一种采用大孔吸附树脂分离纯化西索米星的方法

摘要

本发明提供一种采用大孔吸附树脂分离纯化西索米星的方法。该方法为将含有西索米星的溶液用大孔吸附树脂吸附至饱和，用水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用亲水性有机溶剂洗脱西索米星组分，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成西索米星粗品。本发明构思新颖，工艺简单，产品品质高，生产成本低，可应用于不同来源的西索米星提取物的进一步分离纯化，具有较大推广性。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗生素的分离纯化方法，更具体涉及一种采用大孔吸附树脂分离纯化氨基糖苷类抗生素西索米星的方法。

背景技术

氨基糖苷类抗生素是继青霉素之后发现较早的一类抗生素。西索米星(sisomicin，简称SISO)是小单孢菌生物合成的一种氨基糖苷类抗生素，不但能直接用于生产西索米星针剂，而且是半合成抗生素奈替米星(Netilmicin)的原料。西索米星和奈替米星均列入中国国家基本药物名录，对大多数革兰氏阳性菌和阴性菌有很强的抗菌作用。

西索米星具有抗菌谱广、疗效好、性质稳定和生产工艺简单等优势，对许多致病菌有抗生素后效应的特点，广泛应用于临床治疗败血症、细菌性心内膜炎、严重的呼吸道感染、肾及尿路感染、皮肤组织和软组织感染、烧伤及手术周围性细菌感染等，在市场上占有相当的份额，中国生产的西索米星原料药约占世界产量的80％。因此，研究西索米星的制备方法具有一定的指导意义和广阔的市场前景。

自1970年美国Schering公司的Weinstein等报道了Micromonospora inyoensis能生物合成西索米星后，30多年来，国内外西索米星生产菌主要有美国Schering公司的M.inyoensis及其诱变菌株、福建省微生物研究所的M.inyoensis var dengjiangensis和福州大学的M.inyoensis F003。以发酵液中抗生素生物总效价计，发酵120h三者最高水平可分别达到1300，600和1350U/mL。当以纯组分计，M.inyoensis F003发酵96～100h时，发酵液中西索米星浓度可达0.9～1.1g/L[陈剑锋等，西索米星分批发酵的动力学特性，过程工程学报，2005：5(4)：430-433]。

西索米星是一种含有双键的水溶性、多元弱碱性氨基糖苷类抗生素，属于庆大霉素-西索米星型的假三糖庆大霉胺类，化学结构近似于庆大霉素，为庆大霉素C_1a的去氢衍生物。

西索米星的结构式为：

西索米星分子中含有4个氨基和1个甲氨基，在水溶液中存在5级离解平衡。因此，西索米星在不同pH值的水溶液体系中能以不同的电化学状态存在，不同价态离子呈现多级解离平衡状态，随着溶液的pH值由高到低而出现逐级解离。当pH＝9.7时，西索米星99％以上是以0价形式存在；pH＝8.0时，0价降为61.3％，而+1价升至33.2％，并开始有5％的西索米星处于+2价；pH值为7.2～7.4时，约75％的西索米星是以+1和+2价的形式存在；pH值6.6～6.8时，则+2和+3价形式占75％以上，并有5％～10％的+4价；pH＝4.6时，有96.2％的西索米星是以+4价形式存在，其余的均为+3价。

由于西索米星为多元弱碱性生物有机碱，根据离子交换理论，在酸性和中性条件下，西索米星是以阳离子状态存在，可选用阳离子交换树脂提取西索米星，但在碱性条件下，尤其是pH值＞8.0时，西索米星主要以分子状态存在，宜选用大孔吸附树脂进行分离纯化。

目前，世界范围内树脂产品的种类繁多，分类方法也各不相同，根据聚合反应的类型可分成缩聚型树脂和加聚型树脂，根据树脂的物理结构可分成凝胶型树脂、均孔型树脂和大孔型树脂。

国内生产流通的主要大孔吸附树脂商品，根据树脂的品牌可划分为上海罗门哈斯公司(中美合资)的Amberlite系列，浙江漂莱特公司(中英合资)的Dowex系列，华东理工大学的HZ系列，以及南开大学化工厂的D、DM、DA和NKA系列等大孔吸附树脂产品；根据树脂骨架的化学组成划分则主要有苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系、乙烯吡啶系、脲醛系和氯乙烯系等大孔吸附树脂产品；根据树脂的极性可划分成非极性树脂(如HZ802、HZ803、HZ816、HZ818、DA201、Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-4、1300、1400)、弱极性树脂(如HZ801、HZ841、DK110、Amberlite IRC-84、D113)、中等极性树脂(如HZ806、D101、AB-8)和极性树脂(如NKA-9)等大孔吸附树脂产品。

西索米星分子量447.26，分子式C₁₉H₃₇N₅O₇·H₂O，比旋光度[α]_D²⁶(C＝0.3％，H₂O)+188.90。西索米星纯品为白色无定形粉末，易溶于热水以及甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂中，微溶于氯仿，在乙醚、石油醚、苯中不溶，其硫酸盐易溶于水，不溶于有机溶剂[丁锡良等，紫苏霉素的研制，国外药学-抗生素分册，1984，6：510～516]。因此，对吸附在大孔树脂上的西索米星，可采用甲醇、乙醇等亲水性有机溶剂进行洗脱。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用大孔吸附树脂分离纯化西索米星的方法，该方法不仅设备简单、分离效果好、产品收率高，而且树脂使用寿命长、生产成本低。

本发明的采用大孔吸附树脂分离纯化西索米星的方法是这样实现的：将含有西索米星的溶液用大孔吸附树脂吸附至饱和，用水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用亲水性有机溶剂洗脱西索米星组分，洗脱液经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成西索米星粗品。

本发明亲水性有机溶剂优先选用甲醇或丙酮的主要优点为：虽然甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇等亲水性有机溶剂对西索米星的洗脱效果相当，但相对于其它亲水性有机溶剂而言，甲醇或丙酮的沸点更低、溶剂回收时能耗更小，能显著降低西索米星产品的制备成本。

本发明制备方法的主要优点在于：充分利用了pH值7.8～10.0条件下大孔吸附树脂对目标活性物质西索米星的吸附力与对蛋白质、氨基酸、多糖、色素、无机盐等杂质的吸附力的不同，以及西索米星与蛋白质、氨基酸、多糖、色素、无机盐等杂质在亲水性有机溶剂水溶液中溶解度的差异，真正达到了西索米星与杂质的高效分离。  

具体实施方式

本发明采用大孔吸附树脂分离纯化西索米星的方法，其主要步骤为：含有西索米星的溶液，在pH值7.8～10.0条件下，用大孔吸附树脂吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量(V/V)的水洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用3～8倍树脂量(V/V)的30～60％的亲水性有机溶剂水溶液，以1～3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、干燥成西索米星粗品。

其中，含有西索米星的溶液可以是来源于生物合成的西索米星发酵液、西索米星结晶母液、其它手段获得的西索米星提取液或洗脱液中的一种或几种。

大孔吸附树脂骨架的化学组成是聚苯乙烯、聚丙烯酸或酚醛中的一种或几种，优先选用聚苯乙烯或聚丙烯酸。

大孔吸附树脂可以是聚苯乙烯骨架的HZ801、HZ802、HZ803、HZ806、HZ816、HZ818、HZ841、Amberlite XAD-2、Amberlite XAD-4中的一种或几种，也可以是聚丙烯酸骨架的D101、DK110、Amberlite IRC-84、AB-8、D113中的一种或几种。

亲水性有机溶剂可以是甲醇、丙酮、乙醇、丙醇或异丙醇中的一种或几种混合溶剂，优先选用甲醇或丙酮。

本发明理化参数测定方法如下：

(1)西索米星含量的测定：采用高效液相色谱法，以邻苯二甲醛和巯基乙酸为衍生化试剂，对西索米星进行柱前衍生。测定条件：Agilent 1100型高效液相色谱仪(DAD二极管阵列检测器)，Waters Nova-Pak C₁₈色谱柱(Φ4.6×150mm，5μm)，流动相为甲醇∶水∶乙酸(内含庚烷磺酸钠12mmol/L，pH 6.3)＝70∶25∶5(V/V/V)，流速1.0ml/min，柱温30℃，进样量20μL，检测波长250nm。以西索米星(纯度99％)(购自Sigma公司)为对照。

(2)多糖含量测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖或D-半乳糖为对照。蛋白质含量测定采用FoLin-酚法，以小牛血清白蛋白为对照。无机离子含量测定采用试剂盒测定，其中SO₄^2-的测定采用氯化钡沉淀法，Cl^-测定采用硝酸银沉淀法，Ca²⁺和Mg²⁺的测定采用甲基百里香酚蓝络合法。

本发明干燥方法如下：

(1)喷雾干燥条件为：进料液浓度10～20波美度(60℃)，PG-5型喷雾干燥机进口温度160～250℃，出口温度60～110℃，离心转头工作压力1.6～3.0kgf/cm²。

(2)冷冻干燥条件为：干燥温度-10～-60℃，升华温度35～70℃，压力0.05～0.18mbar，干燥时间20～40h。

(3)真空干燥条件为：干燥温度45～75℃，压力-0.06～-0.095MPa，干燥时间15～50h。

本发明制备方法的实施例陈述如下：

实施例1

pH值为6.76、西索米星浓度为0.7g/L的发酵液，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至7.8后，采用AB-8大孔吸附树脂，以0.78倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用3倍树脂量的38％甲醇水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率94.3％，西索米星的纯度为81.4％。

实施例2

pH值为9.89、西索米星浓度为185.6g/L的结晶母液，稀释12倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至7.9，采用Amberlite XAD-4大孔吸附树脂，在75r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用6倍树脂量的30％甲醇水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、冷冻干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率93.8％，西索米星的纯度为80.3％。

实施例3

pH值为11.32、西索米星浓度为132.9g/L的氨水洗脱液，稀释10倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至8.0，采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂，以0.67倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用6倍树脂量的60％甲醇水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、真空干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率94.1％，西索米星的纯度为82.7％。

实施例4

pH值为7.23、西索米星浓度为1.1g/L的发酵液，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至9.5后，采用HZ806大孔吸附树脂，以1.23倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的60％乙醇水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率93.9％，西索米星的纯度为83.2％。

实施例5

pH值为9.36、西索米星浓度为213.7g/L的结晶母液，稀释15倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至8.7，采用HZ801∶HZ802(2∶1)(V/V)大孔吸附树脂，在135r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用6倍树脂量的45％浓度的甲醇∶乙醇(1∶2)水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、冷冻干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率94.6％，西索米星的纯度为83.9％。

实施例6

pH值为11.26、西索米星浓度为169.7g/L的氨水洗脱液，稀释11倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至9.4，采用HZ816大孔吸附树脂，在90r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的30％乙醇水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、真空干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率92.5％，西索米星的纯度为80.3％。

实施例7

pH值为7.45、西索米星浓度为1.5g/L的发酵液，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至10.0后，采用D113大孔吸附树脂，以0.5倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用3倍树脂量的30％丙酮水溶液(V/V)，以1倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、喷雾干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率93.8％，西索米星的纯度为80.9％。

实施例8

pH值为10.38、西索米星浓度为196.8g/L的结晶母液，稀释13倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至9.9，采用HZ801大孔吸附树脂，在105r/min的搅拌转速条件下，静态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用3倍树脂量的60％丙酮水溶液(V/V)，以2倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、冷冻干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率94.2％，西索米星的纯度为82.6％。

实施例9

pH值为9.05、西索米星浓度为103.8g/L的氨水洗脱液，稀释7倍后，用盐酸或氢氧化钠溶液调pH值至10.0，采用HZ803大孔吸附树脂，以0.95倍树脂量/小时的上柱流速(V/V)，动态吸附至饱和，先用不少于2倍树脂量的水(V/V)洗去未被吸附的残留液和吸附力较弱的杂质，再用8倍树脂量的49％浓度的甲醇∶丙酮(2∶1)水溶液(V/V)，以3倍树脂量/小时的流速(V/V)洗脱西索米星组分，洗脱液在-0.06～-0.09MPa、50～70℃条件下，经减压回收溶剂、真空浓缩、真空干燥成西索米星粗品。经测定，西索米星的回收率93.4％，西索米星的纯度为83.5％。

以上实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。

本发明构思新颖，工艺简单，产品品质高，生产成本低，可用于不同来源的西索米星提取物的进一步分离纯化，具有较大的推广意义。