一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法，包括铺胶、细胞裂解、解旋与电泳、中和洗涤、荧光染色步骤，其中所述铺胶步骤所铺制的凝胶为两层；所述荧光染色步骤采用非对称花青类染料即SGD染料溶液，所述SGD染料溶液是将SYBR Gold染料用二甲基亚砜以1∶10000的体积比稀释的溶液。本发明还提供一种专门用于实施上述样品制备方法的试剂盒，包括7种配置好的试剂及6片处理好的磨砂载玻片。本发明采用SGD染料溶液进行荧光染色，无毒无害，产生的实验废物不会污染环境，且具有更高的荧光灵敏度；所铺制的凝胶只有两层胶，与传统样品玻片要铺三层凝胶的工艺相比，样品制备工艺简单，易于操作，成功率高。

说明书

技术领域

本发明涉及细胞检测技术，特别涉及一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法及用于实施该方法的试剂盒。

背景技术

单细胞凝胶电泳图像分析(single cell gel electrophoresis，SCGE)技术，又称彗星检测法(comet assay)，是一种80年代末发展起来的研究和定量检测单个细胞DNA损伤的简单、灵敏、快速的新技术。在有关因子诱发下，细胞的DNA若受到损伤，会引起其高级结构变化，致使其超螺旋结构松散。当细胞发生原位裂解、DNA解旋等现象时，损伤的DNA片段在电泳时会从核中移出，向阳极迁移并呈现尾形分布，而细胞无损部分仍保持球形。经荧光染料染色后，可用荧光显微镜观察到这些细胞形成彗星状图样；而且一定条件下，DNA的迁移距离(表现为彗星尾长度)和DNA的迁移含量(表现为荧光强度)的分布与DNA损伤程度相关，此即为单细胞凝胶电泳图像分析技术的研究和定量分析的基础。

目前世界上通用的方法是采用Singh NP等建立和改进的碱性单细胞凝胶电泳图像分析(alkaline single cell gel electrophoresis，ASCGE)技术，一方面在高pH值碱性条件下，细胞DNA中碱易变性部位和断链更易出现，还可促使RNA降解，所以检测的灵敏度较高；另一方面，利用碱性条件溶解细胞和电泳，提高了检测的敏感性；此外，能同时检测DNA双链断裂和单链断裂，并通过加入特定的DNA内切酶来确定DNA链上的易感位点，从而使该技术的应用范围极广泛。与其它DNA链断裂检测技术，如原位杂交技术、高效毛细管电泳技术、高效液相色谱、气相色谱—质谱法等相比较，单细胞凝胶电泳图像分析技术具有敏感、快速、简便、重复性好、低耗等特点。因而，单细胞凝胶电泳图像分析迅速成为流行的DNA损害检测方法，广泛应用于遗传毒理学、职业与环境生物监测、辐射生物学、肿瘤学、老年学、环境生态学以及与氧化应激和细胞凋亡有关的多种病理过程研究；并可进行药物对DNA损伤的抑制和修复检验、肿瘤放疗化疗疗效评估检验、辐射对细胞DNA的损伤检验、病毒对细胞的DNA损伤检验、疾病的定性定量诊断和疗效分析、以及公安法医毒物分析等。

用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备基本步骤包括：(1)样品凝胶玻片的铺胶；(2)细胞裂解；(3)解旋与电泳；(4)中和洗涤；(5)荧光染色。制备好的样品玻片就可利用单细胞凝胶电泳图像分析系统来摄录分析细胞的荧光图像，并对DNA的损伤程度进行评价。长期以来单细胞凝胶电泳图像分析的样品玻片一般都是采用溴化乙锭(Ethidium Bromide，EB)作为核酸染料进行荧光染色的，但是EB的强致癌性不仅威胁到使用者的健康，而且实验废物又难以处理，污染环境。此外，现有单细胞凝胶电泳图像分析的样品玻片要铺三层凝胶，制备工艺较复杂，其它的制备步骤也较为繁琐，造成常常难以制备出合适的样品，也影响了这种方法的推广与应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点，提供一种无毒、安全、灵敏度高、工艺简单的用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种用于实施上述方法的试剂盒。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法，包括铺胶、细胞裂解、解旋与电泳、中和洗涤、荧光染色步骤；其中所述铺胶步骤所铺制的凝胶为两层；所述荧光染色步骤采用非对称花青类染料溶液(SGD染料溶液)。所述非对称花青类染料溶液(SGD染料溶液)是将非对称花青染料SYBRGold用二甲基亚砜(DMSO)以1∶10000的体积比稀释的溶液。

所述铺胶步骤，是先将磨砂载玻片在38～42℃预热，然后将1％常熔点琼脂糖凝胶均匀涂覆在磨砂载玻片上，并在低温下固化，得到铺有第一层凝胶的玻片；再将含有待测细胞的培养液与0.8％低熔点琼脂糖凝胶在36～38℃温度下预热并混匀，再涂覆在所述铺有第一层凝胶的玻片上，盖上一个盖玻片，并置于低温下固化，然后移去盖玻片，得到铺有两层凝胶的玻片。所述磨砂载玻片是经过水磨砂纸(粒度No.380)加水单面打磨，具有均匀磨砂面的玻片。所述1％常熔点琼脂糖凝胶(NMP)和0.8％低熔点琼脂糖凝胶(LMPA)均是用不含钙、镁的磷酸缓冲溶液(PBS)配制而成的。所述含有待测细胞的培养液与0.8％低熔点琼脂糖凝胶的用量体积比为1∶3～5。

所述细胞裂解步骤，是将所述铺有两层凝胶的玻片浸入2～6℃的细胞裂解液中50-70分钟，得到细胞裂解后的玻片。所述细胞裂解液是由Tris缓冲液(10mM，pH＝10)、体积分数为10％的二甲基亚砜、和体积分数为1％的Triton X-100组成；所述Tris缓冲液是由10mM Trizma base、2.5M NaCl和100mM Na₂ EDTA组成；所述Triton X-100是在玻片浸入前才加入到细胞裂解液中。

所述解旋与电泳步骤，是先用电泳液冲洗所述细胞裂解后的玻片，然后将玻片置于装有预冷电泳液的电解槽中静置25～40分钟，再进行电泳，得到电泳后的玻片。所述电泳液是由300mM NaCl与1mM Na₂ EDTA配制的，pH＞13。所述电泳电压为20～30V，电流为250～350mA，温度为2～6℃，电泳时间为25～40分钟。

所述中和洗涤步骤，是将所述电泳后的玻片放入Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)中4～6分钟，取出后用蒸馏水反复冲洗，以中和强碱和洗掉污漬，随后将其晾干，得到中和后的玻片。

所述荧光染色步骤，是在所述中和后的玻片上滴加SGD染料溶液，染色8～12分钟后再用Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)冲洗多余的染料溶液。

一种专门用于实施上述用于单细胞凝胶电泳图像分析的样品制备方法的试剂盒，包括7种配置好的试剂及若干片处理好的磨砂载玻片：所述试剂1为非对称花青类染料溶液(SGD染料溶液)；所述试剂2为1％常熔点琼脂糖凝胶；所述试剂3为0.8％低熔点琼脂糖凝胶；所述试剂4为细胞裂解液的其中一个组分，即10mM Tris缓冲液(10mM Trizma base，2.5M NaCl，100mM Na₂ EDTA，pH＝10)；所述试剂5为细胞裂解液的另一个组分，即10ml体积分数为10％的二甲基亚砜和1ml体积分数为1％的TritonX-100，其中Triton X-100是使用前加入的；所述试剂6为电泳液，所述电泳液是由300mM NaCl与1mM Na₂ EDTA混合的溶液；所述试剂7为中和缓冲液，所述的中和缓冲液为0.4M，pH＝7.5的Tris缓冲液。

本发明与现有技术相比具有如下优点和效果：

(1)本发明采用非对称花青类染料溶液(SGD染料溶液)进行荧光染色，由于非对称花青类染料溶液无毒无害，使用安全可靠，产生的实验废物不会污染环境，而且具有比EB染料更高的荧光灵敏度。

(2)本发明的铺胶步骤所铺制的凝胶只需两层胶，与传统单细胞凝胶电泳图像分析的样品玻片要铺三层凝胶的工艺相比，本发明的样品制备工艺简单，易于操作，成功率高。

(3)本发明工艺制备的样品只有两层电泳凝胶，使得在进行单细胞凝胶电泳图像分析时，对荧光的衰减减少，提高了生成的彗星图像亮度，提高了实验的灵敏度和图像质量。

附图说明

图1是采用本发明方法对不同浓度H₂O₂作用下的人外周血淋巴细胞制备的样品玻片的单细胞凝胶电泳图像。

图2是采用本发明方法对不同浓度H₂O₂作用下的人外周血淋巴细胞制备的样品玻片获得的H₂O₂染毒致淋巴细胞DNA损伤剂量与效应关系图。

图3是采用本发明方法对不同浓度H₂O₂作用下的小鼠骨髓细胞制备的样品玻片的单细胞凝胶电泳图像。

图4是采用本发明方法对不同浓度H₂O₂作用下的小鼠骨髓细胞制备的样品玻片获得的H₂O₂染毒致骨髓细胞DNA损伤剂量与效应关系图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

(1)制备淋巴细胞样品。从年轻健康无吸烟史、无近期服药史的男性志愿者身上抽取静脉血2ml，用肝素抗凝。然后吸取稀释血加在淋巴细胞分离液上(1∶1)，2000r/m离心20min。吸取淋巴细胞层，用PBS液洗涤两次，1500r/m，10min。沉淀物用RPM1-1640稀释成悬液，作计数(1×107/mL)。然后以H₂O₂染毒：分为6个剂量组，H₂O₂终浓度分别为50μM、100μM、150μM、200μM、400μM、800μM，另设空白对照组(0组)，置于37℃水浴1h，制成淋巴细胞样品。

(2)铺胶。将一个磨砂载玻片在40℃下预热，然后将用不含钙、镁的磷酸缓冲溶液(PBS)配制的1％常熔点琼脂糖凝胶均匀涂覆在磨砂载玻片上，并在低温下固化，得到铺有第一层凝胶的玻片。将20μl淋巴细胞样品与80μl用不含钙、镁的磷酸缓冲溶液(PBS)配制的0.8％低熔点琼脂糖凝胶(LMPA)在37℃下预热并混匀，再涂覆在所述铺有第一层凝胶的玻片上，盖上一个盖玻片，并置于低温下固化，然后移去盖玻片，得到铺有两层凝胶的玻片。

(3)细胞裂解。随后将铺有两层凝胶的玻片浸入4℃的细胞裂解液中1小时，得到细胞裂解后的玻片。所述细胞裂解液是由Tris缓冲液(10mM，pH＝10)、体积分数为10％的二甲基亚砜、和体积分数为1％的Triton X-100组成；所述Tris缓冲液是由10mM Trizma base、2.5M NaCl和100mM Na₂EDTA组成；所述Triton X-100是在玻片浸入前才加入到细胞裂解液中。

(4)解旋与电泳。先用电泳液冲洗细胞裂解后的玻片，然后将玻片置于装有预冷电泳液的电解槽中静置30分种，再在电泳电压为25V、电流为300mA、温度为4℃条件下，进行电泳30分钟，得到电泳后的玻片。所述电泳液是由300mM NaCl与1mM Na₂ EDTA配制的，pH＞13。

(5)中和洗涤。将电泳后的玻片放入Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)中5分钟，取出后用蒸馏水反复冲洗，以中和强碱并洗掉污漬，随后将其晾干，得到中和后的玻片。

(6)荧光染色。在中和后的玻片上滴加SGD染料溶液，染色10分钟后再用Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)冲洗掉多余的染料溶液。所述SGD染料溶液是将非对称花青染料SYBR Gold用二甲基亚砜(DMSO)以1∶10000的体积比稀释的溶液。

(7)摄取图像。最后将制得的六个样品玻片和一个空白对照玻片置于尼康TE300倒置荧光显微镜下以495nm波长的光为激发光获得荧光图像并摄取图像。

用于本实施例的试剂盒，包括上述7种配置好的试剂，及6片处理好的磨砂载玻片。其中所述试剂1为SGD染料溶液；所述试剂2为1％常熔点琼脂糖凝胶；所述试剂3为0.8％低熔点琼脂糖凝胶；所述试剂4为细胞裂解液的其中一个组分，即10mM Tris缓冲液(10mM Trizma base，2.5M NaCl，100mM Na₂ EDTA，pH＝10)；所述试剂5为细胞裂解液的另一个组分，即10ml体积分数为10％的二甲基亚砜和1ml体积分数为1％的TritonX-100，其中Triton X-100是使用前加入的；所述试剂6为电泳液，所述电泳液是由300mM NaCl与1mM Na₂ EDTA混合的溶液；所述试剂7为中和缓冲液，所述的中和缓冲液为0.4M，pH＝7.5的Tris缓冲液。

如图1所示。本实施例制备的样品显示的图像清晰，有较高的荧光亮度，且与背景有较高的对比度。损伤的DNA碎片均定向脱离细胞核形成拖尾，形成典型的彗星图像。各损伤的DNA碎片显示清楚，有较高的分辨率。采用单细胞凝胶电泳图像分析软件(IMI.1彗星图像分析系统)测定其有关彗星参数可得：彗星尾长(Tail Extent)、彗星尾DNA百分含量(Tail％DNA)、Olive彗星尾矩(Olive Tail Moment)、彗星尾头比(Ratio of Tail/Head)。通过这些慧星参数可以计算得到淋巴细胞样品的DNA损伤程度，如图2所示，其结果表明细胞DNA损伤程度与H₂O₂的剂量有很好的量效关系。

实施例2

(1)制备骨髓细胞样品。从5～6周龄雄性、体重22～25g的昆明小鼠(广州实验动物中心)的股骨取骨髓细胞，用PBS液洗涤两次骨髓细胞，然后采用1500r/m转速离心10分钟。离心分离后的沉淀物用RPMI-1640稀释成悬液，作计数(1×107/mL)；然后以H₂O₂染毒并分为6个剂量组，H₂O₂终浓度分别为50μM、100μM、150μM、200μM、400μM、800μM，另设空白对照组(0组)，置于37℃水浴1小时，制成骨髓细胞样品。

(2)铺胶。将一个磨砂载玻片在41℃下预热，然后将用不含钙、镁的磷酸缓冲溶液(PBS)配制的1％常熔点琼脂糖凝胶均匀涂覆在磨砂载玻片上，并在低温下固化，得到铺有第一层凝胶的玻片。将20μl淋巴细胞样品与80μl用不含钙、镁的磷酸缓冲溶液(PBS)配制的0.8％低熔点琼脂糖凝胶(LMPA)在36℃下预热并混匀，再涂覆在所述铺有第一层凝胶的玻片上，盖上一个盖玻片，并置于低温下固化，然后移去盖玻片，得到铺有两层凝胶的玻片。

(3)细胞裂解。随后将铺有两层凝胶的玻片浸入3℃的细胞裂解液中70分钟，得到细胞裂解后的玻片。所述细胞裂解液是由Tris缓冲液(10mM，pH＝10)、体积分数为10％的二甲基亚砜、和体积分数为1％的Triton X-100组成；所述Tris缓冲液是由10mM Trizma base、2.5M NaCl和100mMNa₂ EDTA组成；所述Triton X-100是在玻片浸入前才加入到细胞裂解液中。

(4)解旋与电泳。先用电泳液冲洗细胞裂解后的玻片，然后将玻片置于装有预冷电泳液的电解槽中静置40分种，再在电泳电压为28V、电流为280mA、温度为3℃条件下，进行电泳35分钟，得到电泳后的玻片。所述电泳液是由300 mM NaCl与1mM Na₂ EDTA配制的，pH＞13。

(5)中和洗涤。将电泳后的玻片放入Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)中5分钟，取出后用蒸馏水反复冲洗，以中和强碱并洗掉污漬，随后将其晾干，得到中和后的玻片。

(6)荧光染色。在中和后的玻片上滴加SGD染料溶液，染色12分钟后再用Tris缓冲液(0.4M，pH＝7.5)冲洗掉多余的染料溶液。所述SGD染料溶液是将非对称花青染料SYBR Gold用二甲基亚砜(DMSO)以1∶10000的体积比稀释的溶液。

(7)摄取图像。最后将制得的六个样品玻片和一个空白对照玻片置于尼康TE300倒置荧光显微镜下以495nm波长的光为激发光获得荧光图像并摄取图像。

用于本实施例的试剂盒，包括上述7种配置好的试剂，及6片处理好的磨砂载玻片。其中所述试剂1为SGD染料溶液；所述试剂2为1％常熔点琼脂糖凝胶；所述试剂3为0.8％低熔点琼脂糖凝胶；所述试剂4为细胞裂解液的其中一个组分，即10mM Tris缓冲液(10mM Trizma base，2.5M NaCl，100mM Na₂ EDTA，pH＝10)；所述试剂5为细胞裂解液的另一个组分，即10ml体积分数为10％的二甲基亚砜和1ml体积分数为1％的Triton X-100，其中Triton X-100是使用前加入的；所述试剂6为电泳液，所述电泳液是由300mM NaCl与1mM Na₂ EDTA混合的溶液；所述试剂7为中和缓冲液，所述的中和缓冲液为0.4M，pH＝7.5的Tris缓冲液。

如图3所示。本实施例制备的样品摄取的图像清晰，有较高的荧光亮度，且与背景有较高的对比度。损伤的DNA碎片均定向脱离细胞核形成拖尾，形成典型的彗星图像。各损伤的DNA碎片显示清楚，有较高的分辨率。采用单细胞凝胶电泳图像分析软件(IMI.1彗星图像分析系统)测定其有关彗星参数可得：彗星尾长(Tail Extent)、彗星尾DNA百分含量(Tail％DNA)、Olive彗星尾矩(Olive Tail Moment)、彗星尾头比(Ratio of Tail/Head)。通过这些慧星参数可以计算得到骨髓细胞样品的DNA损伤程度，如图4所示，其结果表明细胞DNA损伤程度与H₂O₂的剂量有很好的量效关系。