一种兼性厌氧趋磁细菌及其分离、纯培养方法和磁小体的提取、纯化方法

摘要

一种趋磁细菌，该细菌是从含铁矿比较丰富的水域中提取的泥水样品中分离出来的，现已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M205105，分类命名为：Magnetotactic bacterium MB－TZ。其特征在于该趋磁细菌MB－TZ为兼性厌氧细菌，菌体形态为圆杆状，产生圆形磁小体，每一菌体含3－20颗磁小体，磁小体的主要元素组成为铁、钙、磷、氧、镁。该趋磁细菌MB－TZ具有生产周期短、易于培养、便于工业化生产的优点，在对磁小体进行提取和纯化时，使用了反复冻融和超声波相结合的处理方法，使菌体溶解得更为彻底，提高了磁小体的收率。

说明书

技术领域

本发明涉及一种能产生磁小体(Magnetosome)的趋磁细菌(Magnetotacticbacterium，简称MB)，以及该趋磁细菌的分离、纯培养方法和由该趋磁细菌提取、纯化磁小体的方法。

趋磁细菌MB-TZ是从含铁矿比较丰富的水域中提取的泥水样品中分离出来的，该趋磁细菌MB-TZ兼性厌氧、易于培养、生长周期短。现已在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2005年9月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 205105，分类命名为：Magnetotactic bacteriumMB-TZ。

背景技术

趋磁细菌是一类能在菌体内形成纳米级磁性颗粒——磁小体，并能在外部磁场的作用下朝着磁极的一端进行运动的细菌。从趋磁细菌中提取、纯化的磁小体是单磁畴晶体，由于其具有巨大的表面积与体积比、颗粒均匀、颗粒外被一层生物膜包裹、不易发生聚集、不具细胞毒等特点，使这种纳米级的磁性颗粒在电子通讯、化工、医药卫生、生物技术等高新科技领域有着广泛的潜在应用价值，成为一种新型的有着广阔发展前景的微生物资源。特别是在近年，由于纳米技术的兴起，更对趋磁细菌及磁小体的研究起到了有力的推动作用。但由于趋磁细菌对培养基营养的质量要求和对氧分压大小的要求十分严格，在大规模培养，找到性状更优良的产生磁小体的菌种和更有效的提取、纯化磁小体的方法，仍然是难题。中国专利ZL02115867.3和ZL02115868.1分别提出了“一种淤泥趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法”和“一种铁矿趋磁细菌及其分离纯化和制备磁小体的方法”，虽然能够得到生物来源的磁小体，但由于所用的趋磁细菌为厌氧细菌，必须在密封状态下进行分离纯化。因此，存在工艺要求高、生产设备复杂的缺点，尤其是制备磁小体的过程需要45--85天，存在生产周期长、难以实现工业化生产的不足。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种能产生磁小体的、新的趋磁细菌MB-TZ。

本发明的另是一个目的是提供一种趋磁细菌MB-TZ的分离、纯培养方法和提取、纯化磁小体的方法。

本发明的趋磁细菌MB-TZ已在中国典型培养物保藏中心保藏，地址：中国·武汉·武汉大学，保藏日期：2005年9月20日，保藏编号：CCTCC NO：M 205105，分类命名为：Magnetotactic bacterium MB-TZ。其特征在于该趋磁细菌MB-TZ为兼性厌氧细菌，菌体形态为园杆状，产生园形磁小体，每一菌体含3--20颗磁小体，磁小体的主要元素组成为铁、钙、磷、氧、镁。

趋磁细菌MB-TZ的分离、纯培养方法按下列步骤：

1)趋磁细菌MB-TZ的富集培养：

①在水域中取含趋磁细菌MB-TZ的泥水样品装入试剂瓶中；

②按每升上述泥水样品加入琥珀酸钠1克、硝酸钠0.25克、醋酸钠0.2克、巯基乙酸钠0.075克、维生素混合液10毫升、无机盐混合液10毫升和0.01mol/L奎尼酸铁1毫升，混均后，将瓶塞松松地盖上；

③置于28℃避光培养30天；

2)趋磁细菌MB-TZ单菌落的分离：

①用无菌吸管在泥水样品水与泥的交界面取泥水样，进行连续稀释，然后从各稀释度中各取1ml稀释液到无菌的平皿中，用半固体分离培养基倒平板；

②待平皿里的半固体分离培养基冷却凝固后，将平板置于25-28℃培养5-7天；

③挑选单菌落接入内装有生长培养基的小试管中，置于25-28℃培养5-7天，再对小试管中的培养液进行连续稀释，然后从各稀释度中各取1ml稀释液到无菌的平皿中，用半固体分离培养基倒平板，挑选单菌落即得到纯化的趋磁细菌MB-TZ。

上述泥水样品中泥与水的比例为1∶4。

上述维生素混合液每升的组份为：生物素2毫克、叶酸2毫克、比哆醇盐酸盐10毫克、核黄素5毫克、维生素B₁5毫克、烟酸5毫克、D-泛氨酸0.1毫克、维生素B₁₂0.1毫克、对-氨基苯甲酸5毫克、硫辛酸5毫克、余者为水。

上述无机盐混合液每升的组份为：氮川三乙酸1.5克、硫酸镁3.0克、硫酸锰0.5克、氯化钠1.0克、硫酸亚铁0.1克、氯化钙0.1克、氯化钴0.1克、硫酸锌0.1克、硫酸铜0.01克、硫酸铝钾0.01克、硼酸0.01克、钼酸钠0.01克、余者为水。

上述生长培养基每100毫升的组份为：维生素混合液1毫升、无机盐混合液1毫升、维生素B₁₂1毫升、刃天青(200微克/ml)1毫升、奎尼酸铁(0.01mol/L)0.25毫升、硝酸钠10毫克、氯化铵10毫克、无水乙酸钠20毫克、琥珀酸钠200毫克、磷酸二氢钾68毫克、磷酸氢二钾114毫克、巯基乙酸钠5毫克、余者为水，113℃灭菌20分钟。

上述半固体分离培养基每100毫升的组份为：在生长培养基中加入0.8克的琼脂，113℃灭菌20分钟。

趋磁细菌MB-TZ提取、纯化磁小体的方法按下列步骤：

1)趋磁细菌MB-TZ的扩大培养：

①在试管中加入生长培养基，113℃灭菌20分钟，静置10--20小时后接入已纯化好的趋磁细菌MB-TZ菌种；

②将上述试管置于25-30℃中，避光培养7--10天；

③在三角锥瓶中加入扩大培养基，113℃灭菌20分钟，静置10--20小时后，将上述试管中生长良好的趋磁细菌MB-TZ接入三角锥瓶中；

④将上述已接种的三角锥瓶置于25-30℃中，避光培养10-15天；

⑤将上述培养好的趋磁细菌MB-TZ用6000转/分离心10分钟，去除上清液；

⑥将沉淀物悬浮于PH为7.2的磷酸盐缓冲液中；

2)磁小体的提取、纯化：

①将上述趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液置于-20℃冰箱中冷冻24小时；

②将冷冻后的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液置于37℃使其骤融，并如此反复冻融3--5次；

③经反复冻融后的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液再用超声波处理，反复处理3--5次；

④将经过反复冻融和超声波处理的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液用孔径为6μM滤纸过滤；

⑤将上述滤液经40--80％蔗糖密度梯度离心，转速为6000转/分、时间为10--20分钟，收集磁小体带即制成由趋磁细菌MB-TZ来源的磁小体。

上述扩大培养基每100毫升的组份为：维生素混合液1毫升、无机盐混合液1毫升、维生素B₁₂(5微克/ml)1毫升、奎尼酸铁(0.01mol/L)0.3毫升、刃天青(200微克/ml)1毫升、巯基乙酸钠5毫克、琥珀酸钠300毫克、无水乙酸钠20毫克、硝酸钠10毫克、氯化铵10毫克、磷酸二氢钾68毫克、磷酸氢二钾114毫克、余者为水，113℃灭菌20分钟。

上述维生素混合液的组份和无机盐混合液的组份分别与趋磁细菌MB-TZ的分离、纯培养方法中所用的维生素混合液的组份和无机盐混合液的组份相同。

本发明的优点在于：趋磁细菌MB-TZ对培养环境中氧分压的要求不高，并具有兼性厌氧特性，因此，对分离纯化的工艺要求不高、不用在密封状态下进行生产，设备简单，尤其是制备磁小体的过程仅需22--30天，具有生产周期短、易于培养、便于工业化生产的优点，在对磁小体进行提取和纯化时，使用了反复冻融和超声波相结合的处理方法，使菌体溶解得更为彻底，提高了磁小体的收率。

具体实施方式

趋磁细菌MB-TZ的分离、纯培养方法按下列步骤：

1)趋磁细菌MB-TZ的富集培养：

①在含铁矿比较丰富的淡水湖泊中取含趋磁细菌MB-TZ的泥水样品约1升装入试剂瓶中，其中，泥与水的比例为1∶4；

②在上述泥水样品加入琥珀酸钠1克、硝酸钠0.25克、醋酸钠0.2克、巯基乙酸钠0.075克、维生素混合液10毫升、无机盐混合液10毫升和0.01mol/L奎尼酸铁1毫升，混均后，将瓶塞松松地盖上；

③置于28℃避光培养30天；

2)趋磁细菌MB-TZ单菌落的分离：

①用无菌吸管在泥水样品水与泥的交界面，朝北的一边取1ml泥水样(趋磁细菌具有成团并偏向于培养瓶北边生长的特点)，进行10倍连续稀释，然后再从第二到第五个稀释度中各取1ml稀释液到无菌的平皿中，用半固体分离培养基倒平板；

②待平皿里的半固体分离培养基冷却凝固后，将平板置于25-28℃培养5-7天；

③挑选单菌落接入内装有生长培养基的小试管中，置于25-28℃培养5-7天，再对小试管中的培养液进行连续稀释，然后从各稀释度中各取1ml稀释液到无菌的平皿中，用半固体分离培养基倒平板，挑选单菌落即得到纯化的趋磁细菌MB-TZ。

上述维生素混合液每升的组份为：生物素2毫克、叶酸2毫克、比哆醇盐酸盐10毫克、核黄素5毫克、维生素B₁5毫克、烟酸5毫克、D-泛氨酸0.1毫克、维生素B₁₂0.1毫克、对-氨基苯甲酸5毫克、硫辛酸5毫克、余者为水。

上述无机盐混合液每升的组份为：氮川三乙酸1.5克、硫酸镁3.0克、硫酸锰0.5克、氯化钠1.0克、硫酸亚铁0.1克、氯化钙0.1克、氯化钴0.1克、硫酸锌0.1克、硫酸铜0.01克、硫酸铝钾0.01克、硼酸0.01克、钼酸钠0.01克、余者为水。

上述生长培养基每100毫升的组份为：维生素混合液1毫升、无机盐混合液1毫升、维生素B₁₂1毫升、刃天青(200微克/ml)1毫升、奎尼酸铁(0.01mol/L)0.25毫升、硝酸钠10毫克、氯化铵10毫克、无水乙酸钠20毫克、琥珀酸钠200毫克、磷酸二氢钾68毫克、磷酸氢二钾114毫克、巯基乙酸钠5毫克、余者为水，113℃灭菌20分钟。

上述半固体分离培养基每100毫升的组份为：在生长培养基中加入0.8克的琼脂，113℃灭菌20分钟。

上述生长培养基和半固体分离培养基一经配好，其PH值即为6.7，不需采用NaOH或其它任何物质调整PH值。

趋磁细菌MB-TZ提取、纯化磁小体的方法按下列步骤：

1)趋磁细菌MB-TZ的扩大培养：

①在150×15的试管中加入12ml生长培养基，113℃灭菌20分钟，静置10--20小时后接入已纯化好的趋磁细菌MB-TZ菌种；

②将上述试管置于25-30℃的温室中，避光培养7-10天；

③在250ml的三角锥瓶中加入250ml扩大培养基，113℃灭菌20分钟，静置10--20小时后，将上述150×15试管中生长良好的趋磁细菌MB-TZ接入250ml三角锥瓶中；

④将上述已接种的三角锥瓶置于25-30℃中，避光培养10-15天；

⑤将上述培养好的趋磁细菌MB-TZ用6000转/分离心10分钟，去除上清液；

⑥将沉淀物悬浮于PH为7.2的磷酸盐缓冲液中；

2)磁小体的提取、纯化：

①将上述趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液置于-20℃冰箱中冷冻24小时；

②将冷冻后的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液置于37℃使其骤融，并如此反复冻融3次；

③经反复冻融后的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液再用超声波处理：100W、50秒、10次，反复处理3次；

④将经过反复冻融和超声波处理的趋磁细菌MB-TZ菌体悬浮液用孔径为6μM滤纸过滤；

⑤将上述滤液经40--80％蔗糖密度梯度离心，转速为6000转/分、时间为10--20分钟，收集磁小体带即制成由趋磁细菌MB-TZ来源的磁小体。

上述扩大培养基每100毫升的组份为：维生素混合液1毫升、无机盐混合液1毫升、维生素B₁₂(5微克/ml)1毫升、奎尼酸铁(0.01mol/L)0.3毫升、刃天青(200微克/ml)1毫升、巯基乙酸钠5毫克、琥珀酸钠300毫克、无水乙酸钠20毫克、硝酸钠10毫克、氯化铵10毫克、磷酸二氢钾68毫克、磷酸氢二钾114毫克、余者为水，113℃灭菌20分钟。

上述扩大培养基一经配好，其PH值即为6.7，不需采用NaOH或其它任何物质调整PH值。

上述维生素混合液的组份和无机盐混合液的组份分别与趋磁细菌MB-TZ的分离、纯培养方法中所用的维生素混合液的组份和无机盐混合液的组份相同。