入到分析装置的主要部分的步骤。

利用本发明的分析装置具备：供给样品溶液的毛细管；在上述毛细管的顶端部附近形成电场的机构；调整上述毛细管内或从上述毛细管喷雾的液滴的温度的机构；为了向上述毛细管的顶端部附近照射红外激光光而配置的第1红外激光光源；以及将从上述毛细管的顶端喷雾的样品的离子或利用上述红外激光光照射解离的构成要素离子导入到分析装置的主要部分的机构。在毛细管的顶端部附近形成电场的机构、调整温度的手段包括后述的如实施例所示的各种形式。将样品的离子或解离的构成要素离子导入到分析装置的主要部分的机构也可以是打开分析装置的离子导入孔的孔口(orifice)。

通过设置第2激光光源，共价键等键的切断也成为可能。另外，设置监视器装置，可以拍摄毛细管顶端部附近的样品溶液的喷雾状态。还可以设置各种温度调整装置、结构。

本发明还提供一种纳米激光喷雾装置。

附图说明

图1是表示第1实施例的分析装置的构成图。

图2表示利用电喷雾使生物体高分子(配位化合物)电离、利用红外激光照射解离成其构成要素的一个例子。

图3表示质量光谱。

图4是表示激光强度对离子强度特性的典型例子的曲线图。

图5表示含有界面活性剂的样品溶液的质量光谱。

图6是表示第2实施例的分析装置的构成图。

图7是表示第3实施例的分析装置的构成图。

图8是表示硅毛细管的截面图。

具体实施方式

第1实施例

图1是表示包括在质量分析装置的离子导入口附近安装的激光喷雾装置的分析装置的整体构成图。

在质量分析装置10的离子导入口的部分，安装有开有微细的孔11a的第1孔口11。微细的孔11a为离子导入口。质量分析装置10内被保持成真空。质量分析装置10内还进一步设置有在内方开有微细的孔12a的第2孔口12。在第1孔口11与第2孔口12之间设置有环形透镜(ring lens)13。在激光喷雾装置20产生的离子通过第1孔口11的孔11a，利用透镜13发生偏斜，通过第2孔口12的孔12a，向质量分析装置10的内部导入。

在质量分析装置10的器壁，以包围孔口11并将其覆盖的方式安装有激光喷雾装置20的外壳(housing)21。由外壳21和孔口11包围的空间为电离空间。电离空间内可以为大气压。但也可以将电离空间内保持为真空。整个质量分析装置10和激光喷雾装置20相当于本发明的分析装置。质量分析装置10相当于利用本发明的分析装置的主要部分。

设置有：贯通外壳21的壁并用于供给含有生物体高分子的生物体样品溶液的毛细管(细管)22；和包围该毛细管22的除了顶端部以外的外侧的外筒23。毛细管22的顶端部位于外壳21内的孔口11的孔11a的近旁。在外壳21的外部，毛细管22从外筒23向其外方导出。

在毛细管22的外周面与外筒23的内表面之间有间隙(间隔)，通过该间隙供给用于调整温度(加热或冷却用)(在促进液体样品的干燥的情况下，如果使气体干燥，则效果更佳)的辅助气体(N₂气)。外筒23的顶端部在外壳21的内部，在毛细管22的顶端的若干靠近之处形成锥形形状，直径变细，上述间隙变窄。被供给到上述间隙的辅助气体从外筒23的顶端部喷出到电离空间内。

向毛细管22的顶端部附近施加正或负的高电压。可以用导体形成毛细管22，向毛细管22施加高电压；在毛细管22为玻璃管那样的绝缘体的情况下，也可以在毛细管22的外周面蒸镀金属膜，向该金属膜施加高电压。也可以在毛细管22的内部插入施加了高电压的导电线。也可以向外筒23施加高电压。

这样，通过毛细管22和外筒23构成电喷雾装置。利用辅助气体(N₂气)冷却毛细管22内的溶液时，也可以将其称为冷喷雾。冷喷雾使键较弱的配位化合物的解析成为可能。

在外壳21的外部配置红外光激光装置31，从该激光装置31发射波长10.6μm的红外激光光，利用透镜33聚光，通过外壳21的开口或由透明体形成的窗，入射到外壳21内。激光装置31被配置成其发射的激光光沿着毛细管22的轴方向投射到毛细管22的顶端。也可以将激光装置31配置在毛细管22的侧方，将其发射的激光光从与毛细管22的轴方向垂直的方向投射到毛细管22的顶端部。在这种情况下，毛细管22的顶端部相对红外光为透明的。也可以将激光光照射到相对于毛细管22的顶端稍微外方的位置。

从毛细管22向其顶端部供给生物体样品溶液，该溶液与辅助气体一起从毛细管顶端喷雾。此时，生物体样品在由多种生物体分子(构成要素)构成的配位化合物(生物体高分子)的状态下被电离。通过在毛细管22的顶端部附近向含有配位化合物的生物体样品溶液照射红外激光光，配位化合物在其共价键不被切断的情况下，被选择性地切断非共价键，解离成其构成要素的离子。利用红外激光光照射也可以促进电离。配离子或已解离的构成要素的离子被从孔口11的孔11a导入到质量分析装置20内。

如果显示一个例子，如图2所示，利用电喷雾，生成样品中的双链DNA-蛋白质配离子。该配离子通过红外激光光照射，只被切断氢键(非共价键)，解离成蛋白质离子和2条单链DNA离子。单链DNA离子在红外激光光照射下不完全分解。此外，为了在第2图中容易理解，描绘成按照电离和向构成要素的解离这样的顺序发生，但实际上这些是同时发生的，或者在向构成要素解离之后发生电离的情况居多。配位化合物利用红外激光光照射在溶液(液滴)中解离成构成要素。

图3表示将红外激光光的输出从零(OFF)改变为1.2W、1.4W时得到的质量光谱。

如果加强照射的红外激光光的强度，则进行从双链DNA-蛋白质配离子向蛋白质离子的解离，在1.4W的激光照射下几乎观测不到配离子。表明DNA分子的共价键被切断的离子完全观测不到，可观测到2条单链DNA离子。

这样，利用红外激光光照射选择性地切断氢键或基于静电相互作用的非共价键。接着，通过改变照射的激光光的强度，可以解析依赖于分子间的静电相互作用的键或氢键的强度。

上述方法如下所述可以用于很多有效解析。

不仅是DNA-蛋白质配位化合物，而且在药物-DNA或药物-蛋白质的相互作用中，有静电相互作用或氢键成为主要原因而形成配位化合物的情况。特别是在造药中，从多个候补化合物筛选相互作用的药物时，如质量分析那样，只要可以使用混合物也适用且生产量高的方法，就可以缩短药品的候补化合物的缩减所需要的时间，是极为有效的。例如混合分子量不同的10种候补化合物和作为目标的双链DNA，首先，用ESI法检测配位化合物的离子。从观测的分子量相关离子的质量进行判断，在该阶段分清可以由10种候补化合物构成的配位化合物的化合物。接着，进行红外光激光照射，改变此时照射的激光强度，解析配离子解离的形态。可以从激光强度的变化，对配离子的解离容易度进行排序。

图4是表示对于某种特定离子，离子强度的激光光强度依赖性的典型例子的曲线图(毛细管22为不锈钢制，其内径为0.1mm、外径为0.2mm、激光点直径0.3mm的情况)。根据生物体样品的种类或生物体样品中解离的离子，激光光强度不同，激光光强度对离子强度大致显示如图4所示的特性。如果激光强度比某值大，离子强度急剧地减少。这是因为，如果从毛细管22的顶端出来的样品溶液被激光光照射而气化，则不锈钢制毛细管的内部几乎不存在电场，所以样品溶液作为带电液滴已经变成不从毛细管22顶端喷雾。

在改变红外激光光输出(激光光强度)，检测目标离子中，发现最佳激光光强度很重要。

图5是表示对于含有界面活性剂10mM(摩尔)的10^-5M的细胞色素C，在激光光的输出为零(OFF即电喷雾)的情况和为1.0W的情况下得到的质谱图。

在激光光为OFF的情况下，只有杂质离子(例如m/z 229.22630)占优势。

与此相对，如果照射1.0W的红外激光光，表现出在细胞色素C分子附加n个质子的多价离子(M+nH)ⁿ⁺(n＝5～12)的光谱(m/z 607.32437为杂质离子)。

即使存在这样的界面活性剂，也可以通过照射红外激光光，高敏感度地检测出蛋白质等生物体(高)分子离子。

第2实施例

图6是表示第2实施例的激光喷雾装置的图。向与图1所示的结构相同的部件附加相同的符号，避免重复说明。

在毛细管22的外侧，除了第1外筒23之外，在毛细管22的顶端部，第2外筒24设置在第1外筒23的外侧并隔着间隔。两外筒23、24的顶端部在毛细管22的顶端部附近变为尖细开口。

在该实施例中，温度调整装置40具备液氮的桶(tank)41。已气化的氮气从桶41被送至供给管42。供给管42分支为2个支管43、44。这些支管43、44与外筒23、24连接。在各支管43、44，以可以分别独立地操作、控制的方式设置有流量调节阀45、46和加热器47、48。

最典型的使用方法是，与供给到第1外筒23的氮气相比，供给到第2外筒24的氮气更冷(例如0℃左右)。用流向第1外筒23的氮气预冷被导入到毛细管22的生物体样品溶液，在从毛细管22喷雾时，用从第2外筒24喷射的氮气冷却到需要的温度(例如0℃)。

在外壳21的壁设置Peltier元件50。将整个电离空间(室)内冷却到需要的温度。

也可以与上述相反，使供给到第1、第2外筒23、24的气体高于室温，加热样品。对于电离空间也是一样。这样，电离空间也进行温度调整，所以其外壳21在孔口11的附近借助热绝缘体14，被安装在质量分析装置10的器壁上。

设置用于将在毛细管22的顶端部产生的配离子或构成要素离子导入到孔口11的孔11a的弯曲的筒状引导机构38。在该筒状引导机构38开有使红外激光光通过的孔。

为了观察毛细管22的顶端部的样品的喷雾状态，在外壳21安装包括CCD摄像元件的监视器装置60，毛细管22的顶端部的状态被拍摄为动态图像，并显示出来。

在该实施例的激光喷雾装置设置有第2激光装置32。从第2激光装置32发射的激光光通过透镜34，在面对孔口11的孔11a的电离空间侧的位置。

在毛细管顶端部产生的配离子或其构成要素离子从引导机构38通过孔口11的孔11a，被导入到质量分析装置10内，在即将被导入到质量分析装置10内之前，通过照射第2激光光，切断上述非共价键以外的键、例如蛋白质的共价键。这样，例如氨基酸序列的解析成为可能。

第2激光32可以使用与应该切断的键的种类相对应的波长的(红外、紫外或可见)光。

此外，在图6中，第1激光装置31的第1激光光与第2激光装置32的第2激光光被平行图示，这是因为，为了便于图示，第2激光装置32优选被配置为第2激光光垂直于纸面。

第3实施例

图7表示纳米激光喷雾装置。

毛细管22A通过玻璃被形成得极细，顶端部的内径为1～10μm左右。极少的样品溶液被装入到毛细管22A内，毛细管22A的后端为栓22a。

通过栓22a，金属线(导电线、代表性的铂线)70从毛细管22A的后端被插入到毛细管22A内。金属线70只要被插入到毛细管22A的长度方向的中间附近就足够。利用高电压发生装置71向金属线70施加高电压。只要金属线70与毛细管22A内的样品溶液相接触，该高电压通过具有导电性的样品溶液，被施加到其顶端部。也可以代替插入金属线，而在毛细管22A的顶端部的外面蒸镀金属膜，向该金属膜施加高电压。

利用在毛细管22A的顶端部施加的高电压，保持样品溶液从毛细管11A的顶端突出的状态。向从毛细管22A的顶端朝外方突出的样品溶液，照射来自红外光激光装置31的红外激光光。红外激光光不被照射到毛细管22A的顶端，即使照射，为相当于其周边的一部分的程度即可。

毛细管22A被保持在支持器72内，该支持器72被保持在温度调整模块(block)73内。在模块73内安装有Peltier元件74，控制模块73的温度。这样，将毛细管22A内的样品溶液保持在需要的温度。

代替使用玻璃毛细管，如图8所示，也可以在硅基板80形成一个或多个毛细管80A。毛细管80A为与硅基板80形成一体的极细(内径10μm左右)的筒状体，与在基板80开的孔连通。在该孔中，利用细管81，从基板80的内侧，将样品溶液导入到毛细管80A。红外激光光如A所示从毛细管80A的横向(与毛细管80A的轴方向正交的方向)向毛细管80A(的顶端部)照射，或者如B所示从斜前方向毛细管80A(的顶端部)照射。由于硅几乎不吸收10.6μm的红外光，所以红外激光光即使直接照射硅毛细管80A，毛细管80A也不被破坏。红外激光光照射硅毛细管80A的顶端部，加热毛细管80A的内部的样品溶液，使非共价性配位化合物分解。分解产生的构成要素(亚单元分子)利用被施加到硅毛细管顶端的高电场增大电离的效率。只要向硅基板80施加高电压即可。另外，可以利用Peltier元件等对硅基板80进行温度调节。