一种使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法

摘要

本发明涉及一种使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法，其为在常规的逆流色谱的固定相中，加入固态分离介质——微球，组成一包括液态固定相、固态固定相和液态流动相的三相的分离系统，将逆流色谱方法和柱层析方法结合在一起的方法。该方法适合于分离不同种类的化合物。在应用于天然产物的分离纯化时，通过调整溶剂体系和介质颗粒的种类，实现多种选择性的组合，在一个运行过程中，将两种色谱方法结合从而改变分离系统的选择性，使两种原理的分离过程一步完成，为种类繁多、组分复杂、结构近似、有效成分含量低的天然产物的分离提供了新的技术，并解决了逆流色谱总体分辨率较低的问题。

说明书

技术领域

本发明涉及一种使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法。

背景技术

近年来，对天然产物(包括中药)——天然植物、动物和矿物中活性成分的研究已成为制药、药理和临床应用的热点，全世界25％的处方药来自天然植物，其中已有121种活性化合物可以作为常规使用的药物，已引起世界各国的重视。

我国地域辽阔，是世界上植物资源最为丰富的国家之一，仅高等植物就有30,000余种，其中药用植物11,000余种，有着几千年的临床应用历史。但我国的中药在国际市场上的覆盖率很小，远不如邻国日本。日本拥有的已获批准的210个汉方药制剂中，其处方主要是来自我国名医张仲景著作的《伤寒论》和《金匮要略》，且该制剂原料的75％也是由我国输入，但其在国际市场的覆盖却达到了80％。相比之下，我国拥有4000种中药制剂，但在国际市场上的覆盖率仅为3～5％。导致这种情况的主要原因之一是我国对天然产物进行药用生产加工的工艺虽有一定进步，但离现代医药工业优质化生产的要求还有很大差距。

天然产物成分十分复杂，且有效成分含量甚微，去除其中的无效甚至是有害成分，降低毒副作用；提高有效成分含量，增强药物疗效；形成规范的、优质化的生产工艺是我国天然药物发展进程中需要解决的关键问题之一。

天然产物的生产工艺主要包括提取和纯化两部分。

通常使用溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超声波提取法等传统的提取方法，或是微波提取法(MAE)及超临界二氧化碳萃取法(SFE)等近年来才发展起来的提取方法，将植物的有效部位(或有效组分)快速、有效地富集，制备成粗提取物。然后再对该天然产物进行进一步的分离纯化。

对提取物进行纯化是天然产物研究中的技术瓶颈问题。目前常用的纯化方法包括经典的溶剂萃取法、分馏法、沉淀法、升华法、结晶法、膜分离法，分子蒸馏法，固相萃取，逆流色谱和柱层析等，每种方法有自己的优势但也存在缺陷和局限性。其中，尤以柱层析和逆流色谱方法更为常用。

逆流色谱(High-speed counter-current chromatography，HSCCC)是一种没有固态支撑体的液—液分配色谱技术，以轻巧的聚四氟乙烯螺旋管作为分离柱，固定相和流动相都是液态，螺旋管自转的同时，绕一平行于自转轴的外部轴线做公转运动，借以获得足够强的离心力场，在两相中的一相得以保留的前提下，形成固定相与流动相的两相分割趋势和对流趋势，这种分割和对流的过程是连续进行的，如果把要分离的样品从螺旋管柱的入口注入，连续的分配传递过程就会在管柱里进行，从而实现连续的、高效的液—液分配过程。这种方法的优点是：逆流色谱没有固相载体，避免了待分离样品与固相载体表面产生化学反应而变性及不可逆吸附；样品不需要严格的预处理，且在分析/分离高粘度和易造成固定相吸附的样品方面具有明显优势；适用范围比较广泛，既可分离生物碱、黄酮等有机小分子，也可以分离多肽、蛋白质、多糖等大分子化合物；作为天然药物质量控制方法，能够明确表达中药材这种复杂体系中不同批次间各种化学成分浓度分布的总体状况，稳定性和重现性好；因有多种型号，既可以实现样品的分析，也可以进行规模化制备；仪器操作非常简单，更换流动相很简便；其仪器及耗材完全国产化，成本明显低于高效液相色谱。但是，这种方法由于萃取分离本身的局限性，通常情况下分离效率低于高效液相色谱。

柱层析方法自上世纪九十年代以后，已经取得了巨大的进展，具备了较高的分离能力、选择性、通用性，且操作条件比较温和。柱层析技术种类较多，例如以下几种：

吸附层析：这是一种广义的吸附，不仅包括通常所指的无化学键引入的物理作用，也包括疏水相互作用和氢键力等。根据提取物中各组分对固定相吸附程度的不同，以及其在相应的流动相中溶解度的差异来实现。所涉及的介质范围非常广泛，包括：硅胶、键合相硅胶、琼脂糖、葡聚糖、氧化铝、大孔吸附树脂、聚酰胺、活性碳、羟基磷灰石等。分离范围广泛，既包括脂溶性化合物，也包括水溶性化合物。

离子交换层析：其分离技术是带电荷的目标物分子与其他带相同电荷的盐或带电的杂质分子竞争地与介质上带相反电荷的离子交换基团相结合，由于样品分子与交换位点相互作用的强度不同从而实现分离。可以分离水溶性成分，如氨基酸、肽类、生物碱类和多酚类化合物等。

灌注层析：使用了带有穿透孔的特殊层析介质，大大降低了传质阻力，缩短了传质途径，提高了柱效和分离速度。

柱层析分离效率高，尤其是高效液相层析的应用，其固定相颗粒直径小，总表面积大，因此具有非常高的分辨能力和很好的选择性；适用的化合物类型广泛。但也存在柱吸附从而造成样品损失，中低压柱层析分离时间长，部分介质昂贵使得分离成本高，某些结构相似的化合物尤其是亲水性强的化合物采用一步法无法实现有效分离等问题。

发明内容

本发明的目的在于克服使用逆流色谱方法分离天然产物时总体分辨率较低，而使用柱层析方法分离天然产物时因其选择性的限制，采用一步法无法实现某些结构相似的化合物，尤其是亲水性强的化合物的有效分离的缺陷，从而提供一种将逆流色谱方法和柱层析方法的固态分离介质——微球结合在一起的、使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法。

本发明的目的是通过如下的技术方案实现的：

本发明提供的使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法，是在常规的逆流色谱的固定相中，加入固态分离介质——微球，组成一包括液态固定相、固态固定相和液态流动相的三相的分离系统，将逆流色谱方法和柱层析方法结合在一起的方法，具体包括如下的步骤：

1)选择常规的逆流色谱溶剂体系作为三相逆流色谱的液态固定相和液态流动相，并在分液漏斗中平衡2h，将上下两相分开，备用；

所述的溶剂体系是上相以有机相为主，极性较弱；下相以水为主，极性较强；包括：正己烷-乙醇-水，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-水，正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水，乙酸乙酯-正丁醇-乙腈-水，乙酸乙酯-乙醇-水，乙酸乙酯-乙醇-乙酸-水，乙酸乙酯-正丁醇-水，正丁醇-水，或正丁醇-乙酸-水；

2)配制三相逆流色谱的固定相和流动相：

将上述逆流色谱的溶剂体系中极性与固态固定相相近的一相作为液态固定相，以利于介质颗粒在该液态固定相中的稳定和均匀分布；然后将固态固定相加入到上述的液态固定相中，搅拌混合均匀，制得的悬浮液作为三相逆流色谱的固定相；

所述的固态固定相包括亲脂性的介质和亲水性的介质；加入的固态固定相与液态固定相的比例为2～6g/L；

所述的亲脂性的介质为反相键合相硅胶、聚苯乙烯、聚酰胺、或苯乙烯-二乙烯基苯的交联共聚物；该固态固定相亲脂性较强，加入上述逆流色谱的溶剂体系中的上相(有机相)作为三相逆流色谱的固定相；

所述的亲水性的介质为正相键合相硅胶、琼脂糖基质凝胶、或葡聚糖基质凝胶；该固态固定相亲水性较强，加入上述逆流色谱的溶剂体系中的下相(水相)作为三相逆流色谱的固定相；

将上述逆流色谱的溶剂体系中极性与固态固定相不相近的一相作为三相逆流色谱的流动相；

3)建立三相间的平衡：

将步骤2)得到的含有亲脂性介质的固定相以8～10mL/min的流速泵满常规的逆流色谱的分离柱(聚四氟乙烯缠绕形成的螺旋管)，然后以300～600r/min的转速正向运转逆流色谱主机；同时以较低流速0.5～1.5mL/min泵入流动相；在逆流色谱的出口端加0.7Mpa的反压，待流动相从溢出口溢出时，三相间的平衡已经建立；在阿基米德螺线力、行星式离心力场和流动相的综合作用下，25～70％的固定相保留在分离柱中；

或是将步骤2)得到的含有亲水性介质的固定相以8～10mL/min的流速泵满常规的逆流色谱的分离柱(聚四氟乙烯缠绕形成的螺旋管)，然后以300～600r/min的转速反向运转逆流色谱主机；同时以较低流速0.5～1.0mL/min泵入流动相；在逆流色谱的出口端加1Mpa的反压，待流动相从溢出口溢出时，三相间的平衡已经建立；在阿基米德螺线力、行星式离心力场和流动相的综合作用下，25～60％的固定相保留在分离柱中；

4)将待分离纯化的天然产物进样：

将待分离纯化的天然产物按1～10mg/mL的浓度溶于流动相后，推入进样圈；

5)分离纯化：

待分离纯化的天然产物样品中各组分在液态固定相与流动相之间分配的同时，还与固态固定相发生吸附层析分离；使用紫外检测器在线检测馏分，并通过记录仪或计算机软件记录色谱图，并根据色谱图收集馏分，得到纯化的天然产物。

本发明提供的使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法中，构成三相的液态两相及固态一相，因其性质不同，适合于分离不同种类的化合物。含有亲脂性介质的固定相构成的三相，适于分离弱极性及中等极性的化合物；含有亲水性介质的固定相构成的三相，适于分离中等极性及强极性的化合物。

本发明提供的使用三相逆流色谱分离纯化天然产物的方法，首次将逆流色谱方法和柱层析方法结合在一起。该方法中包括固态固定相、液态固定相和液态流动相的三相体系，在一定转速下，在阿基米德螺线力、行星式离心力场和流动相的综合作用下，形成固定相(包括液态固定相和固态固定相)与流动相的分割趋势和对流趋势。样品中各组分在液态固定相与流动相之间分配的同时还与固态固定相发生吸附分离，形成分配与吸附联合作用的一步分离系统。介质颗粒在旋转的行星式离心螺旋管中的振荡增强了物质的传递与分配，所形成的理论塔板数既高于逆流色谱，也高于低压吸附层析；系统分辨率提高；馏分的保留时间延长，有利于提高馏分纯度；二步分离简化至一步完成。

在应用于天然产物的分离纯化时，通过调整溶剂体系和介质颗粒的种类，实现多种选择性的组合，在一个分离系统中实现高速离心力场作用下的萃取分离与吸附分离，在一个运行过程中，将两种色谱方法结合从而改变分离系统的选择性，使两种原理的分离过程一步完成，解决了天然产物因组分复杂、结构近似而导致的分离困难、分离度低的问题，为种类繁多、组分复杂、结构近似、有效成分含量低的天然产物的分离提供了新的技术，并解决了逆流色谱总体分辨率较低的问题。同时也兼顾了环境保护和国家可持续发展战略。

附图说明

图1为实施例1使用三相逆流色谱系统分离黄芩水提物，使用紫外检测器285nm下进行在线检测的图谱。

图2为实施例2使用三相逆流色谱系统分离丹参脂溶性化合物，使用紫外检测器280nm下进行在线检测的图谱。

具体实施方式

实施例1、黄芩水提物的分离纯化

使用琼脂糖基质凝胶Superose12与正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水(体积比为1-6-1.5-1.5-6)体系构成本发明的三相逆流色谱系统的三相，来分离纯化黄芩水提物，具体步骤为：

1)按照1∶6∶1.5∶1.5∶6的体积比，将正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙酸和水混合，并在分液漏斗中平衡2h，混合液分为上下两相，得到正己烷-乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水溶剂体系；将上下相分离；

2)使用Superose12凝胶(GE Healthcare，颗粒平均直径10μm)作为固态固定相；将步骤1)中的溶剂体系中极性与固态固定相相近的下相作为液态固定相；将Superose12凝胶与下相溶液混合，Superose12凝胶的加入量与下相溶液的比例为2g/L；以60r/min的速度搅拌混合液，使Superose12凝胶均匀分布于下相溶液中，得到本发明三相逆流色谱系统的固定相，其中包括了固态固定相和液态固定相；

将步骤1)中的溶剂体系中极性与固态固定相不相近的上相作为三相逆流色谱的流动相；

3)将步骤2)得到的三相逆流色谱的固定相以9mL/min的流速泵满常规的逆流色谱的分离柱(聚四氟乙烯缠绕形成的螺旋管)，然后以500r/min的转速反向运转逆流色谱主机；同时以0.5mL/min的流速泵入流动相(即液态两相中的上相)；由固液两相构成的固定相在阿基米德螺线力、行星式离心力场和流动相的综合作用下保留在分离柱中；在逆流色谱的出口端加1Mpa的反压，待流动相从溢出口溢出时，三相间的平衡已经建立；30％的固定相保留在分离柱中；

4)将8mg黄芩水提物的粗制样品溶于4mL液态流动相中，经由进样圈推入，使其随流动相进入逆流色谱的分离柱中；

5)对黄芩水提物进行分离提纯；使用紫外检测器285nm下进行在线检测，并根据计算机软件采集的数据(见图1)收集各馏分，在液相色谱-质谱联用仪上将各馏分与化学对照品比对，确定第2个峰为黄芩素(纯度92％)。

实施例2、丹参脂溶性化合物的分离纯化

使用反相键合相硅胶C18与正己烷-乙醇-水(体积比为10-5.5-4.5)体系构成本发明的三相逆流色谱系统的三相，来分离纯化丹参脂溶性化合物，具体步骤为：

1)按照10-5.5-4.5的体积比，将正己烷、乙醇和水混合，并在分液漏斗中平衡2h，混合液分为上下两相，得到正己烷-乙醇-水溶剂体系；将上下相分离；

2)使用反相键合相硅胶C18(碳18)(GE Healthcare，颗粒平均直径5μm)作为固态固定相；将步骤1)中的溶剂体系中极性与固态固定相相近的上相作为液态固定相；将反相键合相硅胶C18与下相溶液混合，C18的加入量与下相溶液的比例为1g/L；以60r/min的速度搅拌混合液，使反相键合相硅胶C18均匀分布于上相溶液中，得到本发明三相逆流色谱系统的固定相，其中包括了固态固定相和液态固定相；

将步骤1)中的溶剂体系中极性与固态固定相不相近的下相作为三相逆流色谱的流动相；

3)将步骤2)得到的三相逆流色谱的固定相以9mL/min的流速泵满常规的逆流色谱的分离柱(聚四氟乙烯缠绕形成的螺旋管)，然后以600r/min的转速正向运转逆流色谱主机；同时以0.5mL/min的流速泵入流动相(即液态两相中的上相)；由固液两相构成的固定相在阿基米德螺线力、行星式离心力场和流动相的综合作用下保留在分离柱中；在逆流色谱的出口端加0.7Mpa的反压，待流动相从溢出口溢出时，三相间的平衡已经建立；38％的固定相保留在分离柱中；

4)将10mg丹参脂溶性粗制样品溶于3mL液态流动相中，经由进样圈推入，使其随流动相进入逆流色谱的分离柱中；

5)对丹参脂溶性粗制样品进行分离提纯；使用紫外检测器280nm下进行在线检测，并根据计算机软件采集的数据(见图2)，收集各馏分，在液相色谱-质谱联用仪上将各馏分与化学对照品比对，确定第5个峰为丹参酮IIA(纯度95％)。