一种检测白介素－6基因启动子区多态性位点的方法

摘要

本发明提供了一种检测白介素－6基因启动子区多态性位点的方法，它运用实时荧光PCR仪结合熔点分析在同一反应体系中实现了同时对白介素－6基因启动子区－572G/C，－597G/A两位点多态性的检测。本发明所述的方法与直接测序的检测方法相比，操作简单，成本低廉，结果判断直观，反应快速，并且每一反应都是闭管进行，有效减少了PCR污染的风险。

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种检测白介素-6基因启动子区多态性位点的方法。

背景技术

随着人类基因组测序计划的完成，人类已进入后基因组时代。该时代的研究重点是个体间的遗传差异。这种差异最常见的是单核苷酸多态性(SNP)，即在基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性。这种多态性是决定人类疾病易感性的主要因素。已有研究表明白介素-6基因启动子区存在四个多态性位点(Catherine F.Terry，Valerie Loukaci，Fiona R.Green.Cooperative influence of genetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptionalregulation.J.Biol.Chem，Vol.275，Issue 24，18138-18144，June 16，2000)。其中，-597G/A，-572G/C，-174G/C三个位点的多态性是关于心血管方面的报道(Humphies SE，Luong LA，Ogg MS，et al.The interleukin-6-174G/C promoterpolymorphism is associated with risk of coronary heart disease and systolic bloodpressure in health men[J]，Eur Heart J，2001，22；2243-2252；Anna M.Bennet，Jonathan A.Prince，Guo-Zhong Fe，et al.Interleukin-6 serum level and genotypesinfluence the risk for myocardial infarction.Atherosclerosis 171(2003)359-367.)，并且两个位点的多态性和心血管病相关。(Brull DJ，Montgomery HE，Sanders J，Dhamrait S，Luong L，Rumley A，Low GDO，Humphies SE.Interleukin-6 gene-174G＞C and-572G＞C promoter polymorphism are strong predictors of plasmainterleukine-6 leveles after coronary artery bypass surgery.；Humphrise SE，LuongLA，Ogg MS，et al.The interleukin-6-174G/C promoter polymorphism isassociated with risk of coronary heart disease and systolic blood pressure in healthmen[J]，Eur Heart J，2001，22；2243-2252).

白介素-6基因调控的机理尚未被完全了解，Catherine F，Terry的研究表明白介素-6的调控可能是由多态性位点之间的相互作用决定的，而不是由单一位点的多态性来决定(Terry CF，Loukaci V，Green FR..Cooperative influence ofgenetic polymorphisms on interleukin-6 transcriptional regulation.Jour of BioChem，2000，275(24)；18-138)。因此，研究者从单一位点的多态性出发研究与白介素-6水平的关系时，不同的实验会得到不同的结论，有的甚至相互矛盾。研究表明，白介素-6基因启动子区-174G/C等位基因的频率在中国，日本和韩国人群中非常低(Lim C.S；Zheng S；Kim Y.S；Cytokine，Volume 19，Number 1，July 2002，52-54(3))。鉴于中国人白介素-6基因启动子区-174位点的突变频率很低，我们推测中国汉族人白介素-6基因的调控可能是启动子区-572位点和-597位点的多态性相互作用的结果，因此设想通过这两个位点的同时检测来评价中国汉族人心血管病的易感性。

目前，国内的报道大多采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(RFLP)分析方法来检测白介素-6基因启动子区位点的多态性。例如付海霞等用此方法检测了232例患者和260例对照组的白介素-6基因-572G/C的多态性(付海霞，张嘉莹，李庚山等，白细胞介素6基因-572C/G多态性与心肌梗塞易感性的关联研究中华医学遗传学杂志，2006，23(3)245-249)。这种传统的检测技术虽然在某种程度上能够完成对SNP的检测，但必须通过凝胶电泳检测，耗时、费力，且难以达到自动化的程度。此外，尽管此方法对相关位点的限制性内切酶的活性进行了严格的限定，但已有假阳性的出现与相关位点的限制性内切酶的活性无关的报道。

因此，寻找一种快捷高效的能同时检测白介素-6基因启动子区-597G/A，-572G/C位点多态性的方法成为下一步研究的关键。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是提供一种检测白介素-6基因启动子区多态性位点的方法。

(二)技术方案

本发明所述方法的基本原理为：利用实时荧光定量PCR原理，采用荧光标记的特异性寡核苷酸探针，描绘目标DNA片段的熔点曲线，从而获得扩增产物的特异性熔点曲线。任一突变位点最多只有三种熔点曲线。每种特征性熔点曲线相对应的PCR产物只需一次测序验证其基因型，以后所有样本就可以根据解链温度(Tm)的峰值来判断目标DNA的突变类型。具体讲就是运用同一对引物，在实时荧光定量PCR分析仪上一次实验同时扩增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C两位点的DNA片段，实现在同一PCR反应体系中分别运用两对探针对两个突变位点进行检测。由于两个突变位点相距较近，设计探针的碱基序列分别与目标DNA的编码链和模板链分别互补，以减少它们之间的竞争。荧光标记的探针与目标DNA碱基序列杂交时，进行完全和不完全的匹配反应，如果某处有突变，碱基错配使得探针和目标序列结合不稳定，降低了Tm。纯合体的Tm曲线只有一个峰，杂合体样本的Tm曲线有两个峰，和目标序列形成完全互补DNA的Tm比含有错配碱基的Tm高，可以很清楚的检测到两个熔链温度的差异，从而达到通过探测Tm值来识别等位基因的目的。两对探针分别标记不同的荧光，运用罗氏Lightcycler分析仪F2和F3通道可对此两位点同时检测(F2通道检测-597位点，F3通道检测-572位点)，从而建立同时分型白介素-6基因启动子区-597G/A，-572G/C两位点的方法。

本发明所述的方法，所用到的引物和探针是根据基因库中人白介素-6基因的全基因序列(基因登录号AF372214，Rieder，M.J，Carrington，D.P，Chung，M.-W.，Lee，K.L.，Poel，C.L.，Yi，Q.and Nickerson，D.A.Molecular Biotechnology，University of Washington，1705 NE Pacific，Seattle，WA 98195，USA)来设计的。

一种检测白介素-6基因启动子区多态性位点的方法，它包括下述步骤：

(1)设计用于扩增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C两位点的DNA片段的引物：

正向引物：5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；

反向引物：5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；

(2)设计分别用于检测白介素-6基因启动子区597G/A，572G/C两位点的探针，并用不同的荧光素分别标记下述两对探针：

用于检测白介素-6基因启动子区-597G/A位点的探针为：

检测探针：5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基，检测探针和锚定探针均与目标DNA的编码链相互补；

用于检测白介素-6基因启动子区-572G/C位点的探针为：

检测探针：5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；由于付海霞等的研究表明中国汉族人此位点CC基因型占多数(付海霞，张嘉莹，李庚山等，白细胞介素6基因-572C/G多态性与心肌梗死及血脂关系的研究.中国医师进修杂志，2006，29(4)1-3.)，我们将检测探针在此位点的碱基设为C，检测探针和锚定探针的碱基序列与目标DNA的模板链相互补，检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基；

以上所述的两对探针分别用HPLC纯化；

(3)PCR扩增，并进行荧光检测；

(4)描绘熔点曲线；

(5)根据得到的特征性熔点曲线，判断待测样品的基因型；

(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证。

在本发明所述的方法中，所述步骤(3)的PCR反应体系为：

试剂成分           浓度       加入量(μL)   终浓度(含量)

正向引物           10μM/L    0.6-1.2       0.3-0.6μM/L

反向引物           10μM/L    0.6-1.2       0.3-0.6μM/L

-597位点检测探针   5μM/L     0.2-1.6       0.05-0.4μM/L

-597位点锚定探针   5μM/L     0.2-3.2     0.05-0.8μM/L

-572位点检测探针   5μM/L     0.2-3.2     0.05-0.8μM/L

-572位点锚定探针   5μM/L     0.4-6.4     0.1-1.6μM/L

LightCyclerFastStart             3-6

DNAMasterplus Hybprobe

Mix

水

模板DNA         50-150ng/μ      1-8       50-1200ng/μL

                     L

PCR循环条件为：模板DNA变性1循环：93-97℃变性8-15min，温度变化速率18-20℃/s；目标DNA扩增30-45个循环：93-97℃变性8-12s，50-54℃退火3-7s，70-74℃延伸7-11s，温度变化速率设为：从变性到退火18-20℃/s，从退火到延伸1-4℃/s，从延伸到变性18-20℃/s；扩增后进行解链分析1个循环：92-97℃ 0-1s，38-45℃ 28-33s，温度变化速率为18-20℃/s，然后以0.1-0.5℃/s的速率加热到85-95℃；最后以8-12℃/s的速度将反应混合物冷却到38-42℃保持28-32s。

荧光检测参数设置为：在扩增阶段，将荧光通道设为F2/1或F3/F1，在每个退火点同时进行两通道的荧光检测；在描绘熔点曲线阶段，将荧光通道显示模式设为F2/1或F3/F1，连续记录荧光值。

在本发明所述的方法中，所述步骤(4)的熔点曲线是以温度为横坐标，荧光值的倒数[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]为纵坐标建立起来的，分别记录每一样品两个通道的Tm值。

运用LightCycler5.32解链分析软件进行熔点温度的检测，Tm值相同的峰判定为同一种基因型，其步骤为：(1)选适当的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手调来确定待检样品的熔点Tm值。(2)比较样品中是否有熔点Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范围内，可以看成同一个峰。因为不同样本的DNA含量、无机、有机环境不可能完全一致，所以允许熔点Tm峰有±1.0℃范围的偏差。当发现有Tm峰在1.0℃-2.0℃之间时，说明有少量非特异的扩增，其原因是样本中含有的病毒序列可能与特异探针结合或有少量碱基错配发生，导致Tm峰值为多个峰叠加。待检DNA样本用TE缓冲液(含10mM Tris，1mMEDTA)稀释10倍即可减少误差。本实验通过412个样本Tm值的测定发现：在-572位点，原生纯合型和野生纯合型的Tm值分别为(60.67℃-63.83℃，平均值为62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值为54.41℃)；在-597位点，原生纯合型和杂合型的Tm值分别为(62.02℃-65.25℃，平均值为64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值为55.61℃)。

在本发明所述的方法中，所述步骤(5)中待测样品的基因型判断是根据步骤(4)得到的特征性熔点曲线，每一种特征性的熔点曲线对应一种基因型，对照测序结果可知每一待检样品的基因型。

在本发明所述的方法中，所述步骤(6)中测序验证过程为：

根据获得的熔点曲线，在每一种Tm值相同的峰对应的样本中任选一个样本进行DNA测序验证。具体过程为：先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，反应体系20μL。

试剂成分             浓度                        加入量(μL)

TakaRa Taq酶         5U/μL                      0.1

10XBuffer缓冲液      Tris-HCL(pH8.3，100mM，     2

                     KCL(500mM)，

                     MgCL2(15mM)

dNTP                 2.5mM                       1.6

正向引物             10μM/L                     1

正向引物               10μM/L                     1

DNA                    50-150ng/μL                5

水                                                 9.3

循环条件：模板DNA变性1循环：94℃ 5min；目标DNA扩增35个循环：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。

PCR结束后，以DL2000(TakaRa)为分子量标尺，取目标DNA扩增液9μL和1μL上样缓冲液混匀，点入1％琼脂糖(每100m琼脂糖凝胶加5μL北京赛百盛基因技术有限公司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动5分钟，再以50V电压泳动1小时，取下凝胶，在紫外灯下检测扩增产物并照相。

将电泳阳性条带对应的PCR产物18μL送去测序，根据测序结果可获得不同熔点曲线所对应白介素-6的基因型。由熔点曲线的类型就可以直接判断对应样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结果发现，中国北方汉族人白介素-6基因启动子区-572位点有三种基因型，分别为GG，GC，CC型；-597位点有两种基因型，为GG型和GA型(通过对412例中国汉族人群的检测，尚未发现AA型)。

本发明所述的方法在评价人心血管病易感性中的应用，特别是在评价中国汉族人心血管病易感性中的应用。

(三)有益效果

本发明所述的方法运用实时荧光PCR仪结合熔点分析在同一反应体系中实现了同时对白介素-6基因启动子区-572G/C，-597G/A两位点多态性的检测。解链得到的特征性熔点曲线均只对应一种基因型，一个多态性位点最多只会有3种特征性熔点曲线，因此只需DNA测序验证一次即可得出以后所有相同峰型对应样本的基因型。

该方法与直接测序的检测方法相比，操作简单，成本低廉，结果判断直观，反应快速，31个样本在30分钟内即可完成检测过程，并且每一反应都是闭管进行，有效减少了PCR污染的风险。

附图说明

图1是本发明所述探针的设计原理图；

图2是用实时荧光PCR仪的F3通道检测31例中国北方汉族人白介素-6基因启动子区-572位点多态性的熔点分析图，其中，1为GG型，2为CC型，3为GC型，4为阴性对照；

图3是用实时荧光PCR仪的F2通道检测31例中国北方汉族人白介素-6基因启动子区-597位点多态性的熔点分析图，其中，1为GA型，2为GG型，3为阴性对照。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。

实施例1 用本发明所述的方法同时检测31例中国北方汉族人白介素-6基因启动子区-597G/A，-572G/C两位点的多态性

(1)设计用于扩增含白介素-6基因597G/A，572G/C两位点的DNA片段的引物：

正向引物：5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；

反向引物：5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；

(2)设计分别用于检测白介素-6基因启动子区597G/A，572G/C两位点的探针，并用不同的荧光素分别标记下述两对探针，探针设计原理如附图1所示：

用于检测白介素-6基因启动子区597G/A位点的探针为：

检测探针：5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基，检测探针和锚定探针均与目标DNA的编码链相互补；

用于检测白介素-6基因启动子区-572G/C位点的探针为：

检测探针：5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；检测探针在此位点的碱基设为C，检测探针和锚定探针的碱基序列与目标DNA的模板链相互补，检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基；

以上所述的两对探针分别用HPLC纯化；

(3)PCR扩增，并进行荧光检测：

PCR反应体系为：

试剂成分               浓度            加入量(μ终浓度(含量)

                                       L)

正向引物               10μM/L         1           0.5μM/L

反向引物               10μM/L         1           0.5μM/L

-597位点检测探针       5μM/L          0.4         0.1μM/L

-597位点锚定探针       5μM/L          0.8         0.2μM/L

-572位点检测探针       5μM/L          0.8         0.2μM/L

-572位点锚定探针       5μM/L          1.6         0.4μM/L

LightCyclerFastStart

DNAMasterplus Hybprobe                 4

Mix

水                                     5.4

模板DNA                100ng/L         5           1200ng/μL

PCR循环条件为：模板DNA变性1循环：95℃ 10min；温度变化速率20℃/s；目标DNA扩增35个循环：95℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸9s；温度变化速率设为：从变性到退火20℃/s，从退火到延伸3℃/s，从延伸到变性20℃/s；扩增后进行解链分析1个循环：95℃ 0s，40℃ 30s，温度变化速率为20℃/s，然后以0.2℃/s的速率加热到95℃；最后以10℃/s的速度将反应混合物冷却到40℃保持30s。

荧光检测参数设置为：在扩增阶段，将荧光通道设为F2/1或F3/F1，在每个退火点同时进行两通道的荧光检测；在描绘熔点曲线阶段，将荧光通道显示模式设为F2/1或F3/F1，连续记录荧光值。

(4)描绘熔点曲线：熔点曲线是以温度为横坐标，荧光值的倒数[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]为纵坐标建立起来，分别记录每一样品两个通道的Tm值。如附图2所示，在-572位点，原生纯合型和野生纯合型的Tm值分别为(60.67℃-63.83℃，平均值为62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值为54.41℃)；如附图3所示，在-597位点，原生纯合型和杂合型的Tm值分别为(62.02℃-65.25℃，平均值为64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值为55.61℃)。

运用LightCycler5.32解链分析软件进行熔点温度的检测，Tm值相同的峰判定为同一种基因型，其步骤为：(1)选适当的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手调来确定待检样品的熔点Tm值。(2)比较样品中是否有熔点Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范围内，可以看成同一个峰。

(5)根据步骤(4)得到的特征性熔点曲线，每一种特征性的熔点曲线对应一种基因型，对照测序结果可知每一待检样品的基因型。

(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证：

根据获得的熔点曲线，在每一种Tm值相同的峰对应的样本中任选一个样本进行DNA测序验证。具体过程为：先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，反应体系20μL。

试剂成分                浓度                加入量(μL)

TakaRa Taq酶              5U/μL                 0.1

10XBuffer缓冲液           Tris-HCL(pH8.3，100mM，2

                          KCL(500mM)，

                          MgCL2(15mM)

dNTP                      2.5mM                  1.6

正向引物                  10μM/L                1

正向引物                  10μM/L                1

DNA                       50ng/μL               5

水                                               9.3

循环条件：模板DNA变性1循环：94℃ 5min；目标DNA扩增35个循环：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。

PCR结束后，以DL2000(TakaRa)为分子量标尺，取目标DNA扩增液9μL和1μL上样缓冲液混匀，点入1％琼脂糖(每100m琼脂糖凝胶加5μL北京赛百盛基因技术有限公司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动5分钟，再以50V电压泳动1小时，取下凝胶，在紫外灯下检测扩增产物并照相。

将电泳阳性条带对应的PCR产物18μL送北京华大中生科技发展有限公司测序，根据测序结果可获得不同熔点曲线所对应白介素-6的基因型。由熔点曲线的类型就可以直接判断对应样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结果发现，中国北方汉族人白介素-6基因启动子区-572位点有三种基因型，分别为GG，GC，CC型，如附图2所示，图中1为GG型，2为CC型，3为GC型；-597位点有两种基因型，为GG型和GA型，如附图3所示，图中1为GA型，2为GG型。

根据附图2和附图3，我们可迅速直观的判断样本的基因型，31个样本在30分钟内即可完成检测过程，并且每一反应都是闭管进行，有效减少了PCR污染的风险。

实施例2  用本发明所述的方法同时检测412例中国汉族人白介素-6基因启动子区-597G/A，-572G/C两位点的多态性

(1)设计用于扩增含白介素-6基因-597G/A，-572G/C两位点的DNA片段的引物：

正向引物：5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；

反向引物：5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；

(2)设计分别用于检测白介素-6基因启动子区597G/A，572G/C两位点的探针，并用不同的荧光素分别标记下述两对探针，探针设计原理如附图1所示：

用于检测白介素-6基因启动子区597G/A位点的探针为：

检测探针：5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’(Phosphate)；检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基，检测探针和锚定探针均与目标DNA的编码链相互补；

用于检测白介素-6基因启动子区572G/C位点的探针为：

检测探针：5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；检测探针在此位点的碱基设为C，检测探针和锚定探针的碱基序列与目标DNA的模板链相互补，检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基；

以上所述的两对探针分别用HPLC纯化；

(3)PCR扩增，并进行荧光检测：

PCR反应体系为：

试剂成分              浓度        加入量(μL)     终浓度(含量)

正向引物              10μM/L     0.6             0.6μM/L

反向引物              10μM/L     0.6             0.6μM/L

-597位点检测探针      5μM/L      1.6             0.05μM/L

-597位点锚定探针      5μM/L      3.2             0.05μM/L

-572位点检测探针      5μM/L      3.2             0.05μM/L

-572位点锚定探针      5μM/L      6.4             0.1μM/L

LightCyclerFastStart              3

DNAMasterplus Hybprobe

Mix

水

模板DNA               50ng/μL    1                50ng/μL

PCR循环条件为：模板DNA变性1循环：93℃变性15min，温度变化速率18℃/s；目标DNA扩增45个循环：93℃变性12s，50℃退火7s，70℃延伸11s，温度变化速率设为：从变性到退火18℃/s，从退火到延伸4℃/s，从延伸到变性18℃/s；扩增后进行解链分析1个循环：92℃ 1s，38℃ 33s，温度变化速率为18℃/s，然后以0.5℃/s的速率加热到85℃；最后以8℃/s的速度将反应混合物冷却到38℃保持32s。

荧光检测参数设置为：在扩增阶段，将荧光通道设为F2/1或F3/F1，在每个退火点同时进行两通道的荧光检测；在描绘熔点曲线阶段，将荧光通道显示模式设为F2/1或F3/F1，连续记录荧光值。

(4)描绘熔点曲线：熔点曲线是以温度为横坐标，荧光值的倒数[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]为纵坐标建立起来，分别记录每一样品两个通道的Tm值。在-572位点，原生纯合型和野生纯合型的Tm值分别为(60.67℃-63.83℃，平均值为62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值为54.41℃)；在-597位点，原生纯合型和杂合型的Tm值分别为(62.02℃-65.25℃，平均值为64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值为55.61℃)。

运用LightCycler5.32解链分析软件进行熔点温度的检测，Tm值相同的峰判定为同一种基因型，其步骤为：(1)选适当的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手调来确定待检样品的熔点Tm值。(2)比较样品中是否有熔点Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范围内，可以看成同一个峰。

(5)根据步骤(4)得到的特征性熔点曲线，每一种特征性的熔点曲线对应一种基因型，对照测序结果可知每一待检样品的基因型。

(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证：

根据获得的熔点曲线，在每一种Tm值相同的峰对应的样本中任选一个样本进行DNA测序验证。具体过程为：先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，反应体系20μL。

试剂成分               浓度                    加入量(μL)

TakaRa Taq酶           5U/μL                  0.1

10XBuffer缓冲液        Tris-HCL(pH8.3，100mM， 2

                       KCL(500mM)，

                       MgCL2(15mM)

dNTP                   2.5mM                   1.6

正向引物               10μM/L                 1

正向引物               10μM/L                 1

DNA                    150ng/μL               5

水                                             9.3

循环条件：模板DNA变性1循环：94℃ 5min；目标DNA扩增35个循环：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。

PCR结束后，以DL2000(TakaRa)为分子量标尺，取目标DNA扩增液9μL和1μL上样缓冲液混匀，点入1％琼脂糖(每100m琼脂糖凝胶加5μL北京赛百盛基因技术有限公司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动5分钟，再以50V电压泳动1小时，取下凝胶，在紫外灯下检测扩增产物并照相。

将电泳阳性条带对应的PCR产物18μL送北京华大中生科技发展有限公司测序，根据测序结果可获得不同熔点曲线所对应白介素-6的基因型。由熔点曲线的类型就可以直接判断对应样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结果发现，中国汉族人白介素-6基因启动子区-572位点有三种基因型，分别为GG，GC，CC型；-597位点有两种基因型，为GG型和GA型。

根据建立的熔点曲线图，我们可迅速直观的判断样本的基因型，并且每一反应都是闭管进行，有效减少了PCR污染的风险。

实施例3用本发明所述的方法同时检测100例中国汉族人白介素-6基因启动子区597G/A，572G/C两位点的多态性

(1)设计用于扩增含白介素-6基因597G/A，572G/C两位点的DNA片段的引物：

正向引物：5’-AAAGGAGTCACACACTCC-3’；

反向引物：5’-GCGTTCCAGTTAATTTGTATTTG-3’；

(2)设计分别用于检测白介素-6基因启动子区597G/A，572G/C两位点的探针，并用不同的荧光素分别标记下述两对探针，探针设计原理如附图1所示：

用于检测白介素-6基因启动子区597G/A位点的探针为：

检测探针：5’-CTGCCTGGCCACCCTCA-3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 640-TTTCGTGCAGTTACTTCAAGGCGTCTCCAGG-3’

(Phosphate)；检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基，检测探针和锚定探针均与目标DNA的编码链相互补；

用于检测白介素-6基因启动子区572G/C位点的探针为：

检测探针：5’-ACAACAGCCCCTCACAGG3’(Fluo)；

锚定探针：5’-LC-Red 705-GAGCCAGAACACAGAAGAACTCAGATGACTG-3’(Phosphate)；检测探针在此位点的碱基设为C，检测探针和锚定探针的碱基序列与目标DNA的模板链相互补，检测探针和锚定探针之间相隔两个碱基；

以上所述的两对探针分别用HPLC纯化；

(3)PCR扩增，并进行荧光检测：

PCR反应体系为：

试剂成分               浓度          加入量(μL)      终浓度(含量)

正向引物               10μM/L       1.2              0.3μM/L

反向引物               10μM/L       1.2              0.3μM/L

597位点检测探针        5μM/L        0.2              0.4μM/L

597位点锚定探针        5μM/L        0.2              0.8μM/L

572位点检测探针        5μM/L        0.2              0.8μM/L

572位点锚定探针        5μM/L        0.4              1.6μM/L

LightCyclerFastStart                 6

DNAMasterplus Hybprobe

Mix

水

模板DNA                150ng/L       8               1200ng/μL

PCR循环条件为：97℃变性8min，温度变化速率20℃/s；目标DNA扩增30个循环：97℃变性8s，54℃退火3s，74℃延伸7s，温度变化速率设为：从变性到退火20℃/s，从退火到延伸1℃/s，从延伸到变性20℃/s；扩增后进行解链分析1个循环：97℃ 0s，45℃ 28s，温度变化速率为20℃/s，然后以0.1℃/s的速率加热到95℃；最后以12℃/s的速度将反应混合物冷却到42℃保持28s。

荧光检测参数设置为：在扩增阶段，将荧光通道设为F2/1或F3/F1，在每个退火点同时进行两通道的荧光检测；在描绘熔点曲线阶段，将荧光通道显示模式设为F2/1或F3/F1，连续记录荧光值。

(4)描绘熔点曲线：熔点曲线是以温度为横坐标，荧光值的倒数[-d(F2)/dT]、[-d(F3)/dT]为纵坐标建立起来，分别记录每一样品两个通道的Tm值。在-572位点，原生纯合型和野生纯合型的Tm值分别为(60.67℃-63.83℃，平均值为62.04℃)和(53.90℃-55.47℃，平均值为54.41℃)；在-597位点，原生纯合型和杂合型的Tm值分别为(62.02℃-65.25℃，平均值为64.11℃)，(55.22℃-56.23℃，平均值为55.61℃)。

运用LightCycler5.32解链分析软件进行熔点温度的检测，Tm值相同的峰判定为同一种基因型，其步骤为：(1)选适当的“℃ to Average”值，用“Manual Tm”手调来确定待检样品的熔点Tm值。(2)比较样品中是否有熔点Tm值相同的峰，如果特征性的Tm值在±1.0℃范围内，可以看成同一个峰。

(5)根据步骤(4)得到的特征性熔点曲线，每一种特征性的熔点曲线对应一种基因型，对照测序结果可知每一待检样品的基因型。

(6)对所述的待测样品的基因型进行测序验证：

根据获得的熔点曲线，在每一种Tm值相同的峰对应的样本中任选一个样本进行DNA测序验证。具体过程为：先用普通PCR在基因扩增杂交仪上扩增目的DNA片段，反应体系20μL。

试剂成分             浓度                    加入量(μL)

TakaRa Taq酶         5U/μL                  0.1

10XBuffer缓冲液      Tris-HCL(pH8.3，100mM， 2

                     KCL(500mM)，

                     MgCL2(15mM)

dNTP                 2.5mM                   1.6

正向引物             10μM/L                    1

正向引物             10μM/L                    1

DNA                  100ng/μL                  5

水                                              9.3

循环条件：模板DNA变性1循环：94℃ 5min；目标DNA扩增35个循环：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸45s，最后72℃延伸7min。

PCR结束后，以DL2000(TakaRa)为分子量标尺，取目标DNA扩增液9μL和1μL上样缓冲液混匀，点入1％琼脂糖(每100m琼脂糖凝胶加5μL北京赛百盛基因技术有限公司的GoldView)凝胶加样孔内，以100V电压泳动5分钟，再以50V电压泳动1小时，取下凝胶，在紫外灯下检测扩增产物并照相。

将电泳阳性条带对应的PCR产物18μL送北京华大中生科技发展有限公司测序，根据测序结果可获得不同熔点曲线所对应白介素-6的基因型。由熔点曲线的类型就可以直接判断对应样本的基因突变类型，不再需要对以后的PCR产物进行测序。测序结果发现，中国汉族人白介素-6基因启动子区-572位点有三种基因型，分别为GG，GC，CC型；-597位点有两种基因型，为GG型和GA型。

根据建立的熔点曲线图，我们可迅速直观的判断样本的基因型，并且每一反应都是闭管进行，有效减少了PCR污染的风险。