用于促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的药物及制备方法

摘要

本发明提供一种用于促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的药物及制备方法，由包裹生长激素释放激素表达质粒pCMV－Rep－GHRH的PLGA微球构成，通过给怀孕母猪注射上述PLGA微球包裹质粒pCMV－Rep－GHRH，使母猪体内表达GHRH，从而提高母猪体内的GH水平，最终达到促进仔猪生长、提高免疫力的目的。本发明为应用基因转移技术促进仔猪的生长和提高免疫力提供了新的有效的药物。

说明书

技术领域：

本发明涉及用于促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的药物及制备方法，涉及与生长激素调节有关的基因及其在动物体内的表达，属于提高动物生产性能的基因药物及其应用领域。

背景技术：

生长激素(growth hormone，简称GH)是调解动物和人生长的主要激素，具有促进生长、提高瘦肉率、抑制脂肪合成和提高免疫力的作用，在畜牧业上有着重要的应用价值。GH的水平高低主要受正性调控因子生长激素释放激素(growth hormone releasing hormone，简称：GHRH)和负性调控因子即生长激素释放抑制激素(somatostatin，SS)或简称生长抑素的调控。GHRH控制着GH的脉冲式分泌，SS控制着基础分泌，且SS对GHRH有拮抗作用，影响GHRH基因的表达。GHRH于上世纪80年代首次由人的胰腺异位肿瘤中分离到，后证实在下丘脑的弓状核可分泌GRF，并由门脉系统进入血液，后作用于脑垂体，使细胞内的cAMP和Ca⁺⁺浓度升高，从而促进GH的合成与释放，提高血中GH的浓度。SS在1978年首次分离到，它有二种形式即SS14和SS28。SS不仅存在于下丘脑，也存在于胃肠道，是一种脑肠肽。体内和体外实验均表明，SS能抑制脑垂体细胞的cAMP生成，提高cGMP的浓度，从而抑制GH的释放，降低血中GH的浓度。GRF的释放受GRF和SS的共同调节，其中，GRF控制着GH的脉冲式分泌，SS控制着基础分泌，且SS对GRF有拮抗作用，影响GRF基因的表达。GRF与SS每隔3-4小时进行交替性分泌，以协同控制GH的水平。另外，GH本身也存在负反馈调解作用。因此，GRF、SS和GH本身是决定体内血中GH水平的三个相互作用、相互影响的因素。提高动物体内GHRH的水平，可以提高动物GH的水平，达到提高动物生产性能的目的。

GH对胎儿的生长和发育起着重要的调节作用。

将GHRH的基因克隆到真核表达载体，并转移到动物体内表达，可以促进GH的释放，从而起到发挥GH的生物学作用。

仔猪生产是养猪业的关键环节，由于仔猪本身的生理特点，对其饲养管理难度较大。特别是现代集约化养殖猪场，为了提高母猪的生产效力和降低饲养成本，大多采用早期隔离断奶技术。但是，早期断奶后的仔猪，由于提早离开母猪、转移到新的栏舍、重新合群，高度密集，建立新的等级次序以及饲料和营养的突变等不良因素或应激原的作用，容易引起断奶应激反应。对仔猪生长、行为、体重、机体免疫系统、疾病发生等产生不良的影响，造成重大的经济损失。早期断奶仔猪生长缓慢，增重显著下降。断奶应激降低了仔猪植物血凝素诱导的T淋巴细胞转化率及白细胞吞噬机能。一方面由于断奶应激血清皮质醇浓度升高，血清生长激素和胰岛素含量水平降低。早期断奶可使仔猪断奶后应激性疾病的发生率高达73％左右，死亡率为8％左右，其中以断奶后腹泻发病率最高。还可产生僵猪综合症。上述情况造成了养猪业的巨大损失。

目前，克服上述问题的方法主要有增加饲料的营养水平、日粮酸化、日粮添加外源性消化酶、改善饲养环境、添加抗生素、小肽及其它添加剂等方法，成本高，实际效果有待于进一步提高。

通过给怀孕猪母注射GHRH表达质粒，提高其GH的水平，促进仔猪的生长发育，特别是提高垂体GH分泌细胞的功能，从而达到促进仔猪出生后的生长、提高免疫力的目的。

发明内容

本发明提供了一种用于促进仔猪生长、提高仔猪免疫力的药物，通过给怀孕母猪肌肉注射，以促进仔猪生长、提高免疫力。

本发明还提供了上述药物的制备方法，包裹GHRH表达质粒pCMV-Rep-GHRH的PLGA微球，在生长激素释放激素表达质粒pCMV-Rep-GHRH外有聚乳酸-乙醇酸包裹层。

本发明的药物为一种包裹pCMV-Rep-GHRH的PLGA微球，其中，在pCMV-Rep-GHRH外有聚乳酸-乙醇酸包裹层。

本发明的技术解决方案如下：

1、质粒的构建

采用化学合成的方法，制得两端带有Bam H I位点的猪GHRH(1-32)的基因，用BamH I酶切，电泳后回收GHRH片段。同时用BamH I酶切pCMV-Rep-LacZ载体，电泳后回收载体大片段，回收产物用碱性磷酸酶去磷酸化后，与目的片段用T4连接酶连接，电击法转化至大肠杆菌DH10B感受态菌，蓝白斑筛选重组质粒，酶切、pCR鉴定(见附图)正确后，需进行基因插入方向的鉴定。根据载体上靠近lacZ基因上下游的序列设计两条引物(P3：5’端载体引物；P4：3’端载体引物)，分别为：P3 GTGTCTTAAGACTAATATCGCG；P4 TTTGCCTTTCTCTCCACAGT。用基因的5′端和3′端引物都分别和载体引物之一进行PCR扩增，2.5％琼脂糖上电泳30min，紫外灯下观察结果。最终鉴定得到含猪GHRH(1-32)的表达质粒pCMV-Rep-GHRH(见附图1)。

2、质粒的提取

采用碱变性的方法，大量制备GHRH表达质粒。

3、PLGA微球的制备

用复-乳蒸发法，制备包裹pCMV-Rep-GHRH质粒的聚乳酸和聚乙醇酸(PLGA)微球，粒径在10um以下，载DNA量为10μg质粒/mg PLGA。制备的微球见附图4。

4、灭菌

微球用75％乙醇浸泡30分钟灭菌，无菌生理盐水洗涤3次，再用无菌生理盐水悬浮。

5、母猪的注射

母猪怀孕后60-80天，后肢肌肉注射上述制备的包裹GHRH表达质粒pCMV-Rep-GHRH的PLGA微球。注射剂为含1-3mg质粒DNA的PLGA微球。

经动物实验表明，处理能提高仔猪出生重量，促进仔猪出生后的生长，提高免疫力。

具体实验结果见实验例1、2：

实验例1

将12头怀孕70天的母猪(松原黑猪)随机分成3组，第一组注射含1mg pcDNA3-GHRH的PLGA微球，第二组注射生理盐水，注射部位为后肢肌肉。分别于出生时、出生后20天、60天称重结果用SSPS10.0统计分析软件进行方差分析和多重比较。第一组仔猪出生重、出生后20天、60天重量分别比对照组提高了117％、54％和45％。结果见表1。

表1母猪注射后仔猪出生重、出生后20天、60天后体重

^*：与对照组(第二组)相比，P＜0.05。

实验例2

上述实验处理中，每组随机选取8头仔猪，出生后20天采血，分离血清，测定血清IgG、溶血素；同时分离白细胞，进行玫瑰花环形成试验。三个检测的指标都表明仔猪免疫功能的增强。结果见表2

表2出生后20天仔猪免疫功能检测结果

  测定项目  N  第一组  第二组  成环率(％)  溶血素OD值  IgG含量(mg/mL)  8  8  8  17.65±1.59^*  0.10±0.03^*  10.92±2.9^*  13.15±1.28  0.06±0.02  7.43±1.4

^*：与对照组(第二组)相比，P＜0.05。

本发明的积极效果在于，提供了一种能促进仔猪生长、提高免疫机能的新药物(制剂)，通过基因转移新技术，在怀孕母猪肌肉组织表达GHRH，提高GH的水平，促进胎儿的生长发育，从而促进仔猪的生长和提高免疫能力，最终达到提高养猪业经济效益的目的。

附图说明

图1猪GHRH表达质粒pCMV-Rep-GHRH。

图2pCMV-Rep-GHRH酶切鉴定。

1，2.pCMV-Rep-GHRH；

M.DL2000Marker

图3pCMV-Rep-GHRH PCR鉴定。

M.DL2000Marker；1，2.Negative Control；

3-8.pCMV-Rep-GHRH

图4制备的PLGA微球。

具体实施方式：

下列实施例旨在进一步举例描述本发明，而不是以任何方式限制本发明。在不背离本发明的精神和原则的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明权利要求范围之内。

实施例1

质粒的构建

采用化学合成的方法，制得两端带有Bam H I位点的猪GHRH(1-32)的基因，用BamH I酶切，电泳后回收GHRH片段。同时用BamH I酶切pCMV-Rep-LacZ载体，电泳后回收载体大片段，回收产物用碱性磷酸酶去磷酸化后，与目的片段用T4连接酶连接，电击法转化至大肠杆菌DH10B感受态菌，蓝白斑筛选重组质粒，酶切、PCR鉴定(见附图)正确后，需进行基因插入方向的鉴定。根据载体上靠近lacZ基因上下游的序列设计两条引物(P3：5’端载体引物；P4：3’端载体引物)，分别为：P3 GTGTCTTAAGACTAATATCGCG；P4 TTTGCCTTTCTCTCCACAGT。用基因的5′端和3′端引物都分别和载体引物之一进行PCR扩增，2.5％琼脂糖上电泳30min，紫外灯下观察结果。最终鉴定得到含猪GHRH(1-32)的表达质粒pCMV-Rep-GHRH(见附图)。

实施例2

质粒的提取

从新鲜转化质粒的JM109转化菌平板上，挑取单个菌落接种至50ml LB液体培养基(含Amp100μg/ml)中，37℃振荡培养至OD260约0.6，取50ml培养物接种到2000ml液体LB培养基(含Amp100μg/ml)中，继续在37℃振荡培养20小时左右。将上述培养物经5000rpm离心10分钟，弃上清，菌体沉淀，重新悬浮于200ml冰预冷的STE(0.1mmol/L NaCl，10mmol/L Tris HCl pH8.0，1mmol/L EDTA)中，洗涤菌体，再离心收集菌体置-20℃冰箱保存。向菌体中分别加入24ml溶液I(50mmol/L葡萄糖，25mmol/L Tris-HCl pH8.0，10mmol/LEDTA，高压蒸气灭菌15min)，充分悬浮后，加入1.2ml 10mg/ml的溶菌酶，4℃30min。加入48ml溶液II(0.2mol/L NaOH，1％SDS)，盖紧离心管，缓缓地颠倒离心管数次，充分混匀内容物，冰浴5min。加入36ml溶液III(60％5mol/L KAc，11.5％冰乙酸)摇动离心管混匀内容物，冰浴10min，8000rpm离心30min。取上清(用灭菌干酪布过滤)加入0.7～1倍体积异丙醇，混匀，室温作用20min或37℃水浴5min。12000rpm离心15min，弃上清，沉淀用3ml TE溶解轻轻混匀；加入3.6ml冰预冷5mol/L氯化锂，混匀，4℃12000rpm离心10min。上清加入等体积异丙醇，混匀，室温作用20min或37℃水浴5min，4℃12000rpm离心10min。500μl TE溶液溶解沉淀。用等体积的酚、酚：氯仿异戊醇和氯仿各抽提一次，水相加入1/10倍3M醋酸钠和二倍体积无水乙醇，-20℃放置20min。4℃12000rpm离心10min，用200μl70％酒精洗涤，在无菌条件下干燥，质粒溶解于1ml 0.9％NaCl溶液中。取1μl质粒DNA溶液，加蒸馏水至200μl中，在GeneQuant测定质粒的DNA含量。

实施例3

微球制备工艺如下：

(1)取pCMV-Rep-GHRH质粒溶液500μl，置25ml烧杯中，加入CH2Cl21.35ml，丙酮0.1 5ml，PLGA 0.25g，充分溶解。

(2)超声功率为15W，间隔3S超声3S，超声时间40～70S，使溶液均匀。

(3)向每个烧杯中加入4％的PVA8ml，超声60～120S。(取1滴混悬液轻轻滴入水溶液中，观察能否沉散)。

(4)向每个烧杯中加入0.4％PVA20ml，室温磁力搅拌8～10h。

(5)用4层灭菌尼龙布将上述溶液过滤至一40ml无菌离心管(精确称取离心管重量)中，尽量让溶液滤尽。

(6)将收集的溶液10000～12000rpm离心10min。

(7)取上清，估测体积，同时对上清进行核酸含量测定。

(8)用20ml蒸馏水重悬沉淀，按(5)、(6)步骤操作2次。

(9)弃掉上清，沉淀放置-20℃冰箱保存。

本品为白色粉末，注射时用无菌生理盐水制备悬浊液。