一种抗尿激酶型纤溶酶激活剂受体的抗体样分子ATF－Fc融合蛋白及其用途

摘要

本发明公开了一种抗尿激酶型纤溶酶激活剂受体的抗体样分子ATF－Fc融合蛋白及其应用，属于生物制药领域。一种ATF－Fc融合蛋白，它是uPA的ATF区与人免疫球蛋白IgG1的Fc段、重链恒定区2和重链恒定区3通过Ser－Gly－Ser－Gly－Ser接头连接形成的二聚体融合蛋白，具有742个氨基酸；单链ATF－Fc分子具有序列表SEQ IDNo.1所示的氨基酸序列，其中前20个氨基酸为uPA的信号肽。本发明的优点是：无抗原性、亲和力高、封闭位点特异、具有抗体的ADDC效应和CDC效应、半衰期长，与人源抗体相近、可抑制过度表达uPAR的肿瘤细胞的生长和转移。本发明提供了一种治疗晚期恶性肿瘤的、安全、有效的抗uPAR的的人源抗体类ATF－Fc融合蛋白。

说明书

技术领域

本发明涉及一种抗尿激酶型纤溶酶激活剂受体(uPAR)的抗体样分子ATF-Fc融合蛋白及其在肿瘤治疗中的用途，属于生物制药领域。

背景技术

尿激酶型纤溶酶激活剂(urokinase-type plasminogen activator，uPA)是由411个氨基酸残基组成的蛋白质，包括没有酶催化活性的单链uPA(scu-PA)和有酶催化活性的双链uPA(tcu-PA)，单链uPA也称尿激酶原(Pro-UK)，在纤溶酶、胰蛋白酶和激肽释放酶等作用下，Lys158-Ile159间的肽键断裂后形成的有激活纤溶酶原功能的双链uPA(即尿激酶，UK)。

天然的uPA是由411个氨基酸组成的分子量约52-54kD的糖蛋白，有12对二硫键，一个N-糖基化位点(Asn302)和一个O-糖基化位点(Thr18)，具有三个蛋白结构域(图1)：(1)类表皮生长因子区(EGF-like区，第5-49位氨基酸残基组成)，主要负责与uPA受体(uPAR)结合；(2)Kringle区(50-135aa)，可能与趋化活性相关；(3)丝氨酸蛋白酶活性部位区，是uPA发挥其纤维蛋白溶解活性的主要结构域，其中His204、Asp255和Ser356构成酶的活性中心。

uPA的EGF-like区和Kringle区合称为ATF(Amino-Terminal Fragment，ATF)。uPA的许多重要功能都与ATF相关，比如与uPA受体(uPAR)结合及生物趋化性。uPA一系列重要功能的发挥有赖于与uPAR(urokinase-type plasminogen activator receptor，uPAR)的结合。uPAR由三个结构域组成(D1，D2，D3)，通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞表面。D1结合uPA后，uPAR转变为活性状态，具有高度的趋化活性。uPA通过EGF结构域与uPAR结合，附着在细胞表面，激活纤溶酶原(plasminogen)，使之转变为有催化活性的纤溶酶(plasmin)，继而plasmin则激活与胞外基质降解相关的酶，如金属基质蛋白酶等，降解胞外基质，促进肿瘤细胞迁移。最近很多研究表明，几乎所有的恶性肿瘤，尤其是晚期，其肿瘤细胞膜上都过量表达uPAR，uPA及其受体uPAR在结肠癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌、前列腺癌和肺癌等多种恶性肿瘤侵袭转移中起着关键作用。uPA-uPAR系统参与了肿瘤生长、血管生成和转移，uPAR已经成为抗癌治疗的新的靶标。目前国内外还没有研制ATF-Fc融合蛋白的报道。

发明内容

本发明要解决的主要技术问题是提供一种安全、有效的抗uPAR的人源抗体类人工蛋白ATF-Fc融合蛋白。

本发明要解决的另一个技术问题是提供一种遗传性状稳定、表达量高的ATF-Fc融合蛋白的表达载体。

本发明要解决的最后一个问题是提供ATF-Fc融合蛋白和含有编码该融合蛋白的基因的表达载体在制备治疗癌症的药物中的用途。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种ATF-Fc融合蛋白，是uPA的ATF区(EGF-like区+Kringle区，高分子量uPA的第1-134位氨基酸)与人免疫球蛋白IgG1的Fc段(铰链区(Hinge region)、重链恒定区2(CH2)和重链恒定区3(CH3))通过Ser-Gly-Ser-Gly-Ser接头(linker)连接形成的二聚体融合蛋白(图2)，单链ATF-Fc分子具有序列表SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，共391个氨基酸残基；其中前20个氨基酸为uPA的信号肽，所以成熟的单链ATR-Fc有371aa，二聚体为742aa。

本发明研制的ATF-Fc融合蛋白是一种anti-uPAR的人源抗体类人工蛋白，ATF负责与uPAR结合，而人IgG1的Fc段则发挥抗体分子的生理功能，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒效应(ADCC)、补体依赖性细胞毒效应(CDC)或免疫调理作用，从而靶向性杀死uPAR过度表达的肿瘤细胞。

编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc融合蛋白单链的基因，具有序列表SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。

编码具有序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的ATF-Fc的融合蛋白单链的基因，包括但不限于SEQ ID No.2。运用本领域公知技术，可以依据所采用的表达系统而设计其偏好的编码核苷酸序列以提高表达效率，例如可采用酵母表达系统或大肠杆菌表达系统的偏好密码子等。所有能够表达序列表SEQ ID No.1所示氨基酸序列的编码核苷酸序列均属于对本发明的等同替换。另外，运用本领域公知技术，可以运用其他linker连接ATF和Fc两段肽段，甚至可以不用linker连接ATF和Fc。所有包含ATF和人IgG Fc组成的ATF-Fc同源二聚体融合蛋白均视为本发明的等同蛋白。

含有SEQ ID No.2所示核苷酸序列的表达载体，这些表达载体可以是商业来源的或者经过结构改进而构建得到的。

含有上述表达载体的细胞，包括但不限于原核或者真核细胞，例如大肠杆菌、酵母和CHO细胞等。

本发明构建的ATF-Fc融合蛋白是采用基因重组技术在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)中表达的，具体过程为：

(1)ATF基因克隆，以pIRES-dhfr/HMW-ProUK载体为模板(该表达载体在中国微生物菌种保臧管理委员会普通微生物中心保存，保臧日为2006年2月24日，保藏号为CGMCC No.1623，参据的微生物株为pIRES-dhff/HMW-ProUK，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，中国发明专利200610065813.4)，以引物ATFs和ATFx为上下游引物，PCR扩增ATF基因，回收ATF基因。

ATFs：5’-TGCGCTAGCCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCG-3’

ATFx：5’-CGCGGATCCACTTACCTGTACTGCCAGATCCGCTTCCATCTGCGCAGTCATGCAC-3’

(2)构建ATF-Fc融合蛋白的真核表达载体，以Nhe I和BamH I双酶切ATF基因，同时用Nhe I和BamH I双酶切载体pcDNA3.1/ATR-Fc(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为：CGMCC No.1399，中国发明200510084233.5)，回收表达载体pcDNA3.1/Fc，将回收的两段DNA用T4连接酶连接，转化大肠杆菌，挑选阳性克隆进行酶切鉴定和双向序列测定，得到表达ATF-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc。

(3)转染CHO细胞并筛选高表达的阳性克隆，将表达ATR-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc用脂质体方法转染至CHO-K1细胞中，用G418筛选并获得ATF-Fc表达水平为10-15μg/(10⁶cells·d)的基因工程CHO细胞系ATF-Fc-H6。

(4)细胞培养并纯化重组ATF-Fc蛋白，用转瓶无血清培养ATF-Fc-H6细胞，收集上清采用蛋白A纯化重组蛋白，并用ELISA法鉴定ATF-Fc既具有与anti-uPA多克隆抗体结合的特性，表明ATF-Fc中的ATF保持了uPA中ATF相同的结构特性，又可以与anti-human IgG1 Fc的多克隆抗体结合，表明ATF-Fc具有人IgG Fc的结构特性。

(5)细胞和动物实验评价ATF-Fc抗肿瘤的生物学活性，用人乳腺癌细胞系、胃癌细胞系和食管癌细胞系评价了ATF-Fc抑制肿瘤细胞生长和转移的特性，结果表明，ATF-Fc对乳腺癌细胞系有很强的杀伤作用，对胃癌细胞系有一定的杀伤作用并能抑制细胞迁移，对食管癌细胞系没有杀伤作用，但有一定的抑制其迁移的作用。在裸鼠荷瘤实验中，ATF-Fc表现出较好的抑制肿瘤生长和转移的疗效，并且疗效与剂量呈明显的正相关性。

本发明构建的ATF-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏日期为2006年8月3日，登记入册编号为：CGMCC No.1774，保存的微生物株名称为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，(地址：北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所，100080)。采用Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒(Invitrogen Co)将该载体(CGMCCNo.1774)转染CHO-K1细胞(ATCCNo.CRL9096)，经G418筛选克隆获得了表达水平较高的表达ATF-Fc的基因工程CHO细胞系ATF-Fc-H6，该细胞系的表达水平约10-15μg/(10⁶cells·d)，并且连续传代培养1年，表达水平没有变化。

ATF-Fc融合蛋白和用于表达ATF-Fc的真核表达载体真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc(CGMCC No.1774)用于制备治疗肿瘤的药物的用途。

所述肿瘤为乳腺癌、胃癌及其他uPAR高表达肿瘤。

本发明的尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA)与其受体(uPAR)结合的关键结构域ATF与人免疫球蛋白IgG1的重链恒定区Fc连接形成的ATF-Fc融合蛋白可用于制备uPAR过量表达的肿瘤的治疗药物的应用。

由于ATF-Fc融合蛋白既保留了uPA中与uPAR结合的关键结构域ATF，又缺失了uPA中激活纤溶酶原(plasminogen)的酶活性中心，这样ATF-Fc可与uPA竞争性结合uPAR，阻止uPA与uPAR结合，阻断plasminogen的活化，从而抑制了胞外基质的降解和细胞的迁移。另一方面，由于ATF-Fc具有Fc段，结合到uPAR高表达的肿瘤细胞表面后，可以通过CDC效应、ADCC效应、促进吞噬作用及诱发细胞凋亡等作用，杀死肿瘤细胞，即ATF-Fc与anti-uPAR的人源抗体具有相同功能，只是ATF-Fc具有更高的亲和力，并且封闭的uPAR位点正是与uPA结合的区域，因而较anti-uPAR抗体具有更好的疗效。细胞和动物实验证实：ATF-Fc可明显抑制乳腺癌细胞和胃癌细胞的生长和转移，该融合蛋白值得进一步研究并开发成治疗乳腺癌、胃癌细胞及其他uPAR过度表达的肿瘤的抗体类药物。

本发明的优点是：这种融合蛋白可与抗原高亲和力结合，相当于抗体的Fab片段，而Fc段又提供了抗体的生物学活性，它有以下特点：(1)无抗原性，ATF和Fc两段蛋白均来自人体；(2)亲和力高，一般配体和受体的亲和力都较高(Kd～10^-10M)，uPA与uPAR结合的亲和常数Kd～10^-10M；(3)封闭位点特异，由于uPAR有308aa，具有多个抗原表位，因此有可能筛到高亲和力的anti-uPAR单克隆抗体可能不能阻止uPA与uPAR结合，而ATF-Fc特异性封闭uPAR结合uPA的结构域，从而阻止uPA与uPAR的结合；(4)也具有抗体的ADDC效应和CDC效应；(5)半衰期长，与人源抗体相近(10～20天左右)。

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明，不以任何方式限制本发明的实施。凡是依照本发明公开的内容进行的任何本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。

附图说明

图1为尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)一级结构示意图。

图2为ATF-Fc结构示意图。

图3为真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc Nhe I/Xho I酶切鉴定电泳图。

图4-A为获得的rCHO工程细胞系ATF-Fc-H6的形态图。

图4-B为筛选到的32个单克隆细胞测定其表达ATF-Fc水平的ELISA照片。

图5为SDS-PAGE检测纯化的ATF-Fc蛋白。

图6-A为ATF-Fc融合蛋白杀伤乳腺癌细胞系MCF-7的实验中正常生长的乳腺癌细胞系MCF-7。

图6-B为ATF-Fc融合蛋白杀伤乳腺癌细胞系MCF-7的实验中：培养基中ATF-Fc浓度为1.25μg/ml时乳腺癌细胞系MCF-7的形态，可见所有细胞已萎缩凋亡。

图6-C为ATF-Fc融合蛋白杀伤乳腺癌细胞系MCF-7的实验中：培养基中ATF-Fc浓度为2.5μg/ml时乳腺癌细胞系MCF-7的形态，可见所有细胞已萎缩凋亡。

图6-D为ATF-Fc融合蛋白杀伤乳腺癌细胞系MCF-7的实验中培养基中：ATF-Fc浓度为5μg/ml时乳腺癌细胞系MCF-7的形态，可见所有细胞已萎缩凋亡。

图7为ATF-Fc融合蛋白对几种肿瘤细胞迁移的抑制试验结果。

图8-A为ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌细胞BGC-823迁移试验：显示未加入ATF-Fc融合蛋白的对照组试验结果，有新生肿瘤细胞迁移到划痕处生长。

图8-B为ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌细胞BGC-823迁移试验：显示加入ATF-Fc融合蛋白的试验组，无新生肿瘤细胞，表明能够抑制肿瘤细胞迁移。

图8-C为ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌细胞BGC-823迁移试验：显示加入Pro-UK的试验组，有大量新生肿瘤细胞迁移到划痕处生长，提示Pro-UK诱导肿瘤细胞迁移。

图8-D为ATF-Fc融合蛋白抑制胃癌细胞BGC-823迁移试验：显示加入ATF-Fc融合蛋白和Pro-UK的试验组，没有新生肿瘤细胞迁移到划痕处生长，提示ATF-Fc融合蛋白抑制了Pro-UK诱导肿瘤细胞迁移。

图9为ATF-Fc融合蛋白对裸鼠接种胃癌细胞BGC-823抑制肿瘤生长的作用结果。

具体实施方式

试验材料及来源：

感受态大肠杆菌DH5α购自天为时代公司，CHO-K1细胞株(ATCC No.CRL 9096)、dhfr基因、pro-UK基因本研究室保存(中国专利CN96119836.2)、质粒pUC19(TakaraBiotechnology Co.，产品号No.D3219)，pcDNA3.1真核表达载体(Invitrogen公司)，源自基因组(含有内含子)的编码人免疫球蛋白IgG1Fc段(铰链区、CH2区和CH3区)的基因(美国R&D Systems公司，载体名为：pIG1，产品编号为：pIg vectors，MBV-002-10)。

限制性内切酶Nhe I、BamH I、Hind III、Xho I和Not I等购自NEB公司，T4 DNA连接酶及高保真Taq酶Pyrobest购自宝生物工程有限公司(TaKaRa)。质粒提取、PCR产物回收及酶切产物回收试剂盒均购自Promega公司。DNA Marker购自天为时代公司。

DMEM培养基、DMEM/F12培养基及加强型小牛血清购自Hyclone公司；无血清培养基添加物为本室配制(中国专利ZL 200310124257.X)；G418购自Sigma公司；Lipofectamine^TM2000购自Invitrogen公司；酶联检测仪为Bio-Rad550；nProtein A Sepharose4Fast Flow分离介质购自Amersham Bioscience。

所有寡核苷酸的引物合成均由中国英骏生物技术公司完成(China Invitrogen公司)。

实施例1.ATF基因的克隆及pcDNA3.1/ATF-Fc真核表达载体构建

以pIRES-dhfr/HMW-ProUK载体为模板(该表达载体在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，保藏日为2006年2月24日，保藏号为CGMCC No.1623，参据的微生物株为pIRES-dhfr/HMW-ProUK，建议的分类命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli，中国发明专利申请号为200610065813.4)，以引物ATFs和ATFx为上下游引物，PCR扩增ATF基因，回收ATF基因。

ATFs：5’-TGCGCTAGCCCACCATGAGAGCCCTGCTGGCGCG-3’

ATFx：5’-CGCGGATCCACTTACCTGTACTGCCAGATCCGCTTCCATCTGCGCAGTCATGCAC-3’

PCR反应体系为：8μL dNTP(2.5mmol/L)、0.5μL Pyrobest聚合酶、2μLpIRES-dhfr/HMW-ProUK载体、10μL 10×Buffer、2μL ATFs上游引物(10μmol/L)、2μL ATFx下游引物(10μmol/L)、75.5μL水，总反应体系为100μL，PCR反应条件：94℃，2min(预变性)→[94℃，30s→60℃，60s→72℃，1min]×25循环→72℃，5min→4℃，5min。用0.8％-1％低熔点琼脂糖胶回收PCR产物(Promega，Agarose LMP)。

PCR产物回收试剂盒回收的ATF基因用Nhe I和BamH I双酶切，同时用Nhe I和BamHI双酶切载体pcDNA3.1/ATR-Fc(已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，登记入册编号为：CGMCC No.1399，中国发明专利申请号为200510084233.5)，回收表达载体pcDNA3.1/Fc，将回收的两段DNA用T4连接酶连接，转化大肠杆菌DH5α，挑选阳性克隆经摇瓶培养，提取质粒后用引物进行酶切鉴定和双向序列测定，泳结果表明ATF-Fc基因片段大小约2000bp(图3)，测序结果证明，ATF-Fc重组基因序列与设计基因完全一致，该基因含有NheI和BamHI酶切位点、Kozak序列、ATF基因，得到表达ATF-Fc融合蛋白的真核表达载体pcDNA3.1/ATF-Fc。

实施例2.脂质体转染与细胞培养

转染采用Invitrogen公司生产的Lipofectamine^TM2000阳离子脂质体转染试剂盒，按照试剂盒说明书操作。转染的CHO-K1细胞培养于5％CO2、37℃温箱。转染12h后，换含10％加强型小牛血清(Hyclone)的DMEM/F12培养基(Hyclone)。48h后，采用750μg/mL G418(Sigma)筛选培养基加压筛选，每2-3d换液一次，加压约12d后，将抗性细胞克隆用0.25％的胰酶消化，用有限稀释法在96孔微孔细胞培养板(NUNC公司)中进行单克隆化培养，即用含10％小牛血清和300μg/mL G418的DMEM/F12培养基将细胞稀释至10个/mL，在每个微孔中接种200μL培养基(平均每个孔中含有约2个细胞)，2周后出现细胞克隆。换无血清培养基继续培养3d，收集培养上清以直接竞争ELISA挑选阳性克隆，即将无血清培养上清直接包被NUNCTM酶联板4℃过夜，3％BSA封闭后加入HRP标记山羊抗人IgG(H+L)，孵育后加入TMB试剂显色，405nm测OD值(图4-B)。以无血清培养基为阴性对照，表达水平较高的细胞克隆出现的几率约为10％-20％(图4(B))。

选择表达水平最高的基因重组CHO工程细胞系ATF-Fc-H6(图4-A)于1000mL转瓶中用含2％小牛血清的DMEM/F12培养基培养，培养温度为37℃，待细胞长满瓶壁时(约3天)，换为无血清培养基(中国专利ZL200310124257.X)，隔天收液，可连续收液3-4次(培养方法请参考：高丽华，胡显文，陈薇等.炭疽毒素受体与人IgG1的Fc段融合蛋白在CHO细胞中的表达.生物工程学报，2005，21(5)：826)。

实施例3.表达蛋白的纯化及SDS-PAGE分析

收集的ATF-Fc-H6无血清培养上清用蛋白A亲和层析柱(Pharmacia)分离纯化。利用蛋白A对IgG的特异性吸附作用，采用nProtein A Sepharose 4 Fast Flow分离介质(Amersham Biosciences)进行亲和层析，纯化表达蛋白。操作方法参见产品说明。结合的蛋白用pH2.5、0.1mol/L甘氨酸-HCl缓冲液洗脱，有一明显的洗脱峰(图4(A))，洗脱成分用2mol/L的Tris-HCl缓冲液将洗脱液pH调至7。纯化后，以紫外分光光度计测定A₂₆₀和A₂₈₀吸光度推算蛋白浓度，蛋白定量公式为：蛋白含量(mg/mL)＝1.45×A₂₆₀-0.74×A₂₈₀。以SDS-PAGE测定蛋白的纯度、分子量。

如果ATF-Fc融合蛋白能够在CHO细胞中正确表达，表达的蛋白预计应是同源二聚体抗体样分子，即ATF-Fc单链在Hinge区通过链间二硫键连接成二聚体。单链ATF-Fc分子共有391个氨基酸残基。由于Fc段有糖基化位点，因此单链ATF-Fc的分子量预期在45-50kD。亲和层析纯化得到的ATR-Fc融合蛋白，分别在还原和非还原条件下进行SDS-PAGE分析，考马斯亮蓝染色。在非还原条件下，在97kD处有一条蛋白带，而在还原条件下，在45kD处有一条明显的蛋白带，并且没有其他的蛋白带(图5)。由于还原条件下所有二硫键包括链间二硫键都被打断，测得的分子量为单链ATF-Fc分子，而非还原条件下不同肽链仍通过二硫键连接，在非还原条件下的分子量正好是还原条件下分子量的两倍，表明我们获得的ATF-Fc融合蛋白为同源二聚体抗体样分子，与预期的结果相符。

实施例4.生物学活性一：ATF-Fc融合蛋白对乳腺癌细胞MCF-7的杀伤效应

为了检测所表达的ATF-Fc融合蛋白是否具有杀伤肿瘤细胞的效果，做了肿瘤细胞杀伤实验。方法：在24孔细胞培养板(Costar公司产品)中用含10％的胎牛血清(Hyclone公司产品)的DMEM培养基(Hyclone)培养乳腺癌细胞MCF-7(ATCC，Cat.No.HTB-22)，37℃培养，待细胞长到融合率80％时，加入ATF-Fc蛋白(终浓度分别为1.25、2.5和5μg/ml)，继续在37℃培养24小时后，观察ATF-Fc对细胞的杀伤效果。结果：发现几乎100％的乳腺癌细胞被杀死，而对照组的乳腺癌细胞生长正常(图6-A至图6-D)，证明我们构建的ATF-Fc融合蛋白有着很强的杀伤乳腺癌细胞MCF-7的作用。因此本发明可用于人乳腺癌治疗的抗体类药物的开发。

实施例5.生物学活性二：ATF-Fc融合蛋白对几种肿瘤细胞迁移的抑制效应

由于uPAR在肿瘤细胞的迁移中起着举足轻重的作用，封闭uPAR可能会抑制肿瘤细胞的迁移。ATF-Fc具有封闭uPAR的作用，观察了ATF-Fc对肿瘤细胞迁移的影响。

方法：分别在24孔细胞培养板(Costar公司产品)中用含10％的胎牛血清(Hyclone公司产品)的DMEM培养基(Hyclone)培养乳腺癌细胞系MCF-7、胃癌细胞系BGC-823(可通过以下实验室获得，Istituto Nazionale per la Ricerca sul Cancro c/o CBA(ICLC，Genova)，细胞系编号为ICLC HTL98007，www.biotech.ist.unige.it/cldb/cl4930.html)和食管癌细胞系EC109细胞株(购自中科院上海细胞所)。37℃培养，待细胞长到融合率80％时，划痕，加入ATF-Fc蛋白(终浓度为5μg/ml)，设立pro-UK(来源：中国专利CN96119836.2)和低分子量UK(来源：中国专利200610065813.4)(终浓度均为1μg/ml)对照组，继续在37℃培养24小时后，观察ATF-Fc对细胞迁移的影响。结果(见图7和图8)：(1)对于乳腺癌细胞MCF-7，只要含有ATF-Fc融合蛋白的培养孔，其中的细胞均死亡，无法观察ATF-Fc抑制乳腺癌细胞MCF-7的迁移，而加入pro-UK和UK的对照组，所有的乳腺癌细胞均存活，并且密度很高，而且划痕处有新长出的细胞，说明pro-UK和UK均能刺激乳腺癌细胞MCF-7的生长和迁移；(2)对于胃癌细胞，经过24小时培养后，含有ATF-Fc融合蛋白的培养孔有部分细胞被杀死，其中的细胞在划痕处均无新生长的细胞，说明ATF-Fc有很强的抑制胃癌细胞迁移并有一定的杀伤作用，培养48小时后杀伤效应表现更显著，相反，没有加入ATF-Fc的培养孔，尤其是加入了pro-UK或UK的培养孔，其中的细胞生长致密，并且划痕处长出了许多新细胞，说明pro-UK和UK能促进胃癌细胞的迁移；(3)对于食管癌细胞，无论是否含有ATF-Fc，细胞的生长均不受抑制，而ATF-Fc能轻微抑制鼻咽癌细胞的迁移。本实验表明ATF-Fc具有很强的抑制胃癌细胞迁移的作用，可用于开发治疗乳腺癌和胃癌的生物技术药物。

实施例6.生物学活性三：ATF-Fc融合蛋白对裸鼠接种胃癌细胞BGC-823抑制肿瘤生长的作用

选择对ATF-Fc中度敏感的胃癌细胞BGC-823做荷瘤实验，选择的理由是：如果ATF-Fc在小鼠体内对胃癌细胞具有很强的抑制生长和转移的作用，可以推测，ATF-Fc对于乳腺癌应具有更好的疗效。方法：取对数生长期的BGC-823细胞，用新鲜培养液DMEM(Hyclone)配制成5×10⁶个/mL的细胞悬液，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，接种后小鼠随机分为生理盐水组、CTX(环磷酰胺)组(100mg/kg)，ATF-Fc 100、40和8mg/kg三个剂量组，共5组，每组7只小鼠。待肿瘤长至约0.3cm×0.3cm体积大小是给药，给药方式：隔日皮下注射，共7次。给药体积为0.2ml/20g体重，末次给药后2天脱颈处死动物，解剖取瘤块，称瘤重，根据以下公式计算肿瘤生长抑瘤率：

ATF-Fc在剂量100、40、8mg/kg时，隔日皮下注射7次，对裸鼠BGC-823胃癌的抑瘤率分别为73.59、60.92、53.87％，结果见表1和图9。该结果表明，ATF-Fc在体内具有抑制胃癌生长的作用。

               表1：ATF-Fc连续皮下注射对裸鼠BGC-823胃癌的疗效

  组别  剂量  (mg/kg)  给药方案  动物数  始终    动物体重(g)  瘤重(g) x±SD  抑瘤率  ％  始  终  生理盐水  25ml/kg  s.c.×7  77  20.36  23.79  1.22±0.28  CTX  ATF-Fc  100  i.p.×7  77  20.52  19.98  0.22±0.05^**  81.93  8  s.c.×7  77  20.07  21.69  0.56±0.10^**  53.87  40  s.c.×7  77  20.60  21.67  0.48±0.19^**  60.92  100  s.c.×7  77  20.03  21.36  0.32±0.24^**  73.59

本发明提供了一种治疗晚期恶性肿瘤的、安全、有效的抗uPAR的的人源抗体类ATF-Fc融合蛋白。

                               序列表

<110>中国人民解放军军事医学科学院

<120>一种抗尿激酶型纤溶酶激活剂受体的抗体样分子ATF-Fc融合蛋白及其用途

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>391

<212>PRT

<213>人属，人种

<220>

<221>uPA的信号肽

<222>(1)..(20)

<400>1

Met Arg Ala Leu Leu Ala Arg Leu Leu Leu Cys Val Leu Val Val Ser

1                 5                     10                      15

Asp Ser Lys Gly Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp

              20                     25                     30

Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile

         35                     40                      45

His Trp Cys Lys Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile

     50                     55                     60

Asp Lys Ser Lys Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly

65                     70                     75                    80

Lys Ala Ser Thr Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser

                  85                      90                     95

Ala Thr Val Leu Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu

             100                     105                    110

Gln Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg

         115                    120                   125

Arg Arg Pro Trp Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln

    130                   135                     140

Glu Cys Met Val His Asp Cys Ala Asp Gly Ser Gly Ser Gly Ser Glu

145                   150                    155                    160

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

                  165                    170                    175

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

                 180                 185                    190

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

        195                      200                    205

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

    210                    215                    220

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

225                   230                     235                    240

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

                    245                     250                    255

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

             260                     265                    270

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

         275                      280                     285

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

    290                     295                    300

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

305                   310                    315                    320

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

                  325                     330                    335

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

              340                    345                    350

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

        355                     360                    365

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

    370                     375                    380

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

385                 390

<210>2

<211>1176

<212>DNA

<213>人属，人种

<400>2

atgagagccc tgctggcgcg cctgcttctc tgcgtcctgg tcgtgagcga ctccaaaggc    60

agcaatgaac ttcatcaagt tccatcgaac tgtgactgtc taaatggagg aacatgtgtg    120

tccaacaagt acttctccaa cattcactgg tgcaagtgcc caaagaaatt cggagggcag    180

cactgtgaaa tagataagtc aaaaacctgc tatgagggga atggtcactt ttaccgagga    240

aaggccagca ctgacaccat gggccggccc tgcctgccct ggaactctgc cactgtcctt    300

cagcaaacgt accatgccca cagatctgat gctcttcagc tgggcctggg gaaacataat    360

tactgcagga acccagacaa ccggaggcga ccctggtgct atgtgcaggt gggcctaaag    420

ccgcttgtcc aagagtgcat ggtgcatgac tgcgcagatg gaagcggatc tggcagtgag    480

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg    540

ggaccgtcag tcttcctctt ccccccaaaa cccaaggaca ccctcatgat ctcccggacc    600

cctgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg agccacgaag accctgaggt caagttcaac    660

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcataat gccaagacaa agccgcggga ggagcagtac    720

aacagcacgt accgtgtggt cagcgtcctc accgtcctgc accaggactg gctgaatggc    780

aaggagtaca agtgcaaggt ctccaacaaa gccctcccag cccccatcga gaaaaccatc    840

tccaaagcca aaggtcagcc ccgagaacca caggtgtaca ccctgccccc atcccgggat    900

gagctgacca agaaccaggt cagcctgacc tgcctggtca aaggcttcta tcccagcgac    960

atcgccgtgg agtgggagag caatgggcag ccggagaaca actacaagac cacgcctccc    1020

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctc tacagcaagc tcaccgtgga caagagcagg    1080

tggcagcagg ggaacgtctt ctcatgctcc gtgatgcatg aggctctgca caaccactac    1140

acgcagaaga gcctctccct gtctccgggt aaatga                              1176